气单胞菌初筛鉴定培养基的研究_刘彤

气单胞菌初筛鉴定培养基的研究

哈尔滨市道外区卫生防疫站(哈尔滨150026)　刘　彤　刁映红　张　波　张　萍　杨东霞　杨暑伏

提　要　气单胞菌是人和鱼、青蛙等冷血动物的重要致病菌。为提高对该菌的检测水平,研制出一种气单胞菌初筛鉴定琼脂(AP A),经213株临床分离的气单胞菌和81株相关菌的应用研究,结果表明气单胞菌在A PA培养基显现独特的生化反应模式,对气单胞菌鉴定的准确率达98.12%,与肠杆菌科、弧菌科中临床常见的细菌能做出属的鉴别。该培养基组成合理,性能特异稳定,结果容易判断,为气单胞菌的初步鉴定和快速检验提供了可靠的方法。

关键词　气单胞菌　初筛鉴定　培养基

气单胞菌在自然界分布广,主要存在河水、污水中及鱼、青蛙、蛇的体腔。随着细菌鉴定技术的进步,发现该菌可产生溶血素、细胞毒、坏死毒和肠毒素,是冷血动物及豚鼠、水貂的致病菌〔1～3〕,也是人败血症、脑膜炎等化脓性感染及腹泻、食物中毒的重要致病菌〔2～5〕。因此,快速、准确地对气单胞菌进行鉴定,对该菌所致临床感染的早期防治具有重要意义。目前,我国已建立了较系统的检验方法〔2〕,但尚无一种特异性强的初筛鉴定培养基,直接影响气单胞菌的检出率和延长了确认鉴定时间。为此,参照有关文献〔6〕,研制出气单胞菌初筛鉴定琼脂(A PA),经中国科学院微生物研究所做技术鉴定,辽宁省卫生防疫站等单位考核应用,一致认为该培养基对气单胞菌有特异的生化反应模式,与肠杆菌科、弧菌科的相关菌可做出属的鉴别。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株　气单胞菌213株,其他相关菌81株,均由腹泻粪便、脓汁、鱼及池水中分离。气单胞菌及相关菌标准菌株28株来自中国科学院微生物研究所。

1.1.2　培养基　SS琼脂、麦康开琼脂购自上海市卫生防疫站,数值鉴定系列生化由哈尔滨市卫生防疫站提供,T SI等生化试剂由单位制备。气单胞菌初筛鉴定琼脂(A PA):月示胨5g、酵母浸膏3g、蛋白胨9g、色氨酸1g、L-鸟氨酸5g、甘露醇1g、肌醇10g、硫代硫酸钠0.4g、柠檬酸铁铵0.5g、琼脂3g。以上成分混合,加蒸馏水1000ml,加热溶化,调整pH至6.7,加溴甲酚紫0.02g,分装小试管,每管4ml,胶塞封口,121℃高压灭菌12min,置4℃冰箱保存备用。

1.2　方法

1.2.1　接种　将收集的气单胞菌和相关菌,用营养琼脂纯化培养后,挑取典型菌落,接种A P A,37℃培养18～24h;临床标本用SS或麦康开分离,挑取可疑菌落接种A PA,培养18～24h。观察接种菌A PA表层、底层的颜色变化及动力、硫化氢,最后加K ov acs试剂,观察吲哚反应。

1.2.2　数值鉴定　按文献操作和判定结果〔7〕。

2　结果

2.1　A PA的特异反应　气单胞菌和相关菌的标准菌株接种

A PA,气单胞菌在AP A出现表层紫色(碱性)、底层黄色(酸性)、动力阳性、吲哚阳性、硫化氢阴性的生化反应模式,它与肠杆菌科、弧菌科中相关菌鉴别特征见表1。

表1　气单胞菌及相关菌的

标准菌株在APA培养基上的反应特征

菌种株数表层底层硫化氢动力吲哚嗜水气单胞菌7K A-++

肺炎克雷伯氏菌2A A---

小肠结肠炎耶尔森氏菌1K N---弗氏柠檬酸杆菌a2K A++-阴沟肠杆菌2N N-+-

大肠艾希氏菌3K K-++

粘质沙雷氏菌2N N-+-

普通变形菌a1R K+++

摩氏摩根氏菌1R K-++

猪霍乱沙门氏菌a1K K++-

类志贺邻单胞菌3K K-++霍乱弧菌2K K-++铜绿假单胞菌b1K K-+-

注:K:紫色,A:黄色,R:褐红色,N:淡紫到浅黄,+:阳性,-:阴性,a:硫化氢产生量大时,呈黑色,其反应易被掩盖,b:近原培养基颜色,动力在表面层观察,(下同)。

2.2　A P A的稳定性　各批培养基分别用嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠艾希氏菌、阴沟肠杆菌、普通变形菌测定对鸟氨酸、动力、硫化氢、吲哚、肌醇、甘露醇的反应。结果表明各批培养基反应性能稳定,4℃保存3个月无异常反应出现。

2.3　临床菌株鉴定　共实验和考核气单胞菌213株,符合气单胞菌反应模式的209株,符合率为98.12%。其中已确认鉴定的61株,符合气单胞菌反应模式的60株,占98.36%,另1株为鸟氨酸阳性的气单胞菌;由SS或麦康开初分离,挑取可疑菌落接种A P A,符合气单胞菌反应模式的152株,经数值鉴定为气单胞菌的149株,符合率97.37%。另3株(占2.63%)经鉴定为大肠艾希氏菌。气单胞菌与临床上常见的肠杆菌科中的11个菌属弧菌科的2个菌属及铜绿假单胞菌在AP A的反应结果见表2。

3　讨论

气单胞菌是弧菌科的一个属。该属含8个种〔8〕,即嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、杀鲑气单胞菌(无动力,含4个亚种)、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌、嗜泉气单胞菌和维罗那气单胞菌。近年,国外学者又提出了尺骨气单胞菌、简氏气单胞菌和异常嗜糖气单胞菌3个新种。其中以嗜水气单胞菌为优势菌,其次是温和气单胞菌,其他几个种少见。除维罗那气单胞菌为鸟氨酸阳性外,其他的种为鸟氨酸阴性、发酵甘露醇、不发酵肌醇。鉴于气单胞菌这种生化特征,参照文献〔6〕研制出气单胞菌初筛鉴定琼脂,观察该培养基表层和底层的颜色变化可以判定鸟氨酸、甘露醇、肌醇的反应。培养基中含有蛋白胨、色氨酸,可观察吲哚反应。含有月示胨、肉浸膏和指示系统的硫代硫酸钠、柠檬酸铁铵测定硫化氢。采取半固体琼脂观察细菌的

运动性。标准菌株测试结果表明气单胞菌在AP A的反应为表面紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性、吲哚阳性的反应模式。共检查气单胞菌213株,符合该反应模式209株,占98.12%,其中吲哚试验的阳性率为89.52%。另4株经鉴定3株为大肠艾希氏菌,1株为鸟氨酸阳性的气单胞菌,可见A PA 培养基对气单胞菌具有的鉴定作用。

表2　临床分离的气单胞菌及相关菌在APA培养基的反应结果

菌名株数(294)表层底层硫化氢动力吲哚注

嗜水气单胞菌58K A-++(54/58)其中1株反应不符,经鉴定(已知菌株)为鸟氨酸阳性气单胞菌

嗜水气单胞菌152K A-++(134/152)其中3株鉴定为大肠艾希氏菌

(APA初筛菌株)

温和气单胞菌2K A-++

简氏气单胞菌1K A-++

肺炎克雷伯氏菌3A A---

小肠结肠炎耶尔森氏菌1K N---37℃培养,动力阴性大肠艾希氏菌18K K-++

大肠艾希氏菌5K A-++

福氏志贺氏菌8K A---紫色仅出现在表面

宋内氏志贺氏菌1K N---

奇异变形菌3R K+++硫化氢量大时,均变黑彭氏变形菌1R K-++

斯氏普罗威登斯菌2R K-+-

摩氏摩根式菌1R K-++

粘质沙雷氏菌1N N-+-

居泉沙雷氏菌1K N-+-

鼠伤寒沙门氏菌2K K++-硫化氢量大时,均变黑乙型副伤寒沙门氏菌1K K++-硫化氢量大时,均变黑伤寒沙门氏菌1K A++-硫化氢量少

产气肠杆菌2K N-+-

成团肠杆菌4K A-++(3/4)

弗氏柠檬酸杆菌2K A++-硫化氢量大时,均变黑霍乱弧菌7K K-++

副溶血弧菌4K K-++生长不良

解藻酸弧菌1K K-++生长不良

河弧菌3K A-+-生长不良

类志贺邻单胞菌5K K-++

铜绿假单胞菌4K K-++其颜色近原培养基(非发酵菌)

注:(　)内分子指阳性数,分母为试验数。

A PA培养基对肠杆菌科常见的11个菌属17个种有明显的鉴别作用,仅有少部分大肠艾希氏菌、成团肠杆菌与气单胞菌反应一致,可通过氧化酶试验加以区别。伤寒沙门氏菌和弗氏柠檬酸杆菌、福氏志贺氏菌在AP A的表层、底层与气单胞菌一致,可通过硫化氢、吲哚、动力加以区别。福氏志贺氏菌在A PA表层的紫色很弱,仅出现在其表面。A PA培养基可鉴别、排除弧菌属中常见的菌霍乱弧菌。由于含盐量少,副溶血弧菌等的各项反应不够明显。对少见的河弧菌,其反应性与气单胞菌不易区别,可通过耐盐试验加以鉴别。该培养基可鉴别类志贺邻单胞菌,对铜绿假单胞菌等非发酵革兰氏阴性杆菌有鉴别作用,这类菌在AP A的表面和底层均呈紫色或淡紫色,其动力仅在表层可以观察到。肠杆菌科中的变形菌、沙门氏菌等由于产生大量硫化氢,整个培养基变为黑色,其表层、底层的颜色变化不易分清,而气单胞菌在A P A上一般不产生硫化氢,或在表层产生少量硫化氢,两者也很容易鉴别。

(本研究承蒙哈尔滨市卫生防疫站徐迪诚主任医师指导、中国科学院微生物研究所作技术鉴定,辽宁省卫生防疫站、哈铁中心医院、黑龙江省农场总局医院、哈尔滨市太平区卫生防疫站考核应用,在此一并致谢!)

参考文献

1.　Balous A.M anu al of Clinical M icrobiolog y(5th ed.)Americal Soci-

ety for M icrobiology.W as hington.D.C.1991:369