检测马西尼罗热病毒抗体的重组E蛋白-ELISA的建立
elisa的基本原理方法类型及应用
elisa的基本原理方法类型及应用酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种免疫学的诊断技术，属于发光免疫分析（ FIA）的一种，它能判断待测物质是否含有某种抗原或抗体。
ELISA 是由分子生物学家Peter Perlman在 1969 年发明的，它是由免疫学家和检验室专业人士经过不断改进和发展形成的一种常见的检测工具。
ELISA 试验有三个主要步骤：配制板（Prepare Plate）、抗体配体结合（Antibody-Antigen Binding）和检测（Dectection）。
首先在特定医学实验室中将待测抗原或抗体与其他分子结合在反应基片或其他特定容器上。
随后，将特异性的抗体结合该特定的抗原或其抗体，以形成特异性的蛋白质复合物；最后，将一种特定的发光抗体，经过特定的化学或物理反应，与试剂相结合，从而检测到这种抗原和其抗体。
ELISA 有两种基本类型：一种是检测抗原的ELISA，也被称为酶免疫吸附法（EIA）；另一种是检测抗体的ELISA，也被称为免疫印迹分析（IIA）。
酶免疫吸附法（EIA）的主要特点是反应的时间比较短，因此可以快速地检测特定抗原。
它的原理是将适当浓度的待测抗原与抗原试剂相结合，然后将相互作用的悬液加到对应的孔板上，再将对应的特异性抗体悬液加到孔板中，当抗体与抗原发生作用时，会形成一个抗体复合物，并产生一个抗原复合物；最后，将作用到抗原复合物上的特异性发光强度肽或其他发光物质，最终显示出抗原浓度水平，以便进行分析。
而免疫印迹法（IIA）的主要特点是可以对相对浓度较低的抗体进行检测，可以精确地评估特定的抗体水平。
原理是将含有特定酶质的试剂加到孔板上，然后将抗原悬液加入酶质中，将含有特定抗体的悬液加入酶质中，当与特定抗原结合时，形成抗体复合物，将特定发光抗体结合到抗原复合物上，从而检测特定抗体水平。
ELISA 应用非常广泛，在生物学、药物学、流行病学等一些领域中都有应用，并且能够检测出抗原和抗体的小量组分，能够准确的检测出抗原和抗体，从而更有效的同时体现出检测的准确性。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析生物样本中的特定蛋白质、抗体或其他分子。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂准备、样本处理、板涂覆、洗涤、标记物添加、洗涤、底物添加和测量等步骤。
二、实验前准备1. 准备所需试剂和材料，包括ELISA板、标准品、样本、缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等。
2. 检查仪器设备是否正常工作，如酶标仪、洗板机等。
3. 温度控制，确保实验室温度稳定在适宜的范围内。
三、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需要，配制适当的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三乙胺缓冲盐水）、BSA（牛血清蛋白）溶液等。
2. 标准品的稀释：根据实验要求，将标准品按照一系列浓度稀释，制备标准曲线。
四、样本处理1. 收集待测样本，如血清、尿液等。
2. 根据实验要求，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
五、板涂覆1. 取出ELISA板，将每个孔加入适量的涂层抗体或抗原，覆盖整个孔底。
2. 将板密封，放置在4℃的冰箱中，静置一夜或按照实验要求的时间。
六、洗涤1. 取出ELISA板，将涂层液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
七、标记物添加1. 向每个孔加入适量的标记物，与待测物相互作用。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，使标记物与待测物结合。
八、洗涤1. 取出ELISA板，将标记物液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
九、底物添加1. 向每个孔加入适量的底物液，使其与酶标记物反应。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，观察颜色的变化。
十、测量1. 使用酶标仪测量每个孔的吸光度值。
2. 根据实验设计和标准曲线，计算出待测样本中特定物质的浓度。
十一、数据分析与结果解释根据测量结果和标准曲线，进行数据分析和结果解释，得出实验结论。
一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒[发明专利]
![一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/d05236c3bd64783e08122bdf.png)
专利名称：一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒专利类型：发明专利
发明人：陈西钊,孙明,张丽,马永缨,迟立超,秦亚嫚申请号：CN201410690160.3
申请日：20141125
公开号：CN104498438A
公开日：
20150408
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒，本发明获得了分泌西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.8508，所得到的西尼罗病毒单克隆抗体具有灵敏度好、特异性强、效价高等优点，可用于鉴定待测病毒是否为西尼罗病毒，鉴定待测样本是否含有西尼罗病毒。
所述单克隆抗体可用于制备西尼罗病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。
申请人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司
地址：100094 北京市海淀区北清路68号院中区13号楼
国籍：CN
代理机构：北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司
代理人：曹治丽
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马疱疹病毒1型gG蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用
动物医学进展,021 ,42(4)=31-34Progress in Veterinary Medicine马疱疹病毒1型gG 蛋白间接ELISA 检测方法的建立及应用王旭蕾，胡 月，加尔肯，车传忠，刘建华，郑学功，王雪竹，冉多良*收稿日期：2020-05-07基金项目：新疆农业大学研究生科研创新项目(XJAUGR2018020)作者简介：王旭蕾(1993 — )，女，新疆库尔勒人，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防治工作。
*通讯作者(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052)摘 要：为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)的流行情况，需要建立一种检测抗体的间接ELISA 方法。
采用纯化后EHV-1 XJ2015株的g G 蛋白作为检测抗原，优化反应条件后建立检测EHV-1血清抗体的间接ELISA 方法，并对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验及商品化试剂盒的应用效果对比。
结果表明，该方法仅与EHV-1阳性血清发生反应，不与马疱疹病毒4型、马流感病毒和马动脉炎病毒阳性血清发生反应，血清稀释1 ：1 600后，仍可以检测到阳性，组内及组间变异系数均小于5% .与试剂盒进行检测结果比 较，符合率为93.35%。
建立了 EHV-1 g G 蛋白间接ELISA 检测方法，可为EHV-1的快速诊断、流行病学调查及防控工作提供技术支撑。
关键词：马疱疹病毒1型；gG 蛋白；间接ELISA ；抗体检测中图分类号：S852.652文献标识码：A 文章编号：007-5038(202 1 )0，1-003 1-01马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis , ER)是马属动物的发热性急性传染病的总称.引发该病的病原体主要是马疱疹病毒1型(EHV-1)和马疱疹病毒4型(EHV-4)[12]. EHV-1是一种引起马匹不同临床综合征的病原体，具有高度传染性，主要引起呼吸 系统和神经系统疾病的发生，母畜流产和新生儿死亡[34°近年来，新疆的马产业在不断地发展，据2014年一2017年新疆地区的调查显示，ER 在新疆广泛流行，严重制约着新疆养马业的发展. EHV-1引起的疾病发病率和病死率较高，但却没有针对EHV-1的血清学检测方法[511],对EHV-1的防控工作带来巨大的困难. gG 基因部分氨基酸的同源 性低可区分EHV-1和EHV-4[12-13]，由于两种病毒之间广泛的免疫交叉反应[14],在实验室常规检测 中，无法从血清学角度区分[1].目前国外已有商品化的EHV-1/4的ELISA 抗体分型试剂盒，但价格昂 贵,不适用于大量检测血清样本，而国内没有类似的试剂盒[1215].因此，需要建立一种价格低廉、快速、敏 感且能大量检测血清样本的EHV-1抗体的方法。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法
操作步骤如下： （1） 将特异性抗体与固相载体联结 形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质
（2） 加受检标本 保温反应 标本中的抗原与固相抗体结合 形成固相抗原抗体复合物 洗涤除去其他未结合物质
（3） 加酶标抗体 保温反应 固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关
ELISA 方法的基本原理和操作步骤
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1971 年 Engvall 和 Perlmann 发 表 了 酶 联 免 疫 吸 附 剂 测 定 （enzyme linked immunosorbent assay ELISA）用于 IgG 定量测定的文章 使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中 微量物质的测定方法 这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 并保持其免疫活性 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性 又保留酶的活性 在测定时
是为阳性反应
（六）应用亲和素和生物素的 ELISA 亲和素是一种糖蛋白 可由蛋清中提取 分子量 60kD 每个分子由 4 个亚基组成 可以和 4 个生物素分子亲密结合 现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin） 生物素（biotin）又称维生素 H 分子量 244.31 存在于蛋黄中 用化学方法制成的衍生物 生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化 的产物 亲和素与生物素的结合 虽不属免疫反应 但特异性强 亲和力大 两者一经结合就极为稳定 由于 1 个亲和素分子有 4 个生物素分子的结合位置
快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立
免疫层析试纸条由样品垫 、结合垫 、硝酸纤维 素膜及吸收垫 4个部分组成 。样品垫和结合垫用玻
璃纤维 ,吸收垫用吸水滤纸 。以浓度为 1. 38mg /mL 的兔抗 WNV NS1蛋白多克隆抗体在硝酸纤维素膜 上划线作为质控带 ; 以浓度为 0. 9mg /mL 的 WNV NS1蛋白在硝酸纤维素膜上划线作为检测带 ,参数 0. 1μL /mm 划线 ,指控带与检测带间距约为 7mm。 划线后 ,将硝酸纤维素膜置于 37℃培养箱中孵育 2h。将吸收垫 、样品垫及结合垫 、硝酸纤维素膜叠 加 ,组装成完整的层析条 , 然后切割层析条 , 宽度
关键词 西尼罗病毒 ;胶体金试纸条 ;免疫层析法 中图分类号 R181. 2
Establishm en t of the Rap id D etection of W est N ile V irus w ith Gold - imm unochroma tography W ang Yanfang1, 2 , J iang Baoqin2 , Xing Fubin2 , Yang Pengfei2 , Zhang L ip ing2 , Ping Ruijin2 , X ian Q ingjie1, 2 , Hu Kongxin2
检测马传贫病毒跨膜蛋白主要免疫决定区抗体间接ELISA诊断方法的建立
摘 要 ：本试验 以纯化的重组马传 贫病毒跨 膜蛋 白主要免疫 决定区蛋 白作 为诊 断抗 原建立 了间接
ＥＩ ＬＳ Ａ诊断方法， 确定其最佳工作条件为每孔包被重组抗原 ２ ｇ兔抗马 Ｉ ， ｇ Ｇ酶标抗体以 １： （（ 血清以 ４ ）） （， ） １： ０ ４ 倍稀释 ， 底物作用时间为 １ ｍ ｌ判定标准为 Ｐ Ｎ值大于 ２ 且 Ｏ ｆ ｉ； １ ｌ ／ ， Ｄ值大于 ｎ ． ２的血清为阳性 ， 否则判 为 阴性 。本 试验 所建 立的诊 断 方法 与琼扩 试验 以及 以琼扩 抗原 作 为 包被 抗原 的 Ｅ ＩＡ试验 进 行 了比较 ， ＬＳ 表 明该诊断方法敏感性更高。特异性和重复性试验表明该诊断方法具有良好 的特异性 和重复性。通过对 ４匹
（．ａｂｎ ｅ ｒ ａ ｅｅｒｈ ｎｔｕｅ ｆ Ａ Ｓ Ｈ ｒｉ １００ ， ｈ ａ２ ｈ ａｏａ ｒ ｎｍ ｌ ｅａｈ ｅｔｆ ａ ｉ Ｍｅｉ ｌ １ ｒｉＶ ｔ ｉ ｌ Ｒ ｓａｃ ｓｔｔｏＣ Ａ ， ａｂ ５ ０ １Ｃ ｉ ； ． ｅ ｂｒｔ ｙ ｉ ａ Ｄ ｐｒｎ ｎ ｏ Ｈ ｒ ｎ ｄ ａ Ｈ ｅｎ７ Ｉ ｉ ｎ ｎ Ｔ Ｌ ｏ Ａ ｂ ｃ Ｕ ｉ ｒｉ， ｒｉ １０ ０ ，ｈｎ） ｎｖ ｓｙ ｂｎ ５ ０ １ ｉ ｅ ｔＨａ Ｃ ａ
ｏ ｔ ＭＴ ｒｔｉ ｃａｅ ｇｔｅ ａ ｂｔ ｎｉｈ ｒｅ ｇ ｏｊｇｔ ｉ ｅｏｉａｅ ｓ１ ０ ， ｅ ｅａ ｒ １ ０ ｆｈ Ｔ Ｒｐｏ ｎ ｏｔ ｉ ２ ，ｈ ｂ ｉａ ｔ ｏｓ Ｇｃ ｎｕａｅ ｗｔ ｐ ｒｓ ｓ ： ０ ０ ｔ ｒ ｅ ： ｅ ｅ ｄｓ ｒ － Ｉ ｄ ｈ ｄ ｉ ４ ｈ ｓ ａ ４
０Ｄ ｖ ｌ ｅｏ ｅ ． ａ ｅｅ ｍｉ ｅ ｓ ｃ ｍｐ ｅ ｅ ｓ ｅｐ ｓｔ ｅ ｓａ ｄ ｒ ｏ ｅ ＥＬ Ｓ Ｔ ｅ ｉ Ｌ Ｓ Ｓｍｏ ｅ ｓ ｎ ｉ ｖ ａｕ ｖ ｒ ２ ｗ ｓｄ ｔｒ ｎ ｄ ａ ｏ ｒｈ ｎ ｉ ｏ ｉ ｖ ｔｎ ａ ｄ ｆｒｔ Ｉ Ａ． ｈ Ｅ Ｉ Ａ ｉ ０ ｖ ｉ ｈ ｒ ｅ ｓｔ ｅ ｉ
检测马白细胞介素-18双抗体夹心ELISA方法的建立
ＩＳ １０ ８ ３ 胞 与 分 子免 疫 学 杂 志 （ ｈｎＪＣ ｌＭｏ Ｉ ｍ ｎ１２ ０ ， ４＂ Ｓ Ｎ ０ ７— ７ ８细 Ｃ ｉ ｅ ｌｍ ｕ ｏ）０ ８ ２ ［ ｌ ４
・
论著 ・
文章 编号 ： ０ ７— ７ ８ ２ ０ ）４— ３４— ３ １０ ８ ３ （ ０ ８ ０ ０ ６ ０
毒表达的重组 马 ＩＮ ＾ Ｈ ｅＦ 一 和杆状病毒表达的重组 Ｆ一 ｙ（ ｙＩＮ ）
马 Ｉ一８ ｒ ｃ Ｉ．８ 由本 实 验 室 制 备 ；重 组 人 Ｉ－ Ｌ１ （ Ａ ＥＬ １ ）７均 ３ Ｌ１ ２
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疫学研究 提供 了方法 ， 为下一步 Ｅ Ｌ１ ＬＳ 也 Ｉ 一８Ｅ ＩＡ试剂 盒 的商
品化 开 发 Biblioteka 定 了坚 实 基 础 。 ｎｌｉ ｉ均购于 ＰＥ Ｃ ｙ ｔｎＫｔ ａｏ ＩＲ Ｅ公 司； Ｒ Ｈ Ｐ标记的链霉 亲和素和邻
苯二胺 （ Ｐ ） Ｏ Ｄ 均购于 Ｓ ｍ ｉ ａ公司；健康的和感染 ＥＡ ｇ ＩＶ的马血 清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所周建华研究员惠赠。
１２ 方 法 ．
［ 关键词］ 马白细胞介素一８ 单克 隆抗体 ；夹心 Ｅ ＩＡ １； ＬＳ ［ 中图分类号］ Ｒ ９ ．１ ３２ １ ［ 文献标 识码 ］ Ｂ
西尼罗河病毒病竞争ELISA检测方法的初步建立及应用
西尼罗河病毒病竞争ELISA检测方法的初步建立及应用常娓娓;王淑娟;吴晓东;刘华雷;赵永刚;王志亮【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2011(028)009【摘要】本研究用表达的西尼罗河病毒（WNV）囊膜蛋白E结构域Ⅲ蛋白作为包被抗原，单抗8F4A4作为竞争检测抗体，初步建立了能够对乙型脑炎病毒（JEV）和WNV进行鉴别诊断的竞争ELISA方法。
优化的最佳抗原包被浓度为530ng／mL，单抗的最佳稀释倍数为1：8000，待栓血清的最佳稀释倍数为1：10。
通过对56份阴性样品进行检测确定了该方法的临界值为30％，以此为判定标准对临床220份血清进行检测，结果均为阴性。
此方法的建立弥补了商品化试剂盒不能区分JEV和WNV感染的缺陷，为我国西尼罗河病毒病的流行病学调查提供了一种有效的抗体检测方法。
%A cELISA for detection of WNV antibody was established using purified WNV E protein domain IH as antigen coatingthe ELISA plate and monoclonal antibody 8F4A4 specific to WNV as competitive detection antibody.The results showed that the antigen coat concentration was 530 ng/mL, the best dilution of McAb 8F4A4 was 1：8000 and the best serum dilution was I：10.A total of 56 clinically confirmed negative control sera were tested by the cELISA.Through analysis, it was concluded that the cut-off value was 30%.A set of 220 clinical serum samples were tested by the cELISA and all werenegative.Contrast to the commercial kits, the method could differentiate the JEV and WNV antibody, providing an efficient antibody detectionmethod for the West Nile virus disease epidemiology investigation in our country.【总页数】4页(P31-34)【作者】常娓娓;王淑娟;吴晓东;刘华雷;赵永刚;王志亮【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛266032;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛266032【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.北美型猪繁殖与呼吸综合征竞争ELISA抗体检测方法的建立及初步应用 [J], 李宛生; 李敏华; 杨建伟; 田志军; 王倩; 冷超粮2.禽白血病病毒ELISA检测方法的建立与初步应用 [J], 曹利利; 董航; 郭衍冰; 姜旭; 姚新华; 苑淑贤; 邵洪泽; 宋建臣; 贾立军3.基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用 [J], 易华山;姚婷;高丽旭;张金阳;杨发挥;魏晓蓉;李前勇;谢远兵;赵瑶;马鲜平;李欢;夏宇;朱文青;刘倩如;陈思倩;曹慧贞4.西尼罗河病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用 [J], 吴江;林永涛;花群义;林彦星;贾鹏;黄超华;史卫军;曹琛福;曾少灵;孙洁;阮周曦5.蓝舌病病毒群特异性RT-LAMP检测方法的建立与初步应用 [J], 李占鸿;朱沛;宋子昂;李卓然;杨振兴;李华春;杨恒;廖德芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
ELIS操作流程
ELIS操作流程ELISA操作流程（一）、基本操作流程方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1. 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8. 加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS 显色，则410nm)处测OD值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
方法二间接法（用于检测未知抗体）1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8. 加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及间接ELISA方法的建立
构域 Ｉ ｌ ｌ （ Ｄｉ ｌ １ ） 基 因序 列 ， 构 建 了重 组 表 达 载 体 Ｐ Ｅ Ｔ － ２ ８ ａ － ＤＩ Ｉ Ｉ 。结 果 重 组 质 粒 转 化 Ｂ Ｌ ２ １宿 主 菌 后 诱 导 表 达 ， Ｓ Ｄ Ｓ － Ｐ ＡＧＥ分 析
表 明， 表达产物相对分 子量 １ ７ ｋ Ｄ， 以包 涵 体 形 式存 在 。 对 表 达 产 物 作 变性 和 复 性及 纯 化 处 理 ， Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ － ｂ ｌ ｏ ｔ 鉴定结果表 明， 纯
ａ ｎ ｄ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ！ 【 ｉ ｓ ｈ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｉ ｎ ｄ ｉ ｒ ｅ ｃ ｔ ＥＬＩ Ｓ Ａ
ＤＵ Ｄｏ ｎ ｇ — ｊ ｕ ， ＹＡＮＧ Ｓ ｏ ｎ ｇ — ｔ ａ ｏ 。 ， ＧＡＯ Ｙｕ — ｗｅ ｉ 。 ， ＸＩ Ａ Ｘｉ ａ ｎ — ｚ ｈ ｕ ， ＬＶ Ｚｈ ｅ ， ＨＵ Ｇｕ ｉ — ｘ ｕ ｅ
西 尼 罗河 病 毒 Ｅ蛋 白结 构 域 Ⅲ的原 核 表 达 及 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方 法 的 建 立
杜 东菊 ， 杨松 涛 ， 高玉伟 。 ， 夏 咸柱 ， 吕 拮 ， 胡桂 学
摘 要 ： 目 的 建 立 西 尼 罗 河 病 毒 （ Ｗｅ ｓ ｔ Ｎ ｉ ｌ ｅ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ ， ＷＮＶ） 抗 体 检 测 方 法 Байду номын сангаас方 法 人 工 合 成 了 ｗ ＮＶ ＮＹ９ ９株 Ｅ 蛋 白结
化产 物 可 被 ＷＮＶ 血 清 识别 。将 纯 化 重 组 蛋 白包 被 酶 标 板 ， 优 化 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ反应条件 ， 抗原最佳包被浓度为 ３ ． ７ ５Ⅱ ｇ ／ ｍＬ、 血
清最 佳 稀 释度 为 １：１ ６ ０ ０ 、 酶 标 二 抗 最 佳 稀 释 度 １： ６ ０ ０ ０ 、 阴阳血 清临界值 为 ０ ． １ ４ ８ 。特 异 性 、 敏 感 性及 重 复 性 试 验 结 果 表 明， 本方法特异性强 、 敏感性高、 重 复 性 良好 。结 论 本 研 究为 ｗ Ｎ Ｖ 感 染 的血 清 学诊 断提 供 了技 术储 备 。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+ ”、“-”号表示。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂1.试样制备：根据需要检测的目标抗原或抗体，采集样品（血清、唾液、尿液、细胞上清等），并根据需要进行样品的预处理，如离心、稀释等。
2.固相涂层：将需要检测的抗原或抗体溶液加入到酶标板中，使其吸附在固相（如微孔板）表面上。
通常使用抗体作为固定相，抗原溶液浓度应根据需求进行优化。
3.阻断和洗涤：用阻断液封闭剩余的非特异结合位点，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或干奶粉作为阻断液。
然后使用洗涤缓冲液洗涤酶标板中的溶液，以去除非特异结合物质和杂质。
4.标准品/对照液制备：准备一系列已知浓度的标准品（抗原或抗体），用于建立标准曲线并定量分析未知样品的浓度。
5.样品加入：向酶标板中加入待测样品，并进行搅拌和孵育，使待测样品中的抗原或抗体与固定在酶标板上的抗体结合。
6.异种抗体添加：加入与待测样品中抗原或抗体特异结合的酶标记二抗（如HRP标记的抗人抗体），并进行搅拌和孵育。
7.洗涤：使用洗涤缓冲液对孵育后的酶标板进行洗涤，去除未结合的二抗。
8.底物添加：加入底物溶液，使底物在酶催化下发生反应产生染色物质。
9.反应停止：加入停止溶液，终止底物的反应，并停止染色物质的生成。
10.读板：使用酶标仪测量染色物质的光密度，计算待测样品中抗原或抗体的浓度，并与标准曲线进行比较，确定样品中的抗原或抗体浓度。
1.酶标板：一般为96孔的微孔板，常用的材料有聚丙烯和聚碳酸酯。
2.抗原或抗体：根据试验需要，选择具有特异性的抗原或抗体。
3.阻断液：常用的阻断液包括牛血清白蛋白（BSA）和干奶粉。
4.洗涤缓冲液：用于洗涤酶标板，去除非特异结合物质和杂质。
一般为磷缓冲盐溶液。
5.标准品/对照液：一系列已知浓度的抗原或抗体，用于建立标准曲线，并作为浓度标准。
6.酶标记二抗：通常为与待测样品中抗原或抗体特异结合的HRP标记的抗人或抗兔抗体。
7. 底物溶液：一般使用TMB（Tetramethylbenzidine）作为底物，经过酶催化发生蓝色反应。
西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立
河南农业科学,2020,49(6):157-164Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2020.06.021收稿日期:2019-12-13基金项目:国家重点研发计划项目(2018YFC1602902);河南省科技攻关项目(192102110066)作者简介:司艳芳(1994-),女,河南郑州人,在读硕士研究生,研究方向:分子免疫学㊂E -mail:siyanfangzzu@ 通信作者:王选年(1969-),男,河南灵宝人,教授,博士,主要从事动物病理学与分子免疫学研究㊂E -mail:wangxuannian@岳㊀锋(1983-),男,河南滑县人,副教授,博士,主要从事动物免疫学研究㊂E -mail:yuefeng0116@西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立司艳芳1,2,李㊀鹏1,郭东光1,孙国鹏1,岳㊀锋1,王选年1(1.新乡学院生命科学技术学院,河南新乡453003;2.郑州大学生命科学技术学院,河南郑州450000)摘要:为建立一种特异㊁敏感㊁快速㊁准确的西马特罗(Cimaterol ,CIM )残留检测方法,成功合成其完全抗原并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立其免疫学检测方法㊂应用重氮化法偶联西马特罗与载体蛋白BSA ㊁OVA ,合成免疫抗原CIM -BSA 和检测抗原CIM -OVA ,并采用UV ㊁SDS -PAGE ㊁质谱3种方法进行完全抗原的鉴定㊂用CIM -BSA 免疫新西兰大白兔制备抗西马特罗多克隆抗体并建立间接竞争ELISA 检测方法㊂结果表明,成功合成了西马特罗完全抗原,具有合成抗原的分子特征;免疫新西兰大白兔后,成功制备了抗西马特罗多克隆抗体,其效价为1ʒ64000,对西马特罗的半数抑制质量浓度为4.26μg /L ,与特布他林㊁莱克多巴胺㊁沙丁胺醇㊁齐帕特罗等β2型受体激动剂药物无交叉反应㊂经过条件优化,建立了西马特罗间接竞争性ELISA 检测方法,其最低检测限为0.04μg /L ,在0.1~12.8μg /L 检测范围内,线性关系拟合度为R 2=0.9771,拟合曲线方程为y =-0.2469x +0.6623㊂检测猪尿和饲料样品,回收率分别为96.3%~103.9%和67.0%~105.0%㊂综上,成功建立了具有良好应用前景的西马特罗间接竞争ELISA 免疫学检测方法㊂关键词:西马特罗;重氮化法;完全抗原;间接竞争ELISA ;多克隆抗体;残留检测中图分类号:S859.84㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)06-0157-08Development of Cimaterol Polyclonal Antibody and Establishmentof Immunological Detection MethodSI Yanfang 1,2,LI Peng 1,GUO Dongguang 1,SUN Guopeng 1,YUE Feng 1,WANG Xuannian 1(1.School of Life Science,Xinxiang University,Xinxiang 453003,China;2.School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China)Abstract :In order to establish a specific,sensitive,fast,and accurate method for the detection of cimat-erol (CIM)residues,the artificial antigen was synthesized and polyclonal antibodies were prepared by im-munizing rabbits,and an immunological detection method was established.Immune antigen CIM-BSA anddetection antigen CIM-OVA were synthesized after CIM was coupled to carrier proteins BSA and OVA by diazotization method.The complete antigen was identified by UV,SDS-PAGE and mass spectrometry.NewZealand rabbits were immunized with CIM-BSA to prepare anti-CIM polyclonal antibodies,and a poly-clonal antibody-based indirect competitive immunoassay was established for cimaterol residual detection.The results showed that the CIM artificial antigen was successfully synthesized and possessed the molecu-lar characteristics of the complete antigen.After immunizing rabbits,anti-CIM polyclonal antibody was prepared.The titer of anti-CIM polyclonal antibody was 1ʒ64000,and IC 50value was 4.26μg /L.There was no cross reaction with β2agonist drugs such as terbutaline,ractopamine,salbutamol,zipaterol and so河南农业科学第49卷on.After optimizing the conditions,an indirect competitive ELISA detection method was established based on the polyclonal antibody of CIM.The lowest detection limit of this detection method was0.04μg/L. The immunoassay method had a linear dependence on the antigen concentration,with R2=0.9771for ci-materol concentration range of0.1 12.8μg/L.The fitting curve equation was y=-0.2469x+0.6623. The recovery rates of urine and feed samples with CIM were96.3% 103.9%and67.0% 105.0%.In summary,the CIM immunological detection method of indirect competitive ELISA was successfully estab-lished with good application prospects.Key words:Cimaterol;Diazotization;Complete antigen;Indirect competitive ELISA;Polyclonal anti-body;Residue detection㊀㊀西马特罗(Cimaterol,CIM)也称喜马特洛㊁塞曼特罗,为白色晶体结构,极性中等㊂西马特罗能影响生猪体内的物质代谢,促进腺苷酸环化酶的合成,减少脂肪的合成并促进其分解,增加肌肉中蛋白质含量[1]㊂其与盐酸克伦特罗㊁沙丁胺醇㊁莱克多巴胺等10余种物质类似,属于β2型肾上腺类受体激动剂,俗称为瘦肉精,在20世纪80年代,由美国科研人员发现[2]㊂近年来,许多不法饲养业受到利益驱动,在动物的饲粮或饮水中添加西马特罗,长期使用会造成西马特罗在动物组织内蓄积残留㊂人在摄食了瘦肉精高残留的动物组织,轻者会出现头疼目眩㊁恶心呕吐等不适症状,重者会引起食用者中毒,严重的甚至有生命危险[3]㊂自从世界上首次发生瘦肉精中毒事件,已累计有近万人中毒㊂食品安全控制中心为了达到控制西马特罗的目的,筛查工作通常分2个阶段进行:先进行免疫化学筛选,然后进行气相色谱-质谱(GC-MS)或液相色谱-质谱(LC-MS)进一步确认㊂这样可以精准鉴定样本中是否含有西马特罗等非法添加物,但上述仪器昂贵且操作复杂,对于大部分企业难以实现日常的监测[4]㊂β2型受体激动剂在动物生产中的广泛应用带来了一系列食品安全问题㊂随着食品安全法规越来越严格,开发快速㊁灵敏的方法来检测肉类㊁加工食品和乳制品中非法添加物的残留具有至关重要的意义[5]㊂目前,竞争ELISA测定法用于定量检测非法添加物,具有简单㊁快速㊁对大样本敏感㊁特异性好且成本低等优点,引起了极大关注㊂为此,应用西马特罗免疫抗原免疫兔子,制备多克隆抗体,旨在建立其快速检测方法,为β2型受体激动剂残留药物检测方法的建立提供依据㊂1㊀材料和方法1.1㊀主要试剂西马特罗及其他小分子标准品㊁牛血清白蛋白(BSA)㊁鸡卵清白蛋白(OVA)㊁弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂均购自Sigma-Aldrich公司;TMB单组分显色液及HRP标记羊抗兔IgG购自Solarbio公司;TEMED㊁十二烷基硫酸钠(SDS)㊁过硫酸铵等购自华美生物公司㊂1.2㊀主要仪器磁力搅拌器㊁紫外全波长扫描仪㊁分光光度计㊁酶标仪㊁恒温培养箱㊁培养摇床㊁蛋白电泳仪㊂1.3㊀主要溶液体系透析液:0.01mol/L㊁pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS);包被液:0.05mol/L㊁pH值为9.6的碳酸盐缓冲液(CBS);洗脱液(PBST):含0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲液(0.01mol/L㊁pH值为7.4);封闭液:含5%脱脂奶粉的PBST;终止液: 2mol/L H2SO4溶液㊂0.1mol/L浓盐酸溶液: 50mL蒸馏水中含450μL浓盐酸溶液,pH值为2;0.15mol/L NaNO2溶液:0.517g NaNO2溶于50mL蒸馏水;5%尿素:2.5g尿素溶于50mL蒸馏水;0.1mol/L硼酸缓冲液(含0.15mol/L NaCl):3.09g H3BO3,4.383g NaCl,溶于500mL 水中,pH值为8.6㊂1.4㊀免疫抗原的制备(1)将4mg西马特罗标准品溶于0.1mol/L浓盐酸溶液(pH值为2)中混匀,浓盐酸溶液需要提前放置冰上预冷30min㊂(2)向上述溶液匀速逐滴加入预冷的0.15mol/L的NaNO2溶液,在冰上避光操作,同时使用淀粉碘化钾试纸监控,直至试纸变成蓝紫色时停止加入㊂(3)避光低温低速搅拌4~4.5h㊂(4)用NaOH将溶液调至pH值为7.4,5%尿素水溶液中和过量的NaNO2,每次滴加均用淀粉淀化钾试纸检测,试纸由深蓝变为浅蓝,即停止,反应液低温保存备用㊂(5)称取17mg BSA粉末溶于1mL0.1mol/L硼酸缓冲液(pH值为8.6),将第4步所得混合液逐滴加入到BSA蛋白溶液中,放于4ħ避光低速搅拌24h㊂(6)将反应得到的亮黄色偶联产物收集在透析袋中(透析袋使用前在沸水中煮沸10min),在PBS中低温透析3d,每间隔8h换一次透析液[6-8]㊂851㊀第6期司艳芳等:西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立1.5㊀检测抗原的制备检测抗原采用的载体蛋白为OVA㊂西马特罗与OVA 的偶联方法与CIM -BSA 偶联方法一致㊂西马特罗的分子结构如图1所示,其完全抗原的制备流程如图2所示㊂图1㊀西马特罗的分子结构Fig.1㊀Molecular structure ofcimaterol图2㊀西马特罗完全抗原的制备流程Fig.2㊀Preparation process of cimaterol complete antigen1.6㊀抗原的表征与鉴定1.6.1㊀SDS -PAGE 鉴定完全抗原㊀SDS -PAGE 凝胶电泳分离胶和浓缩胶的含量与目的蛋白的分子质量有关[9]㊂本试验选用的载体蛋白BSA㊁OVA 的相对分子质量分别为66.4ku㊁42.3ku㊂目的蛋白分子质量在30~100ku,应使用的浓缩胶含量为5%,分离胶含量为10%,凝胶配制参照‘分子生物学实验“㊂浓缩胶电压选择120V,分离胶电压选择80V,凝胶厚度1.5mm,上样量为2μg,考马斯亮蓝染色3~4h 后,置脱色液中过夜脱色㊂偶联小分子的载体蛋白的完全抗原大于单纯的载体蛋白分子质量,迁移速率小㊂由此可以判断出载体蛋白上是否偶联有小分子,另外根据分子质量还可以初步计算完全抗原的偶联比㊂1.6.2㊀紫外全波长扫描法鉴定完全抗原㊀一般蛋白质的最大吸收峰在280nm 波长处,载体蛋白偶联小分子后,其最大吸收峰会发生偏移,或产生新的吸收峰㊂用紫外吸收法测定其蛋白质的浓度和特征峰,在波长200~500nm 范围内进行紫外扫描,根据吸收峰的变化判断是否偶联成功[10]㊂1.6.3㊀基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI -TOF -MS )和高分辨质谱(ESI -MS )法鉴定完全抗原㊀MALDI -TOF -MS 和ESI -MS 系统能精准地对完全抗原进行分子质量测量,采用MALDI -TOF -MS 和ESI -MS 质谱同时进行的策略,目的在于有效消除试验及测量过程中的误差,可以更加精确地计算西马特罗与载体蛋白的偶联比[11-12]㊂1.7㊀多克隆抗体的制备及ELISA 检测方法的建立1.7.1㊀动物免疫㊀取3月龄健康洁净级新西兰大白兔3只(购自郑州大学实验动物中心),首免用免疫原CIM -BSA 与弗氏完全佐剂充分乳化,免疫剂量为500μg /只,背部皮下多点注射;2免㊁3免均用弗氏不完全佐剂,每次免疫间隔14d [13]㊂3免后第10天耳缘静脉采血,测定血清效价,选择血清效价高且对西马特罗抑制作用强的兔子,分离其血清进行后续试验㊂1.7.2㊀多克隆抗体效价测定㊀多克隆抗体用间接ELISA 法检测效价㊂包被:以CIM -OVA 偶联物为包被原,用包被液稀释至2μg /mL,分别加入96孔ELISA 反应板,每孔加入50μL,4ħ包被过夜㊂封闭:弃去包被液,以PBST 连续洗板5次,最后一次间隔5min,于干净的吸水纸上轻拍至没有明显水珠,每孔加入200μL 5%脱脂奶粉-PBST 作为封闭液,37ħ条件下封闭1h㊂孵育一抗:用洗涤液PBST 洗板5次,拍干,以经封闭液稀释后的兔源多抗血清为一抗(稀释范围1ʒ1000~1ʒ128000),每孔加入50μL,37ħ条件下孵育30min,同时设置未免疫的血清为阴性对照㊂孵育二抗:用PBST 洗板5次,拍干,以HRP 标记羊抗兔IgG(1ʒ5000稀释)作为二抗,每孔加入50μL,37ħ条件下反应30min㊂终止及显色:用洗涤液PBST 连续洗板5次,拍干后每孔加入50μL TMB 显色液,室温避光951河南农业科学第49卷条件下反应10min,加入25μL 2mol /L 的H 2SO 4终止液终止显色㊂读数:用全波长的酶标仪在450nm 处测定吸光值[14-15]㊂1.8㊀间接竞争ELISA 检测方法的评估1.8.1㊀灵敏度测定㊀将上述ELISA 操作中的一抗换成最佳稀释度的抗体,加入不同质量浓度的西马特罗标准品溶液,其他操作相同㊂以添加标准品对包被抗原50%抑制浓度作为半数抑制浓度(IC 50)㊂西马特罗小分子竞争品的最适质量浓度的确定方法为:先选取10㊁100㊁1000㊁5000μg /L 作为添加西马特罗的质量浓度,初步确定西马特罗标准品对血清的半数抑制浓度,然后缩小范围建立标准曲线并精确计算半数抑制浓度[16-17]㊂1.8.2㊀特异性测定㊀将1.8.1方法中的西马特罗标准品溶液换成不同质量浓度的其他类型β2型受体激动剂标准品溶液㊂然后通过间接竞争ELISA 绘制出多克隆抗体对各小分子标准品的标准抑制曲线,求出各药物的半数抑制浓度,判断制备的多克隆抗体的特异性[18]㊂计算交叉反应率:交叉反应率(CR)=IC 50(CIM)/IC 50(竞争物)ˑ100%㊂1.8.3㊀最低检测限测定㊀根据统计学方法,使用最佳条件,按照间接竞争ELISA 检测方法对抑制品进行检测,记录其OD 值,抑制率99%时对应的小分子药物质量浓度为最低检测限,反映该检测方法的灵敏度[19]㊂1.8.4㊀亲和力测定㊀抗体与特异性抗原的亲和力越高,则灵敏度越高,即检出限越低㊂亲和力常数为最低检出量(灵敏度)的倒数,通常用K 表示,单位是升/摩尔(L /mol)[20]㊂1.8.5㊀回收率测定㊀分别用猪尿液和饲料进行样品的添加回收试验㊂所用的猪尿和饲料均取自新乡县养殖场,饲料按照国家标准‘饲料中16种β2型受体激动剂液相色谱-串联质谱法的测定“的规定,采用甲醇提取处理,并用稀释的方法消除样品基质效应,猪尿进行离心去除杂质[21]㊂参照间接竞争ELISA 方法,向预处理之后的阴性饲料样品和猪尿样品中分别添加0.5㊁1.0㊁10.0μg /L 的小分子标准品,同时设置阴性对照孔㊂按照上述间接竞争ELISA 最佳条件操作,重复试验3次,计算OD 450平均值和样品的含量㊂2㊀结果与分析2.1㊀完全抗原的鉴定2.1.1㊀SDS -PAGE 鉴定㊀载体蛋白偶联半抗原后会导致在SDS -PAGE 电泳中泳动速度变慢㊂SDS -PAGE 鉴定结果表明,BSA 和OVA 的泳动速度均大于CIM -BSA 和CIM -OVA(图3),证明西马特罗与BSA 和OVA 偶联成功㊂图3㊀CIM -BSA ㊁CIM -OVA 的SDS -PAGE 鉴定Fig.3㊀SDS-PAGE indentification of CIM-BSA ,CIM-OVA2.1.2㊀UV 鉴定㊀通常载体蛋白上偶联小分子后,其最大吸收峰会发生偏移,或产生新的吸收峰㊂如图4所示,分别扫描了缓冲溶液PBS㊁载体蛋白和载体蛋白-半抗原,用缓冲溶液校准去除基质的干扰,比较载体蛋白和偶联物的最大吸收峰波长的区别,明显出现了非同于载体蛋白在280nm 处的新吸收峰,可以基本判断人工完全抗原偶联成功㊂2.1.3㊀质谱鉴定㊀单个西马特罗的分子质量为219.28u,载体蛋白BSA 分子质量为66.4ku㊂通过质谱分子质量测定计算偶联比,测试品CIM -BSA 的分子质量为68156.9u,相比单独载体蛋白BSA 的分子质量增加了1756.9u,说明CIM -BSA 完全抗原偶联成功,经计算偶联比约为8ʒ1(图5A );同理,测试品CIM -OVA 的分子质量为44382.5u,与单独的载体蛋白OVA 的相对分子质量相比,增加的分子质量为2082.5u,约为单个西马特罗的分子质量的10倍,说明CIM -OVA完全抗原偶联成功,偶联比约为10ʒ1(图5B)㊂61㊀第6期司艳芳等:西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立图4㊀CIM -BSA ㊁CIM -OVA 紫外扫描鉴定Fig.4㊀UV scanning identification of CIM-BSA ,CIM-OVA图5㊀CIM -BSA ㊁CIM -OVA 质谱鉴定Fig.5㊀The mass spectrometry identification of CIM-BSA ,CIM-OVA2.2㊀多克隆抗体的效价测定将第3次免疫10~14d 后的兔血清倍比稀释后,间接ELISA 检测血清的效价(表1)㊂当450nm 波长处的吸光值是阴性孔的2.1倍时,记为阳性孔㊂阳性孔的最大稀释度是多克隆抗体的效价㊂经计算,制备的完全抗原免疫效果良好,抗体效价达到1ʒ64000㊂表1㊀免疫血清间接ELISA 效价测定Tab.1㊀The immunity serum titer measured by indirect ELISA项目Item血清稀释倍数Serum dilution1ʒ10001ʒ20001ʒ40001ʒ80001ʒ160001ʒ320001ʒ640001ʒ128000阴性对照NegativecontrolOD 450 1.7731.4131.3831.1621.1401.1401.0780.5980.0332.3㊀间接竞争ELISA 检测方法的评估2.3.1㊀灵敏度测定及标准曲线的建立㊀由添加西马特罗标准品的间接竞争ELISA 试验结果可知,抗西马特罗血清的半数抑制浓度在1~5μg /L㊂故选择小分子抑制品标准溶液质量浓度为0㊁0.1㊁0.2㊁0.4㊁0.8㊁1.6㊁3.2㊁6.4㊁12.8μg /L,对结果进行处理并建立标准曲线㊂如表2,无抑制品的对照孔OD 450值为1.222,其IC 50约为4.26μg /L㊂根据此检测方法建立标准曲线,y =-0.2469x +0.6623(图6)㊂曲线的拟合度为0.9771,说明测量中数值误差较小,曲线的拟合效果良好㊂表2㊀CIM 标准品间接竞争ELISA 检测结果Tab.2㊀The results of CIM standard solution measuredby indirect competitive ELISACIM 标准品质量浓度/(μg /L)CIM standard solutionOD 450B /B 0lgCIM 01.222 1.00-0.1 1.1610.95-1.000.20.9770.80-0.700.40.8900.73-0.390.80.8030.660.091.60.7690.630.203.20.6230.510.506.40.5700.470.8012.80.4880.401.10161河南农业科学第49卷图6㊀间接竞争ELISA 标准曲线的建立Fig.6㊀Standard curve established by indirectcompetition ELISA2.3.2㊀特异性测定㊀用于抗体交叉反应性研究的竞争物为其他β2型激动剂药物如盐酸克伦特罗(CL)㊁莱克多巴胺(RAC)㊁沙丁胺醇(SAL)㊁盐酸多巴胺(DH)㊁溴布特罗(BRO)㊁班布特罗(BAM)㊁齐帕特罗(ZIL)㊁特布他林(TBL)㊁达氟沙星(DAN)㊁泰乐菌素(TYL)㊂由表3可知,免疫血清与其他小分子药物的交叉反应率均小于0.01%,说明获得的多克隆抗体的特异性良好,可以用于西马特罗残留检测㊂表3㊀免疫血清与其他药物的交叉反应率Tab.3㊀Cross-reactivity rate between immunityserum and other drugs竞争品Competition solutionIC 50/(μg /L)CR /%DH >10000<0.01RAC >10000<0.01CL>10000<0.01SAL >10000<0.01BRO >10000<0.01BAM>10000<0.01ZIL>10000<0.01TBL>10000<0.01DAN >10000<0.01TYL>10000<0.012.3.3㊀最低检测限㊀根据标准曲线可知,该间接竞争ELISA 检测方法对西马特罗的最低检出限为0.04μg /L㊂2.3.4㊀亲和力常数㊀在本试验中影响亲和力常数最重要最关键的是完全抗原的质量㊂根据最低检测限计算,亲和力常数可达10-13L /mol㊂2.3.5㊀回收率㊀由表4可知,猪尿中西马特罗的回收率介于96.3%~103.9%,饲料中的回收率介于67.0%~105.0%㊂表4㊀添加样品回收试验结果Tab.4㊀The recovery results of addimg samples样品Sample type添加量/(μg /L)Adding concentration平均检测值/(μg /L)Average detection value回收率/%Recovery rate精密度/%Precision 猪尿Pig urine0.50.51101.014.81.00.9696.312.710.010.3103.98.2饲料Feed0.50.4590.0 2.31.00.6767.07.210.010.5105.06.63㊀结论与讨论与其他方法相比,间接竞争ELISA 检测方法具有灵敏度高㊁快速㊁简便的优势,为残留检测提供了重要手段㊂获得良好的抗体是建立该方法的必要条件,西马特罗由于自身分子质量较小,不具有免疫原性,必须将其连接到一些大分子蛋白质载体上成为完全抗原㊂完全抗原进入动物体内借助载体蛋白的T 细胞表位间接诱导B 细胞激活㊁分化㊁增殖,使其同时具备T 细胞表位和B 细胞表位,进而刺激B 淋巴细胞分化为浆细胞,产生针对半抗原小分子的特异性抗体㊂有研究证实,含有苯胺基的半抗原,在制备其完全抗原时,采用重氮化法获得的偶联效果最佳㊂职爱民等[22]利用重氮化法制备了西马特罗完全抗原,免疫小鼠获得多克隆抗体,该抗体对西马特罗的IC 50为86.9μg /L,这是国内首例有关西马特罗完全抗原的合成及免疫学分析方法的报道㊂相比之下,本研究利用多克隆抗体血清建立的检测西马特罗的间接竞争ELISA 方法的IC 50为4.26μg /L,在灵敏度方面,该方法具有明显优势㊂HAUGHEY 等[23]研制出能同时检测多种β2型激动剂的胶体金免疫层析试纸条,其对克伦特罗的灵敏度最高,检测线性范围为0.31~4.52μg /L,IC 50为1.18μg /L,最低检测限为0.14μg /L,但与沙丁胺醇㊁马布特罗㊁溴布特罗㊁氯丙那林㊁西马特罗等药物均有交叉㊂阴性猪尿的样品添加回收试验中,其回收率在83.6%~102.2%㊂本研究建立的检测西马特罗的间接竞争ELISA 方法,针对西马特罗残留进行特异性测定,与261㊀第6期司艳芳等:西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立其他药物无交叉反应,检测范围为0.1~12.8μg/L,在此范围内线性拟合关系良好㊂该方法的最低检测限为0.04μg/L,猪尿中西马特罗的回收率介于96.3%~103.9%,饲料中的回收率介于67.0%~ 105.0%㊂本研究在饲料样品中进行添加回收试验,增加了对该检测方法的实用性评价,且该检测方法不仅可以对西马特罗进行定量检测,还可对其进行定性检测㊂近年来,为了提高西马特罗检测精确度, ZHANG等[24]用磷光二氧化硅纳米颗粒标记西马特罗免疫层析试纸条,结果表明,其最低可检测到匹克级的痕量残留,具有简便㊁直观等优点㊂相比于本研究建立的间接竞争ELISA方法,试纸条的检测速度快,但假阳性率较高㊂综上,本研究利用获得的抗西马特罗多克隆抗体,建立了间接竞争ELISA方法,具有良好的特异性㊁灵敏性㊁准确性㊂参考文献:[1]㊀熊琳,萍阎,高雅琴,等.肉品生产中禁用药物西马特罗研究进展[J].食品安全质量检测学报,2017,8(1):290-295.XIONG L,PING Y,GAO Y Q,et al.Review of forbiddendrug cimaterol in meat production[J].Journal of FoodSafety&Quality Inspection,2017,8(1):290-295. 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非洲马瘟检测诊断及防控建议
综述与专论 | Summarize and reviews1432020.23·0 引言非洲马瘟（African Horse Sickness ，AHS ）是由非洲马瘟病毒（African Horse Sickness Virus ，AHSV ）引起的（该病毒为呼肠孤病毒科环状病毒属成员）马属动物的一种急性或亚急性虫媒传染病[1]。
该病通过库蠓等吸血昆虫叮咬传播，以发热、皮下水肿和病毒血症为主要临床症状，严重时伴有组织和脏器出血。
马属动物中马最易感，病死率可超过90%[2]。
世界动物卫生组织（OIE ）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[3]。
非洲马瘟是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》规定的一类动物传染病，禁止入境我国。
1 世界范围内流行与分布情况“非洲马瘟”因起源于非洲而得名，至今已有数百年历史，自20世纪，主要在撒哈拉以南的非洲南部地区呈地方性流行，后经北非传入中东，沙特阿拉伯、叙利亚、黎巴嫩、约旦、伊拉克、土耳其、也门、塞浦路斯、伊朗、阿富汗、巴基斯坦等国先后发生疫情。
1966—1989年，又传入欧洲的西班牙和葡萄牙。
2020年3月27日，泰国官方向世界动物卫生组织（OIE ）紧急通报，2月24日呵叻府农场发生1起非洲马瘟，涉及易感动物为341匹马，其中62匹发病、42匹死亡，这是该国首次发生非洲马瘟疫情[4]。
4月3日泰国官方向OIE 又通报了2起非洲马瘟疫情。
至8月5日，泰国国内已先后发生15起疫情，累计256匹马感染，228匹马死亡，病死率高达89%。
这是“非洲马瘟”疫情首次在东南亚地区暴发，迅速引发全球动物卫生领域和马属动物相关产业的高度关注。
9月2日，马来西亚登嘉楼州发生1起非洲马瘟（AHS ）疫情，涉及的易感动物共有5匹马，这是马来西亚首次发生非洲马瘟。
该国成为继今年3月发生非洲马瘟的泰国后，又一发生该疫情的亚洲国家。
我国从未发生过非洲马瘟疫情，2014年被世界动物卫生组织（OIE ）认可为非洲马瘟历史无疫国，但由于与泰国距离较近，且泰国、缅甸、老挝等国气候温暖潮湿，有利于库蠓滋生和疫病传播，与泰国、缅甸、老挝交界的云南地区也有着数量可观的滇马等马匹，非洲马瘟传入我国的可能性不容忽视。
上海地区几种动物血清中西尼罗河病毒抗体的调查
哺乳动物中 以 马 为 主，人 和 马 等 哺 乳 动 物 为 ＷＮＶ ０．３５且阴性对照的 ＯＤ 值＞０．８，试验方可成立。阻
的终末宿主，不会 再 把 病 毒 传 染 给 其 他 动 物。 到 目 断率（ＩＰ）值＝１００－〔ＯＤ 样 品／ＯＤ 阴 性 ×１００〕。结
前为止，我 国 尚 未 发 现 ＷＮＶ 的 病 例 。 〔２〕 据 报 道， 果判定：阻断率 （ＩＰ）值 ≥４０％ 判 定 为 阳 性，阻 断 率
２３．６８％，从而影响 ＷＮＶ 抗体的检测结果。所以实
验前必须检测马血清中是否含有乙型脑炎抗体。
从表２中可以看出马西尼罗抗体比较高的原因
可能有以 下 几 个：（１）我 们 血 清 样 品 采 集 于 蚊 虫 活
跃的夏末。（２）我 们 使 用 的 试 剂 盒 和 报 道 的 试 剂 盒
不一样，报道的 试 剂 盒 一 般 是 法 国ＩＤＶＥＴ，检 测 的
入５０μＬ 酶 标 抗 体，封 盖 后 置 于 湿 盒 内，室 温 孵 育 １ｈ；同上洗板，加入 ５０μＬ 底 物，轻 振 混 匀，室 温 反 应１５ｍｉｎ；每孔中加入 ５０μＬ 终止 液，测 定 ４５０ｎｍ ＯＤ 值。
流行期间 有 大 量 的 动 物 感 染，鸟 类 中 以 乌 鸦 为 主， １．３．２ 有效性及结果判定：当阳性对照的 ＯＤ 值＜
１７．９％ 和 ２３．３％ 。 本 次 西 尼 罗 河 病 毒 抗 体 调 查 的 数 据 和 分 析 为 制 定 科 学 、合 理 的 防 控 对 策 提 供 了
技术依据。
关 键 词 ：西 尼 罗 河 病 毒 ；抗 体 检 测 ；流 行 病 学 调 查 DOI:10.14170/31-1278/s.2014.06.015
参考文献
elisa法类型 -回复
elisa法类型-回复什么是elisa法？ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验室技术，用于检测血清中特定抗体或抗原的存在。
它借助酶的反应活性来实现检测过程，并且具有高度的敏感性和特异性。
ELISA法已经广泛应用于医学、生物学和环境科学等领域，被用于疾病诊断、研究和技术开发。
ELISA法的基本步骤：1. 试样制备：首先，需要从患者的血样、细胞培养液或其他生物样本中提取目标抗体或抗原。
2. 建立固相与标记物：其次，需要在实验板的孔中涂覆抗原或抗体，将其固定在板上。
然后，标记物（通常是酶）会与目标分子结合，形成固相与标记物的复合体。
3. 杂交：然后，将试样加入实验板的孔中，使试样中的目标分子与固相与标记物的复合体结合，形成新的复合体。
4. 洗涤：接下来，通过洗涤的步骤去除未结合的分子，以降低背景干扰的可能性。
5. 反应：然后，向板中加入底物，使酶与底物反应，产生颜色的变化。
反应的程度与目标分子的浓度正相关。
6. 读取结果：最后，使用光密度计读取实验板中各孔的吸光度，根据标准曲线或阈值来判断目标分子的存在与否。
ELISA法的类型：根据所检测的分子类型和目的的不同，ELISA法可分为多种类型。
以下是几种常见的ELISA法类型：1. 直接ELISA法：该方法使用已知的抗原或抗体与目标分子结合，然后使用酶标记物和底物进行检测。
优点是简单、快速，但灵敏度较低。
2. 间接ELISA法：该方法首先固定目标抗原，然后添加患者的血清，其中包含了抗体。
接着，添加与患者抗体结合的抗体标记物，最后使用底物进行检测。
这种方法能够放大信号，提高灵敏度。
3. 竞争ELISA法：该方法使用已知的抗原或抗体固定在实验板上，添加标记物的抗原或抗体与患者血清中的抗原或抗体竞争结合。
测定标记物与固相抗原或抗体相对浓度的变化。
4. 间接竞争ELISA法：与竞争ELISA法类似，但是使用了标记物的抗体与固定在实验板上的抗原竞争结合。
5. 逆转ELISA法：这种方法用于检测特定抗体的存在，与传统的ELISA 相反。
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农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(2):323~326*基金项目： 奥运科技 （2008） 行动计划专项 （No.2004BA904B06） 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.高级兽医师， 博士， 主要从事动物及动物产品的检验检疫研究。
Email ： ＜jiangyan@ ＞ 收稿日期：20060413 接受日期：2006712 ·研究论文· 检测马西尼罗热病毒抗体的重组 E 蛋白 ELISA 的建立 *姜 焱 1 **, 张常印 1 , 王凯民 1 , 张敬友 1 ,唐泰山 1 , 陈国强 1 , 张鹤晓 2(1.江苏出入境检验检疫局，南京 210001;2.北京出入境检验检疫局， 北京 100021) 摘要： 重组质粒pETE 转化大肠杆菌（ ）BL21(DE3)， 经1.0mmol/L IPTG 诱导， 外源基因以包涵体的形式获得高效表达。
通过 Western blot 检测证明表达产物具有良好的抗原性。
以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板， 建立了检 测西尼罗热病毒(WNV)抗体的间接 ELISA 方法。
结果表明， 抗原的最佳稀释度为8.6滋 g/mL ， 血清的最佳稀释度为1颐 100， 待检 血清阳性标准初步定为：＞2.1×的样品判为阳性。
用此方法检测了450份血清样品， 结果全为阴性。
关键词： 重组E 蛋白；马西尼罗热病毒抗体； 间接 ELISA 中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:10061304(2007)02032304Establishment of a Recombinant E Protein ELISA forDetecting the Antibody of EquineJIANG Yan 1 **,ZHANG Changyin 1 ,WANG Kaimin 1 ,ZHANG Jingyou 1,TANG Taishan 1 ,CHEN Guoqiang 1 ,ZHANG Hexiao2The recombinant pETE plasmid,which includes the gene fragment of the part region of Equine(WNV)'s E protein,was transformed intoBL21(DE3),and expressed in very high level as inclusion body after induced with1.0mmol/L IPTG.The indirect ELISA for detecting WNV E protein antibody was established after the antigenicity of the recombinant protein was proved by Western blot.The optional working circumstances for the ELISA (antigen concentration 8.6滋 g/mL;serum di lution 1颐 100)were tried out with chess titration.The tested serum of positive criterion of this ELISA was(the tested serum)/(the negative serum)>2.1.Four hurdred and fifty samples were detected by this method and the results werenegative.Equineantibody;recombinant E protein;indirect ELISA西尼罗病毒( ,WNV)是 1937 年 12月从非洲乌干达西尼罗地区 1 例发热女患者的血液 标本中首先分离的，并因此而得名(Smithburn .，1940)。
最初， 人们只认为它是非洲的一种地方病， 直 到 1957 年以色列发生 WNV 脑膜脑炎爆发后， 才真 正认识到该病毒的危害。
此后WNV 感染波及非洲、 欧洲、 中东、 西亚、 中亚、 大洋州和北美洲等广大地 区， 流行呈扩大趋势(Adernson.， 1999； Hubalek， 1999)。
马是易感动物，且感染的死亡率达 35%。
美国目前通过使用一些检测方法对鸟、蚊子、 人类等宿主进行定期监控，以达到预防的目的。
我国 至今尚未发现本病， 但具有感染和传播该病的环境，值得提高警惕， 防止该病毒从国外传入。
目前检测人的 WNV 方法有 RTPCR 、荧光 RTPCR 、 NASBA 、 中和试验、 ELISA 等，但检测马的 WNV 的方法至今未见报道。
因此迫切需要一种简 便、 迅速， 便于应用的诊断试剂盒， 以满足我国用于 临床样品的监控。
ELISA 方法具备快速、 高效、 特异 性强、灵敏度高等优点，可以同时检测多份血清样 品。
E 蛋白是 WNV 病毒粒子表面最重要的结构蛋 白， 其表面的抗原决定簇与保护性免疫、 血凝反应和 血清特异性、 膜融合、 病毒的毒力、 宿主范围、 组织嗜 性有关。
本实验利用 IPTG 对含有 E 蛋白抗原域的原核农 业 生 物 技 术 学 报 2007年表达载体 pETE进行诱导表达， 并利用 His·Bind R Purification Kit对表达产物进行了纯化， 同时， 通过 方阵滴定初步建立了检测 WNV抗体的间接 ELISA 方法， 并对临床样品进行了检测， 为试剂盒的标准化 和商品化奠定基础。
1材料和方法1.1 质粒、 宿主菌及血清重组质粒 pETE为自行构建， 通过 RTPCR方 法扩增马西尼罗病毒( ,WNV)的部分 E蛋白基因，经过测序证实该基因以完整的阅读框 正确的插入到 pET32a表达载体多克隆位点 R玉和 d芋位点中；大肠杆菌（ ） BL21为本室保存； 马的 WNV阳性血清和阴性血清 自行制备；待检血清由北京出入境检验检疫局和南 京农业大学提供。
1.2 试剂DAB显色试剂盒购自南京生工生物工程有限 公司；抗马的二抗为武汉博士德生物工程有限公司 产品；His·Bind R Purification Kit为 Novagen公司 产品， 其它试剂均为分析纯。
1.3IPTG 诱导表达按文献 （Sambrook， 1989） 进行诱导。
各取 出马的 MNV阳性血清和阴性血清 1mL,12000 r/min离心 30s,弃上清，沉淀重悬于 100滋 L1伊 SDSPAGE凝胶电泳上样缓冲液中， 100 ℃变性 3 min， 进行 SDSPAGE电泳。
1.4 表达产物的纯化按照 His·Bind R Purification Kit说明书进行。
1.5MNV 高免血清的制备按参考文献 （殷震和刘景华， 1997） 用 WNV的 灭活病毒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等量混 合， 制成油包水疫苗免疫 2kg以上的雄兔。
初免 10 d后，用弗氏不完全佐剂与 WNV的灭活病毒制成 油苗再免疫 3次， 最后一次免疫 7d后采血， 分离血 清， -20 ℃保存。
1.6 表达产物 Western blot 实验按文献 （Sambrook， 1989） 的方法进行。
1.7 间接 ELISA 检测方法的建立间接 ELISA方阵测定按文献（Smithburn, ., 1940） 的方法进行。
根据间接 ELISA方阵结果确定 抗原、抗体的最适稀释度，蛋白抗原稀释至 8.6滋 g/mL， 待检血清、 阳性血清和阴性血清作 1颐 100稀 释。
2结果 2.1pETE 载体的构建将 pET32a(+)、 RTPCR产物用 R玉和 d 芋消化的酶切产物回收、 连接、 转化、 提取质粒， 用 R玉和 d芋消化，经琼脂糖凝胶电泳可看到 318和 5900bp2条带， 与所设计的大小相符(图 1箭头所示)。
图 1.重组表达载体的酶切鉴定Fig.1.Identification of recombinant expression vector byrestriction enzyme digestion1and4,marker DL2000and marker Ⅳ;2and3,recombinant expression vectors digested by R玉and d芋.2.2 表达产物的 SDSPAGE重组质粒 pETE转化 BL21， 经 IPTG诱 导后， 获得高效表达。
如图 2显示， 在 32kD处出现 1条明显的蛋白条带， 大小与预期结果相符， 其它 3个对照均无该蛋白带。
图 2.表达蛋白的SDSPAGE分析Fig.2.SDSPAGE of protein expressed from recombinantplasmids in BL21(DE3)1,BL21(DE3);2,pET32a(+);3,pET32aE(uninduction);4,pET32aE (expressed products after4h induced by1mmol/L IPTG);5,proteinmarker.2.3 纯化后表达产物的 SDSPAG E用 6倍柱体积 1伊Elute Buffer洗脱目的蛋白。
取小量进行 SDSPAGE，结果在 32kD处出现 1条 清晰的特异性蛋白条带， 杂蛋白很少(图 3)， 表明表 达产物的纯化良好。
2.4Western blot 检测324第 2 期 姜 焱等: 检测马西尼罗热病毒抗体的重组 E 蛋白ELISA 的建立 表 1间接 ELISA 滴定结果Table 1The results of the indirect ELISA titration1~6,1颐 100； 1颐 200； 1颐 400； 1颐 800； 1颐 1600； 1颐 3200； 7~12,1颐 100； 1颐 200； 1颐 400； 1颐 800； 1颐 1600； 1颐3200,respectively. 对表达产物进行 Western blot 分析，结果与 WNV 特异性猪抗血清呈现阳性反应(图 4)，且无非 特异性条带出现， 证明表达产物抗原性较好。