中国药典-高效液相色谱讲义

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二极管阵列检测器 （diode array detector，DAD）
特点：在任一时间内，均可同时得到 物质在不同波长下的吸收情况，即三 维图谱
多组分混合物的三维图谱
流动相
反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末 端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合 时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液 的流动相
As内／Cs内 式中 Ax为供试品（或其杂质）峰面积或峰高； Cx为供试品（或其杂质）的浓度； As内为内标物质的峰面积或峰高；Cs内为内标物质的浓
度；
f为较正因子。
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（2）外标法：按各品种项下的规定，精密称（量
）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定 量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试 品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算 含量 含量（cX）=cR(AX/AR) 式中各符号意义同上。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法 测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或或自动 进样器进样为好。
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注意
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过 40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度 ，但不宜超过60℃
流动相的PH值应控制在2~8的。当PH大于8时，可使 载体硅胶溶解；当PH小于2时，与硅胶相连的化学键 合相易水解脱落。
当色谱系统中需使用PH值大于8的流动相时，应选用 耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面 覆盖度的键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂
在方法项下，强调要用高纯度的试剂和HPLC级的有机溶剂，色谱 用水的电导率和紫外吸收应低，并指出，流动相的组成对容量因 子的影响远大于温度的影响。本部分还讨论了梯度洗脱的应用、 检测器的线性动态范围（即检测器信号响应与被测成分量呈比例 的范围）、自动进样测定、外标法和内标法测定和系统适用性试 验。在通法中还有专门一节讨论系统适用性试验。
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分离度(R)
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
中国药典
高效液相色谱
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定义
高效液相色谱法
系采用高压输液泵将规定的流动相泵入 装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分 离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入柱内,各组 分在柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录和处理色 谱信号。
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一、对仪器的一般要求和色谱条件
所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符 合有关规定
仪器包括： 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
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色谱柱
反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶 等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳 定。
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二、系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通包括 理论板数 分离度 重复性 拖尾因子 分离度和重复性是尤为重要。
本节所附的固定相有：固定相A为硅胶颗粒，固定相B为表面化学 键合辛烷基硅烷的硅胶颗粒，固定相C为表面化学键合十八烷基 硅烷的硅胶颗粒。
除另有规定外，色谱分离是在恒定的室温下进行，光度检测器的 流通池体积以10ul为宜。对色谱条件的变更未作详细说明，但说 明了分析工作者改变色谱条件，应能得到与要求一致的结果。溶 剂和试剂的质量应适于液相色谱法的应用。
AR／CR 式中 As为内标物质的峰面积或峰高； AR为对照品的峰面积或峰高； Cs为内标物质的品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪 器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质 的峰面积或峰高，按下式计算含量：
Ax 含量（Cx）＝f·─────
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英国药典2000年版
附录ID 液相色谱法，简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下，说明要用对照溶液测试，以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量，进行重复进样以验证重 复性，必要时，还要检测理论板数。
除另有规定外，测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2，也可测定峰高。在应用梯度洗脱时，则测定峰面积。 在归一化项下，说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。
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无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰 或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另外有规定外，待 测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式 为：
2(tR2－tR1) R＝─────── 或
2(tR2－tR1) R＝──────────
W1＋W2
1.70（ W1，h/2＋W2,h/2）
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美国药典还讨论了多波长检测器，特别是二极管阵列多波长检测 器的特点，指出，二极管阵列检测器比固定波长检测器或可变波 长检测器的信噪比低，不适宜于低浓度化合物的分析。在讨论示 差折光检测器中，认为该检测器不如紫外光检测器灵敏，且受溶 剂组成、流速、温度变化的影响大，要得到满意的基线，需用参 比柱。
相邻两峰的分离度以半高宽和保留时间的公式计算，对称因子的 计算公式与中国药典中的拖尾因子公式相同，并列出了容量因子 计算公式和信噪比测定法。在与正文有关内容项下，建议流动相 要经脱气，脱气装置应不影响流动相的组成；
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正文规定的定量方法如果不是内标法，建议用固定体积的定量环 进样器；
色谱柱通常为不锈钢柱，其尺寸规定在正文中（长度和内径）； 正文中规定的固定相如以字母表示，即指本节所附的固定相，该 固定相的粒度在字母后的括号内写明，有时标明适用牌号，并不 等于别的牌号不能用。
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色谱柱
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积 、键合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等）以 及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离 效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在 15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应 选择孔径在30nm以上的填料。
普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10µm之间。粒径 更小（约2µm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约 2mm）。
当需使用PH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充 剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二 异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂
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检测器
最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器、其他常 见的检测器有荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器 、电化学检测器和质谱检测器等。
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检测器
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供 试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光 散射检测器响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关 系，故进行计算时，一般需经对数转换。
不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检 测器，所用流动相应符合紫外—可见分光光度法（附 录V A）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应 考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱 级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不 允许使用含不挥发盐组分的流动相。
美国药典第24版
通法中的高效液相色谱法，简要说明了本法的特点， 指出了本法用于大多数药物分析是以分配色谱法为基 础，可在30min内完成。叙述分仪器和方法两部分。在 仪器项下，详细分述了泵系统、进样器、柱、检测器 和数据收集装置。
关于检测器，重点讨论了常用的分光光度检测器。对 于配有单色器的可变波长检测器的波长准确度，应该 用该仪器制造厂提供的方法进行校正，如果观察到的 波长与正确的波长相差3nm以上，则提示需进行再校 正。
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色谱柱的理论板数(n)
用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色 谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效 能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内 标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下 规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成 分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下 同，但应取相同单位）和峰宽（W）或半高峰宽（ Wh/2）,按n＝16（tR/w）2或n=5.54(tR/Wh/2) 2计算色谱 柱的理论板数。
式中 t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。 当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）
均以峰宽（W）的计算结果为准。
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重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复 性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对 照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其 峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％ ；采用内标法时，通常配制相当于80％、100 ％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标 溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进 样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差 也应不大于2.0％。
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拖尾因子（T）
用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精 度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的 规定。拖尾因子计算公式为：
W0.05h T＝──────
2d1 式中 W0.05h为0.05峰高处的峰宽； d1为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。 峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确