实验二、细菌蛋白酶的发酵制备
实验二 霉菌产蛋白酶发酵培养基条件的确定
实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定
1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子）
培养基组成：
100ml：豆粕粉3g，饴糖0.5g，酵母膏0.1g，MgSO40.2g，KH2PO40.2g。
高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。
接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在28℃、250rpm的条件下培养14～16小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。
2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250ml三角瓶中装100ml培养基）
2.1培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方：
（1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一组）
（2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖；
（3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉；
（4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏；
（5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。
（6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。
2.2培养基灭菌
高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。
2.3接种
冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时，至发酵液颜色变深、澄清为止。
蛋白酶产生菌的分离
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定
许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
1 实验材料
1.1 实验样品
校园内土壤样品
1.2实验仪器与材料
牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法
1.称量
按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
2.溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
蛋白酶实验
实验（内容）题目：蛋白酶产生菌的筛选及培养的优化
院系生命科学技术学院
专业生物技术
年级2015级生物技术1班专升本
蛋白酶产生菌的选育及发酵培养条件的优化
一、实验目的
1、学习从土壤中分离蛋白酶产生菌。
2、握分离纯化的方法，分离获得并纯化蛋白酶产生菌。
3、握正交优化的方法和步骤。
二、实验原理
许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
三、实验器材
1、材料：土壤样品
2、试剂：牛肉膏蛋白胨培养基及平板、奶粉培养基及平板、45mL 无
菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3、仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
四、实验步骤
（一）配制所需培养基
1、牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2
2、奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，
3、牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，水 100ml，pH 7.2
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌
一、目的要求
1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料
1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH
2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容
(一) 培养基的配制
1．培养基的配制方法和步骤
1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制
A.富集培养基（液体）：
海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：
海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
作者刘艳芝指导教师张玲秀
（忻州师范学院生物系 1201班 034000）
摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃ 。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化
蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。
本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
1、材料及方法：
1.1 实验材料与仪器
实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
第三章酶的生产
LacZ
乳糖结构基因 LacY Laca
mRNA 乳糖
阻遏蛋白 （有活性）
阻遏蛋白 （无活性）
mRNAZ mRNAY mRNAa 基 因 表 达
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2.末端产物阻遏
由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验：
（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨 酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体 现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。
第一节 酶的生产菌种
一、生产菌种
1.细菌 芽孢杆菌（蜡状、枯草、地衣）、大肠杆菌
2.霉菌 黑曲霉、米曲霉、木酶
3.酵母菌 啤酒酵母、假丝酵母
4.放线菌 链霉菌
二、产酶菌种的要求
（1）不是致病菌及产生有毒物质或其他 生理活生物质的微生物，确保酶生产和 应用的安全。
（2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖 快，产酶量高，有利于缩短生周期
代谢产物
代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋 白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达
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3.分解代谢物阻遏
指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮 源）存在时，利用快的那种分解底物会阻 遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利 用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通 过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所 产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
实验十二 产蛋白酶菌株的筛选
整理版
17
整理版
9
（3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂 19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g， 溶于1000ml水中，二液等量混合。
（4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量 0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11 的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定 容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不 超过一周。
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3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株 取少量土样混于无菌水中，梯度稀释后涂 布到牛奶平板上，37 ℃培养30h左右观 察
建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株
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4 产蛋白酶菌株的观察与转接
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数 进行记录，选择蛋白水解圈最大的5个菌 株进行测量和记录菌落和透明圈得直径， 然后转接到肉汤琼脂斜面上，37 ℃培养 过夜。
U=K×A×N×5/10 K：由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪 氨酸质量，本实验K=200 N：稀释倍数 A：样品OD值与空白对照ＯＤ值之差 5/10：测定中吸取的滤液是全部滤液的 １/５，而酶反应时间为１０ｍｉｎ
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实验报告
１结果记录 ２思考题
（１）在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌 的比例如何？试结合采样地点进行分析。
实验三 蛋白酶的固态发酵及提取实验
实验 蛋白酶的固态发酵及提取实验
一、 实验目的和要求
1掌握蛋白酶固态发酵基本原理和工艺过程
2 熟悉和掌握蛋白酶提取的基本原理和工艺过程
3 了解影响固态发酵的发酵的各种因素及曲霉产酶特性
4 掌握蛋白酶的分析方法
二、 实验原理
固态发酵法作为一个古老的生物工艺早在几千年前已在食品和调味品上得到了应用。与液体发酵相比，固态发酵操作简易、工艺简单、能耗低、无废水废渣产生，不造成对环境的二次污染。因此，固态发酵法目前在生产有机酸、发酵食品、酶制剂及动植物弃物、垃圾的处理和利用等方面有着广泛的应用。本实验利用曲霉属菌种，通过固体发酵法生产蛋白酶并提取并制得粗酶制品。
三、 实验流程
四、 实验材料及仪器设备
菌种：米曲霉3042
种曲培养基：麸皮 6g ，豆粕 4g 水 10mL
固态发酵培养基：麸皮 10g, 豆粕 10g ， 水 20mL, 121℃灭菌30min 后冷却待用。 仪器与设备：恒温培养箱、灭菌锅、接种铲、超净工作台、紫外可见分光光度计(配石英比色杯)、离心机(10mL 、10000rpm)，水浴锅、移液枪、250mL 和500mL 三角瓶等。 试剂：磷酸盐缓冲溶液(pH=7.5)，5%三氯乙酸溶液、生理盐水、1.5%酪蛋白溶液
五、 实验过程
1 种曲制备：取250mL 三角瓶装入20g 固体培养基，121℃灭菌30min 后冷却待用。用接种环接种斜面种子，32℃静置培养48小时，可观察到培养基表面长满菌丝，制得种曲。中间每隔一定时间观察培养物的变化情况，并记录。
2 发酵：取500mL 三角瓶装入湿料（麸皮 10g, 豆粕 10g ， 水 20mL ），121℃灭菌30min 后冷却待用。用接种铲取适量种曲接种，振荡摇匀，30℃静置培养。培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散；每隔12小时检查一次，观察培养物的变化情况，记录，摇瓶。培养时间达到72小时后结束发酵。
蛋白酶产生菌的分离
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定
许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
1 实验材料
1.1 实验样品
校园内土壤样品
1.2实验仪器与材料
牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法
1.称量
按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
2.溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
发酵综合实验 实验报告
目录
摘要..................................... 错误!未定义书签。
1 引言 (4)
2材料与方法 ............................. 错误!未定义书签。
3 结果与讨论............................. 错误!未定义书签。
4 总结................................... 错误!未定义书签。
5 心得体会............................... 错误!未定义书签。参考文献................................. 错误!未定义书签。
蛋白酶的发酵工艺研究
摘要中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。本文对一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌（AS1.398）的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产酶的影响.通过摇瓶培养研究碳源浓度，不同接种量对蛋白酶产量的影响。利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。利用发酵罐培养观察时间对产酶的影响.结果表明:豆饼粉3。0g/100ml，玉米粉4.0g/100ml，麸皮粉2.5g/100ml，磷酸氢二钠0.4g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml,pH 7.2—7。4为最适宜培养基组分。并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。
关键词:中性蛋白酶; 枯草芽孢杆菌；摇瓶培养；发酵罐
The Fermentation Process Research of Protease Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation ，which can be used for leather hair removal，softening， animal blood protein hydrolysis， wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment。The fermentation conditions of a Bacillus Subtilis （AS1。398） which can produce neutral protease were studied in this paper。 Under the condition of different factors to examine the influence of enzyme production.This study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask。 Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing time’s effection on the production of enzymes. the results showed that soybean meal 3.0g/100ml， corn flour 4。0g/100ml,wheat bran powder 2.5g/100ml，disodium hydrogen phosphate 0.4g/100ml,potassium dihydrogen phosphate 0。03g/100ml， pH 7。2-7.4 was the most appropriate medium composition。 Enzyme production activity of Fermentation tanks culture was higher than shaking culture.
第三章酶的发酵生产
酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生
长的关系，可以把酶生物合成模式分为4
种类型：
同步合成型
延续合成型
• 中期合成型 滞后合成型。
同步合成型 ：
又称生长偶联型,
是指酶合成与细胞生 长同步进行，当细胞 生长进入对数期时， 酶也大量合成；当细 胞进入稳定期时,酶的 合成也停止。
大部分大组成型酶及部分诱导酶. mRNA不稳定,细胞进入生长平衡期后,新的mRNA 不再合成.
1、某些微生物因争夺生存环境或营养物，会产生抗 生素将其他种类的微生物杀死。 2、微生物会产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，将营 养物质水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡 萄糖 。 3、微生物细胞会通过合成或分解代谢生产它必需的 一些物质，包括氨基酸、核苷酸等。
微生物作为酶来源的优越性：
1）种类繁多（＞20万种） 2）易于人工控制，获得高产酶的菌种 3）微生物生长周期短，繁殖迅速，培养 方便，成本低 4）提高微生物产酶的途径多 5）培养条件简单，易于自动化，生产易 管理 6）微生物本身也容易改造
延续合成型：
酶的合成伴随着细胞
生长而开始，但在细 胞生长进入稳定期后,
酶的合成仍将延续较
长一段时间。
生物合成可受诱导物
诱导,一般不受分解代 谢物阻遏 mRNA相当稳定
中期合成型：
酶的合成在细胞生长
蛋白酶发酵培养基
蛋白酶的测定
2. 蛋白酶的发酵与酶活力测定
2.1 实验目的1）了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。2）了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
2.2 实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵培养，每隔3h取一次样，测量它的OD值，绘制产蛋白酶芽孢杆菌生长曲线。
蛋白酶在一定的温度与pH条件下水解酪素底物，产生含有酚基的氮基酸(如:酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力
2.3实验仪器与实验材料：
菌种：产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源：蛋白酶发酵液；
培养基及试剂：牛肉膏蛋白冻液体培养基；酪素培养基、蛋白酶活力检测试剂
仪器：紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、试剂瓶、接种针、玻璃棒、移液枪、10ml离心管28-32个、试管4支、PH计等。
2.4 实验流程：
第一天（2012年5月17日）
实验内容：种子培养液与发酵培养液制备
实验试剂：产蛋白酶芽孢杆菌菌种、种子培养液（不加琼脂的牛肉膏蛋白胨液体培养基）、发酵培养液（不加琼脂的酪素培养基，酪素减半，其余不变）、1mol/LNaOH、1mol/LHcl 实验器材：250ml锥形瓶3个、玻璃棒、接种环、100ml烧杯3个、胶头滴管1个、封口膜、标签、摇床、电子天平、PH计、10ml移液管、离心管13支等。
实验步骤：
1、按配方配制牛肉膏蛋白冻液体培养基100ml作为种子培养液，装入250ml锥形瓶中
2、按配方配制发酵培养液2份，各100ml装入250ml锥形瓶中（分别记为1号、2号）
细菌的发酵过程
细菌的发酵过程
一、引言
细菌是一类微生物，广泛存在于自然界的各个角落。它们具有较小
的体积和简单的细胞结构，但却能够实现多样的代谢途径，其中发酵
是一种重要的生物化学过程。本文将探讨细菌的发酵过程，包括其定义、分类、发酵代谢途径及应用等方面。
二、细菌的发酵定义
发酵是一种在缺氧条件下，有机物通过细菌代谢转化为产生能量和
代谢产物的过程。细菌利用有机物质作为能源来源，通过在细胞内部
发酵反应，产生能量和代谢产物。发酵过程中，细菌通过调节酶系统
和代谢路径，将有机物质分解为较简单的产物，释放出能量。
三、细菌的发酵分类
根据产物的种类和代谢途径的不同，细菌的发酵可分为多种类型。
以下为常见的几种细菌发酵分类：
1. 乳酸发酵：乳酸发酵是一种常见的细菌发酵类型，通常由乳酸菌
进行。在乳酸发酵过程中，细菌将碳水化合物转化为乳酸。
2. 酒精发酵：酒精发酵是一种经典的细菌发酵类型，常由酿酒酵母
进行。在酒精发酵过程中，细菌将碳水化合物转化为乙醇和二氧化碳。
3. 乳酸醇发酵：乳酸醇发酵是一种特殊的细菌发酵类型，常由某些嗜热菌进行。在乳酸醇发酵过程中，细菌将碳水化合物转化为乳酸、醇和二氧化碳。
4. 蛋白质发酵：蛋白质发酵是一种特殊的细菌发酵类型，常由某些硫酸盐还原菌进行。在蛋白质发酵过程中，细菌将蛋白质降解为氨基酸和硫酸盐。
四、细菌的发酵代谢途径
细菌的发酵代谢途径可以分为主要代谢和次要代谢两种类型。以下是几种常见的细菌发酵代谢途径：
1. 产能源的代谢途径：细菌可以利用糖类、有机酸和氨基酸等有机物质作为能源来源进行发酵，通过产生ATP等能量分子以维持细胞正常的生理活动。
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备
一、实验目的原理
了解气升式发酵罐的结构及特点，学会使用该类型的发酵罐培养微生物。本实验在5L 发酵罐中进行细菌培养。通过测定菌体浓度了解细菌的生长规律，通过测定蛋白酶活力了解产物生成，分析菌体生长与产物生成的关系。同时检测发酵过程中的溶氧、pH等。
二、材料与方法
1.实验用培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素5mg/L，pH7.4。
0.5mg/mL抗生素溶液：称取 0.05g 卡那霉素溶于 100ml 无菌水。小管分装后置-20℃冻存备用。
斜面培养基：配方同 LB 液体培养，调pH至7.4后添加琼脂15g/L。
三、实验过程
1.种子制备
250mL锥形瓶装培养基50mL，接种斜面菌种一环，于旋转摇床37℃培养12h 转速150-200转/分。
2.发酵前准
1).清洗。发酵罐培养前后进行清洗（空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙），外壁、底板、顶板擦干净。
2).连接。进行发酵之前要对发酵系统（蒸汽发生器管路、空气压缩系统、冷却系统、发酵流加系统及在线控制系统）进行调试。主要工作是检查通气与通水管道的连接正确与否、管道是否破损、空压机能否正常工作、在线控制系统能否正常工作。发酵罐中配置用于供给冷却水、循环水及排水的管子。空压机空气供给的配管。连接发酵罐、PH 控制器、DO 控制器等电源。注意不漏电和接错线。
3).试剂。配置培养基、酸碱平衡液、消泡剂等。
3.电极标定
3.1 pH 电极标定
pH 电极零点和斜率要在进行灭菌以前进行，电极在使用前先用蒸馏水清洗并检查电极信号有无故障，然后再进行标定。一般而言如果发酵液偏酸性我们用6.86 和4.00 的缓冲液，如果偏碱性则配制6.86 和9.18 的缓冲液。
蛋白酶的发酵及其活力的测定
蛋白酶的发酵及其活力的测定
实验设计方案
1、实验目的：
1.1、了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；
1.2、了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及其活力测定的方法
2、实验内容：
2.1蛋白酶的发酵
2.2 绘制试验菌的生长曲线
2.3蛋白酶活力的测定
3、实验原理：
将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵，30-32 ℃震荡培养48 h，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力。采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在680nm
波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
4、实验材料和用具：
菌种，产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源，蛋白酶发酵液；培养基及试剂，产蛋白酶发酵培养基；蛋白酶活力检测试剂；722S 分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪等。
5、实验步骤：
5.1 发酵将产蛋白酶芽孢杆菌接入含150 ml 液体发酵培养基的250 ml 三角瓶中，30-32 ℃摇瓶发酵，18 h 后进行酶活力测定。将以上发酵液按1：50 的比例加入新鲜培养基中继续发酵。按时间取出菌液3000r /min 离心3min 取上清液测酶活，沉淀物测生长曲线
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实验二、细菌蛋白酶的发酵制备
一、实验目的原理
了解气升式发酵罐的结构及特点，学会使用该类型的发酵罐培养微生物。本实验在5L 发酵罐中进行细菌培养。通过测定菌体浓度了解细菌的生长规律，通过测定蛋白酶活力了解产物生成，分析菌体生长与产物生成的关系。同时检测发酵过程中的溶氧、pH等。
二、材料与方法
1.实验用培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素5mg/L，pH7.4。
0.5mg/mL抗生素溶液：称取 0.05g 卡那霉素溶于 100ml 无菌水。小管分装后置-20℃冻存备用。
斜面培养基：配方同 LB 液体培养，调pH至7.4后添加琼脂15g/L。
三、实验过程
1.种子制备
250mL锥形瓶装培养基50mL，接种斜面菌种一环，于旋转摇床37℃培养12h 转速150-200转/分。
2.发酵前准
1).清洗。发酵罐培养前后进行清洗（空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙），外壁、底板、顶板擦干净。
2).连接。进行发酵之前要对发酵系统（蒸汽发生器管路、空气压缩系统、冷却系统、发酵流加系统及在线控制系统）进行调试。主要工作是检查通气与通水管道的连接正确与否、管道是否破损、空压机能否正常工作、在线控制系统能否正常工作。发酵罐中配置用于供给冷却水、循环水及排水的管子。空压机空气供给的配管。连接发酵罐、PH 控制器、DO 控制器等电源。注意不漏电和接错线。
3).试剂。配置培养基、酸碱平衡液、消泡剂等。
3.电极标定
3.1 pH 电极标定
pH 电极零点和斜率要在进行灭菌以前进行，电极在使用前先用蒸馏水清洗并检查电极信号有无故障，然后再进行标定。一般而言如果发酵液偏酸性我们用6.86 和4.00 的缓冲液，如果偏碱性则配制6.86 和9.18 的缓冲液。
点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“pH 电极”，弹出相应的pH 电极标定界面。先进行零点标定，以酸性为例，将pH 电极联好电极线用蒸馏水洗净后插入pH6.86 的标准液中，点击“零点值”，输入6.86，然后点击“开始”，待采样值完全稳定后点击“结束”。然后用蒸馏水清洗电极探测头后插入pH4.01 的标准液中，同样方法输入斜率值 4.01 来标定斜率。
接下来将PH 电极插在发酵罐上与培养基一起进行灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金属头包住，以免接触到水。实消后，冷却下来，连上电极线，接到灌上，这时PH 电极将信号传给控制系统并显示发酵罐内发酵液的PH 值。在发酵控制台上设定需要控制的PH，控制系统会通过流加酸碱控制PH。也可不控制PH，通过电极对发酵过程的PH 变化进行检测。
3.2 溶氧电极的标定
溶氧电极的零点要在灭菌以前标定，斜率必须在灭菌后接种前，当温度等各
项培养条件都满足发酵工艺的要求是进行标定。
标定方法类似于pH 电极的标定，点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“溶氧电极”，弹出相应的溶氧电极标定界面。灭菌前先标定零点，标定液一般为饱和的无水亚硫酸钠溶液，输入零点值为1%，点击“开始”，待采样稳定后结束。在发酵罐实消之后，把通气、搅拌转速、温度等参数调整到设定值，待各参数稳定满足发酵条件后，进入相应罐的溶氧电极标定画面，输入斜率值100%进行斜率标定。
使用时与PH 电极一样，将溶氧电极装入发酵罐与培养基一起进行实消灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金属头包住，以免接触到水。实消完成后，待冷却后，连接电极线，连接到发酵罐的控制系统。
4.实罐灭菌操作
4.1.准备
1）关紧发酵罐底阀，到入培养基，旋紧接种口。
注：氯离子对不锈钢会带来不可逆转的破坏，因此应避免用盐酸溶液调节培养基pH，如工艺上无法避免加盐酸，应控制盐酸溶液浓度不大于5%且在添加过程中不得直接接触不锈钢。
2）盖紧罐盖上各种盖帽（加酸、加碱、补料口等），旋紧罐盖压紧螺栓。
3）标定好pH、DO电极，将电极插入罐体并及时的锁紧螺母，将电极的金属头用纱布+牛皮纸包裹好。
4）关排气冷凝器进水阀，移去进出口的软管排尽冷凝水管中的水。
5）盖上灭菌罐罩，旋紧螺母。
4.2.培养基预热
1）准备工作
本发酵罐是原位灭菌，要预先启动蒸汽发生器，空气压缩机（亦可稍后启动）确认控制器中的温度控制设定为手动。
注：蒸汽发生器的使用方法
①每次使用之前必须先打开排污阀和蒸汽阀，放掉炉内残余的污水。
②排污后即可关闭排污阀。打开进水阀和电源开关，此时“低水位”灯亮并发出蜂鸣报警，水泵开始工作进行抽水（此时可打开水泵放气阀排除泵内多余空气），抽水结束后报警结束，“低水位”灯灭，蒸发器开始加热，“加热”灯亮。此时务必保证蒸汽阀处于关闭状态。压力表开始上升。
③加热结束后即可正常使用热蒸汽。
④每次使用完毕关闭电源后待压力降到1kg/cm2以下时，都要打开排污阀排出管道内污水。
2）开罐顶排气阀，开夹套排水阀排净夹套水，关闭其它阀门。
3）蒸汽进夹套：首先打开蒸汽发生器的蒸汽阀，缓缓开夹套蒸汽阀1让蒸汽进夹套(注意：此时有轻微爆破声属正常，如声音过响，则开阀的速度应减慢)。待排水口排出蒸汽时调节夹套排水阀，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。并注意夹套内压力不超过
0.2Mpa。当培养基预热至98℃时，即可进入下一步实罐灭菌操作。在培养基温度在80～90℃时可以适当的减慢升温速度，在本温度区域可以杀灭大部分的微生物。
4）蒸汽进取样阀：开出料阀，关紧罐底阀,开蒸汽阀3蒸汽进入取样阀内腔，当出料阀排尽冷凝水后应调节其开度，以有少量蒸汽排出即可。
4.3实罐灭菌