蛋白质晶体结构解析专题培训课件

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气相扩散技术的悬滴法 此法是使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡， 使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和 的状态，最终析出晶体。
微量透析法 微量批处理法
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2.2衍射数据的收集
收集衍射数据通常是利用单波长的X射线光束照射在一定角 度范围内旋转的蛋白质晶体，同时记录晶体对X射线散射的强度。 这些强度可转换为结构测X射线晶体学测定蛋白质的三维结构,首先需要得到适合 于结构分析的蛋白质晶体，其需要满足两个条件:
(1)晶体内部结构要具有有序性，只能是单晶，不能是孪晶，因 为孪晶的两个晶体的衍射图样间的干涉和重叠而无法得到具有 结构本身特点的衍射图样。 (2)晶体要有一定的大小和形状，因为晶体衍射线的强度大体上 正比于晶体的体积，而反比于相对分子质量的大小。
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2.3.2分子置换法 不同的分子结构会导致不同的衍射图样，或者说衍射强度
的分布特点。换句话说，在分子排列以及分子结构上完全相同 或类似的晶体在衍射图样上也必然出现相同或类似的特征。 因此，假如有两个分子结构上相同或相似，但具有不同晶型的 晶体而其中一个晶体结构已经测定，那么根据上述原理从原则 上可以设法由已知晶体结构来推引出未知晶体结构或类似分子 在不同晶胞中的取向和位置，从而得到分子结构的初始模型。 解决这一类结构问题的方法称为分子置换法。
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这个过程可以分为两步： 旋转（rotation）和平移（translation）。 在旋转步骤中，将计算并决定已知蛋白与未知蛋白在空间上的 相对取向。在平移过程中，需要通过计算将已知蛋白结构平 移到与未知蛋白一致的位置。 其过程如图所示：
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2.3.3反常散射法 当入射的光子的能量足够高的时候，尤其是射线的波长接近
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2.3相位的测定
在晶体中一个不对称单元中有多个相同的蛋白质分子时，一 些有价值的分子之间堆积的信息可直接从结构振幅计算得出，而 不必要预先知道任何相位信息。 晶胞中分子堆积的这类基本信息对解决一些疑难的相位问题会有 很大的帮助，下面分别介绍获得相位信息的3种主要方法:
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2.3.1单对或多对同晶置换法 同晶置换法是由20世纪50年代发现的可以用于求解蛋白
1. 蛋白质结构解析技术
X射线晶体衍射 X射线晶体学可以通过测定蛋白质分子在晶体中 电子密度的空间分布，在一定分辨率下解析蛋 白质中所有原子的三维坐标。
核磁共振（NMR）核于磁均共一振稳技定术的不、需分要子获量得在生30物kD大以分下子的的生晶物体大,适分用
子溶液，并且能够提供生物大分子的动力学信息
除此之外，还要求X射线的发散度尽量小，这一点上同步辐射 同样优于阳极靶式的X衍射仪。X射线源出来的射线经过单色器滤 波片和准直器后，就可以得到单波长的X射线直线光束。
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有了准备好的蛋白质晶体和单波长的X射线直线光束，就可以记 录衍射数据了，数据收集方法主要有衍射仪法、回摆法、白光辐射法。
目前主要采用的是回摆法来记录衍射数据。回摆法的特点是可以 同时收集衍射空间的三维数据，因而同时记录更多的衍射数据，并缩 短收集衍射强度的时间。
质相位信息的方法。当蛋白质晶体中引入了适当的重原子后， 就造成该晶体衍射线强度的差别，从衍射强度的差别就可能 推导出相位信息。
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在蛋白质晶体中包含大约30％-50％的水，蛋白质大分子在 晶体中作有规则的周期排列，大分子之间存在不少通道，通常在 这些通道中填满着水分子或结晶母液中的其他溶剂分子。
因此，如果把蛋白质晶体浸泡在某种金属离子或含有重原 子的小分子的溶液中，重原子有可能通过这些通道进入蛋白质晶 体内，并置换晶胞中某些位置上的溶剂分子。这种置换一般不会 引起大分子结构以及整个晶体结构的明显变化，从而形成较好的 同晶置换体。
冷冻电子显微技术是近年来兴起的一种获得低分辨率（低于5 埃）蛋白质结构的方法，该方法最大的优点是适用于大型蛋白质 复合物（如病毒外壳、核糖体和类淀粉蛋白纤维）的结构测定。
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2. X射线晶体衍射法 测定蛋白质结构的基本过程
1.蛋白质结晶 2. 数据收集 3. 相位的测定 4. 相位的优化 5. 电子密度图的解释 6. 修正
一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好 坏直接涉及结果的精密。而一套好的衍射数据又与晶体的好坏、 X射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关。
目前通常采用的X射线源有两类，一类是阳极靶式包括封 闭管式和旋转阳极靶式，另一类是同步辐射X射线源。
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无论哪种形式，都要求X射线源的辐射密度尽量大，即单位面 积的光强大。对同一晶体来说，只要蛋白质对辐射有一定的耐受力 否则在收数据的过程中需要更换晶体，X射线源的强度越高，晶体 的衍射强度也就越大，数据的误差也就越小。各种X射线源的光强 大小关系是：X射线源封闭管的光强最弱,转靶X射线源的强度约为 封闭管的一倍，同步辐射光强约为封闭管的一倍。
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2.4相位的优化
从实验数据中得到了结构因子的振幅强度，然后通过各种方法 得到了结构因子的相位，有了振幅和相位就可以通过变化计算出电 子密度图。电子密度图是晶体结构分析的直接结果，它包含了结构 的全部信息。
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溶剂扁平化法是基于误差扰动产生的蛋白质“溶剂”区应该 到处都一样的原理。使用这个方法的关键是要找出蛋白质和“溶 剂”区的交界面，需要预先告知程序晶体的含水量，这样等相关 程序会自动抹平“溶剂”区。这一步骤可通过程序反复多次，直 到计算电子密度图的相位收敛为止。
原子的吸收限时，射线的入射光子会激发电子到激发态，这部分 受激电子跃迁回低能态时将释放光子，这部分荧光的相位比原来 的相位有所延迟，这种现象称为反常散射。
利用反常散射法解析蛋白质晶体结构，要求蛋白质分子中有 一个金属原子和波长可调的同步辐射加速器X射线源，结果基本 等同于完美的同晶置换法。此法在金属蛋白中广泛使用。
电镜技术
近年来电镜尤其是单颗粒冷冻电镜三维重构 技术的发展使得人们能够更方便地研究分子 量在 150 kD 以上的生物大分子，其分辨率 能够到达 3 Å~4 Å。
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专门存储蛋白质和核酸分子结构的蛋白质数据库中，接近90% 的蛋白质结构是用X射线晶体学的方法测定的。
大约9%的已知蛋白结构是通过核磁共振技术来测定的。该技 术还可用于测定蛋白质的二级结构。