抗菌肽及基因表达体系研究进展
最新[农林牧渔]抗菌肽基因工程表达技术研究进展-药学医学精品资料
![最新[农林牧渔]抗菌肽基因工程表达技术研究进展-药学医学精品资料](https://img.taocdn.com/s3/m/2578c879fad6195f312ba6f1.png)
从生物体内直 接提取纯化
化学方法 人工合成
采用基因工 程技术进行 抗菌肽人工 表达
但是因为抗菌肽为生物体内诱导产生,含量较低, 从生物体内直接提取难度大、效率低、对技术和 成本的要求高,难以规模化生产,并且对于某些高 等生物或人类抗菌肽生产而言也不现实。随着多 肽及蛋白质化学结构的进一步阐明和多肽合成技 术的产生,人工合成具有生物活性的肽或肽段为抗 菌肽的研究提供了很大方便。
包涵体可完全溶于8 mol/L的尿素,三聚体 形式的hPAB-β可用Ni-NTA亲和色谱分离, 再用羟胺水解成独立的短肽。孙琦等(2008) 成功构建了串联表达rAlloferon-1的原核表 达系统,并在E.coliBL21DE3中成功表达,其 表达产物具有与合成的Alloferon-1和 Alloferon-1-EK相似的体外抗肿瘤细胞活性。
刘静等(2008)用果蝇CecropinA原始氨基酸序列基础上,利 用毕赤酵母菌偏好的密码子,反推出其基因的序列,根据需 要对其中部分密码子进行调整,并在毕赤达酵母中成功表 达,但表达量不高,有待进一步的研究。仇妍虹等(2009)将 重组家蝇抗菌肽Des-HF基因克隆入酵母表达载体pPICZαA,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下, 相对分子质量约5000 u的重组抗菌肽Des-HF获得表达。
诸多研究结果表明,由于抗菌肽分子较小,化 学合成的抗菌肽表现出与天然抗菌肽一致 的生物学活性,但化学合成的方法同样存在 成本较高的问题,限制了抗菌肽的推广应用。 现代基因工程技术的发展使借助基因工程 技术大规模制备抗菌肽成为可能。
2 抗菌肽的基因工程表达
进行抗菌肽研究的两种表达体系
review：抗菌肽及其基因工程表达研究概况
抗菌肽及其基因工程表达研究概况当前，细菌性感染和疾病呈上升趋势，细菌耐药性的形成是一个重要的原因。
由耐药性细菌，如耐药性结核杆菌、大肠杆菌和被称为“超级细菌”耐甲氧西林金葡菌( MRSA)[24]等对人和动物造成的危害日趋严重。
如何克服细菌的耐药性是当前的研究重点和热点。
科研工作者们正努力寻求新的抗菌策略，这些策略包括：合理应用抗生素；改造现有抗生素或研发新的抗生素；微生态制剂的研究与应用；噬菌体制剂研究与应用；中草药细菌耐药抑制剂研究与应用；抗菌肽研究与应用等。
其中抗菌肽研究与应用是最有前景的一个领域。
1. 抗菌肽的生物活性及作用机制1.1抗菌肽的抗细菌作用在APD数据库中有1158个抗细菌肽，至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。
抗菌肽的抗菌作用机理的研究比较多。
一是基于膜攻击作用的杀菌机制有一下几个模型[1，2]：（1）桶板模型(barrel-stave model)：带正电荷的含α-螺旋抗菌肽单体与细胞膜上带负电荷的磷脂分子相互吸引而结合在细胞膜表面，多个抗菌肽分子形成多聚体，扰乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排序，并以与膜表面垂直的排列方式将疏水基团插到磷脂双分子层，形成横跨细胞膜的离子通道，造成细胞质物质泄漏和电化学势丧失，细胞膜崩解而导致细胞死亡。
（2）地毯模型(carpet model)：以该机制杀菌的抗菌肽并不插入细胞膜内部，但在电荷作用下，一定浓度的抗菌肽像地毯样展开平行排列在细胞膜表面或形成颗物，利用疏水作用和分子张力作用改变细胞膜的表面张力，从而在细胞膜上出现暂时的孔洞，除了细胞液的相互渗透，抗菌肽还可通过此孔洞进入细胞。
（3）穿孔螺旋模型（toroidal-hole model）：抗菌肽分子的极性端与磷脂分子的极性端相对一起形成以螺旋状形式的连续翻转，从而导致膜的完整性破坏和功能丧失；（4）分子团聚集式(micellar aggregate)：抗菌肽分子以不规则形式聚集于膜表面，类似地毯式模型的作用形成跨膜电势差而导致膜损伤。
抗菌肽的基因工程表达研究进展
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌具有遗传背景清楚、培养周期短、目的
基因表达水平高、带有易于纯化的标签蛋白等,所 以大肠杆菌成为最早被应用于表达抗菌肽的表达 系统。
常用的载体系统：pGEx载体系统、pET载体系统、 pTixFus载体系统、pMAL载体系统及IMPACT系 统。
赵冬梅(2013)在E. coliBL21中重组表达斑 点叉尾鮰的hepcidin抗菌肽基因,成功构建 了pET32a-pCH 和 pET32a-mCH 两个重组
抗菌肽的来源
抗菌肽可通过 以下3种途径 获得
从生物体内直 接提取纯化
化学方法 人工合成
基因工程进 行抗菌肽人 工表达
抗菌肽的基因工程表达
进行抗菌肽研究的两种表达体系
原核表达体系 中大肠杆菌表 达体系最具代 表性
真核表达体系有小球藻 表达体系、杆状病毒介 导的昆虫表达系统、 酵母表达体系,其中酵 母表达体系用的最多, 是真核表达体系的代表
抗细菌、 Apodaecin杀革兰氏阴性菌 真菌活性 ，Drosomycin杀真菌；
抗病毒 α-防御素结合疱疹病毒， 活性 Melitiins抑制HIV的复制；
抗肿瘤 Magainins溶解造血肿瘤细胞， 活性 Temporin L诱导肿瘤细胞坏死；
免疫系 Defensins可以增强细胞的趋化 统调节 性以及细胞因子的产生。
③过量表达可能导致非生理反应;
④包涵体形式表达的目的蛋白难以纯化; ⑤翻译后加工修饰体系不完善; ⑥表达产物的生物活性较低。
酵母菌表达体系
酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制
及对表达产物的加工修饰和分泌能力,并且不会产 生内毒素,是基因工程中良好的真核基因受体菌。
抗菌肽Cecropin-X的表达纯化及其性质研究的开题报告
抗菌肽Cecropin-X的表达纯化及其性质研究的开题报告一、课题背景及研究意义抗菌肽是一类广泛存在于动植物体内的小分子肽链，具有广谱的抗菌作用，对于缓解细菌感染等疾病具有重要的临床应用价值。
其中，Cecropin-X是一种来源于蚕的抗菌肽，分子量较小，具有较好的渗透性和稳定性。
而抗菌肽的研究主要包括表达、纯化及其生物活性研究等方面，因此，该课题的研究，对于深入了解抗菌肽的性质和生物学功能，具有很高的研究意义。
二、研究内容和研究方法（一）研究内容本课题旨在通过基因工程技术表达Cecropin-X，并利用各种生化方法对其进行纯化和鉴定，同时研究其生物学活性和对细菌的抗菌作用。
（二）研究方法1.基因工程技术表达Cecropin-X：在基因序列的设计中，首先考虑到大肠杆菌感受子的选择以及其与载体的兼容性，然后利用PCR扩增出优化的Cecropin-X基因，将其进行重组并转化至大肠杆菌中。
构建后的质粒进行DNA测序和酶切分析，以确保正确性和稳定性。
2.蛋白表达和纯化：利用预期的基因表达系统和蛋白纯化方法，将基因表达后的蛋白进行分离纯化。
采用酸性洗脱剂的亲和层析柱作为首选纯化工具。
经过纯化后，对纯化的蛋白进行可见光谱图和CD光谱图的分析。
3.抗菌活性测试：利用差减显色法和MIC测定法对Cecropin-X蛋白的抗菌活性进行分析。
利用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为检测菌株，观察Cecropin-X的抗菌作用。
三、预期成果和研究价值（一）预期成果1.成功地表达和纯化Cecropin-X，得到高纯度的Cecropin-X蛋白；2.对Cecropin-X蛋白的抗菌活性进行评价，并确定其最小抑菌浓度；3.对Cecropin-X蛋白的光谱图和CD光谱进行分析，阐明其分子结构和性质。
（二）研究价值本课题对于研究抗菌肽的生物学特性和应用价值具有重要的意义，同时有助于提升我国在生命科学领域的国际地位和世界影响力，同时拓宽抗菌肽的研究思路，为其在医药领域的应用奠定基础。
抗菌肽在饲用枯草芽孢杆菌中表达的研究进展
抗菌肽在饲用枯草芽孢杆菌中表达的研究进展李连彬;陈秀丽【摘要】抗菌肽（AMPs）是存在于生物体中的一类阳离子短肽，具有天然的抗菌活性。
在畜牧业中，抗菌肽可作为新型安全、环保的饲料添加剂。
但是天然来源的抗菌肽资源有限，化学合成抗菌肽成本较高，通过这两种方法无法获得大量的抗菌肽。
目前通过基因重组的方法来获得抗菌肽是较为经济的方法。
枯草芽孢杆菌是一种广泛应用于畜牧业生产的革兰氏阳性菌。
随着现代生物学技术的发展，利用枯草芽孢杆菌表达系统生产抗菌肽成为当前热点研究领域。
文章主要对抗菌肽在枯草芽孢杆菌中的融合表达进行了简要综述，以期为开发饲用型抗菌制剂提供参考。
%Due to their natural antibacterial activity,antimicrobial peptides (AMPs)can be used as a novel safe,envi-ronmentally friendly feed additive in animal husbandry.However,natural resources of AMPs are limited and hard to be pu-rified.Chemical synthesis is also high-cost and unstable way,so recombinant expression of AMPs is a cost-effective way. Bacillus subtilis is a gram-positive bacterium and has been applied wildly in animal husbandry.With the development of modern biotechnology,the Bacillus subtilis expression system for the production of antimicrobial peptides has become an attractive research area.The expression of the antimicrobial peptides in Bacillus subtilis was reviewed,so as to provide a reference for the development of forage antibacterial agents.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2015(000)020【总页数】4页(P11-13,17)【关键词】抗菌肽;基因重组;枯草芽孢杆菌【作者】李连彬;陈秀丽【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100;陕西省汉中市动物疾病预防控制中心，陕西汉中 723100【正文语种】中文【中图分类】S816.7由于抗生素药物的滥用，出现了越来越多的抗生素耐药菌株，传统抗生素替代药物的开发已成为目前研究热点。
抗菌肽基因的克隆及其表达
正常及经indolicidin处理后的铜绿假单胞菌
Models of membrane permeation of AMPs
AMPs的应用 — “绿色革命”
抗菌肽nisin：来自乳酸菌，已在 50多个国家注册用作食品保藏剂
医疗保健
Daptomycin：2003 年获准上市，用于治 疗由革兰阳性菌引起 皮肤及皮肤组织感染 MSI-78：爪蟾抗菌 肽的类似物，治疗糖 尿病患者的足溃疡感 染，Ⅲ期临床试验 MBI-226：防治中 央静脉插管部位感染， Ⅲ期临床试验
AMPs的结构及活性
一类广泛存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞、 调节免疫反应的小分子多肽，是生物体天然防御系统中的重要效应因子 结构：是具有双亲性的阳离子多肽
hydrophilic residues hydrophobic residues
活性：不仅能够对抗多种病原微生物， 如细菌、真菌、原虫、病毒等，还可抑 杀肿瘤，调节机体免疫反应
抗菌肽基因的克隆及其表达
导 师：王凤山 教 授 学 生：李 娜
Contents
1 2
研究背景 课题目的及意义
3
4 5
研究内容及技术路线
课题创新性及预期成果 时间安排及已开展的工作
抗生素时代
(1941~2000)
传统抗生素（antibiotics）
医疗保健 —— 防治感染性疾病
畜牧业及水产养殖业 —— 防治动植物病虫害，促进生长
食品卫生
APPLICATION
饲料添加剂
柞蚕抗菌肽酵母制剂： 2004年获农业 部批准在广东、山东及海南生产使用， 用于畜禽及对虾消化道疾病的防治
研究目的及意义
研究内容及技术路线
抗菌肽的抗菌机制及其在反刍动物中应用的研究进展
抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs ）因其独特的抗细菌、真菌、病毒以及抗癌细胞等生物学功能且不易产生耐药性，使其成为最有前景的抗生素替代品之一。
从20世纪80年代瑞典科学家Hulmark 从惜古比天蚕（Hyalophora cecropia ）中分离出第一种抗菌肽，命名为天蚕素（Cecropin ）[1]，到目前为止抗菌肽数据库中已注册的抗菌肽序列已经超过3000个[2]。
抗菌肽是包括植物、动物和人类在内的所有生物体天然免疫反应的保守部分,是许多脊椎动物免疫系统的主要组成部分[3]，被定义为能够保护宿主免受细菌、病毒或真菌入侵的关键防御分子[4]。
抗菌肽是由基因编码、核糖体合成的多肽，通常具有短肽（30~60个氨基酸）、强阳离子（pI 8.9~10.7）、热稳定性（100℃,15min ）、不易产生耐药性、对真核细胞无影响等共同特征[5]。
根据其来源可以分为：植物源抗菌肽，如硫素（thionins ）、植物防御素(plant defensins)；动物源抗菌肽，如天蚕素、防御素；微抗菌肽的抗菌机制及其在反刍动物中应用的研究进展■纵瑞1胡忠泽1*张乃锋2段心明3(1.安徽科技学院动物科学学院，动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽滁州233100；2.中国农业科学院饲料研究所，北京100081；3.农发苑（浙江）农业发展有限公司，浙江湖州313000)作者简介：纵瑞，硕士，研究方向为动物营养与饲料科学。
通讯作者：胡忠泽，教授。
收稿日期：2021-03-25基金项目：国家自然科学基金[31872385]；安徽省高校协同创新项目[GXXT-2019-035]；安徽省现代牛羊产业技术体系[AHCYTX-7]；滁州市科技计划项目[2019ZN003]摘要：抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs ）是自然界中广泛存在的多肽物质。
作为机体先天免疫的关键组成部分，具有抗细菌、真菌、肿瘤、病毒等生物学功能。
抗菌肽基因表达系统的研究进展
抗菌肽基因表达系统的研究进展唐勇【摘要】抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的小分子肽,具有天然的抗菌活性.目前,基因重组的方法是获得大量抗菌肽最经济的方法.本文就抗菌肽基因表达系统作一综述,包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统等.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2013(000)006【总页数】3页(P7-9)【关键词】抗菌肽;基因表达;大肠杆菌;毕赤酵母【作者】唐勇【作者单位】乐山职业技术学院【正文语种】中文【中图分类】S816.7抗菌肽（AP）是生物细胞特定基因编码产生的一类具有抑菌或杀菌功能的小分子多肽，其广泛存在于自然界生物体内，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。
抗菌肽具有相对分子质量小、热稳定、杀菌范围广、作用机制独特等特点。
另外，抗菌肽还具有抗肿瘤活性，且对正常哺乳细胞毒性小。
目前，可通过基因工程的方法大量获得抗菌肽，这使得抗菌肽的深入研究和广泛应用成为可能。
1 抗菌肽的合成方式抗菌肽可以通过以下三种方法获得：（1）用生物化学方法直接分离抗菌肽。
通过人工诱导内源性抗菌肽的表达，一般是注射抗原后通过获得组织匀浆，再进行分离纯化和活性研究（Hara和Yamakawa，1995）。
但分离提纯过程繁琐，且不同的试验条件对于组分的纯度影响很大。
天然存在的抗菌肽产量很低，无法从动植物体内大量提取。
（2）化学方法可合成抗菌肽，但价格较昂贵。
（3）利用基因工程技术生产抗菌肽。
目前，基因重组表达的方法是获得大量抗菌肽最经济的方法。
但是，由于抗菌肽是小分子的碱性多肽，极易受到蛋白酶的攻击，而且表达产物往往对宿主细胞有毒性，因此，抗菌肽的外源表达较其他的多肽类药物更为困难。
大量相关研究对不同来源的抗菌肽进行了重组表达的尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统，毕赤酵母系统、昆虫系统等。
2 抗菌肽基因表达系统2.1 大肠杆菌表达系统在过去的20年里，对大肠杆菌系统的遗传学、生物化学和分子生物学方面有了充分的认识，使之成为表达许多外源蛋白的首选表达系统（Townes等，2004）。
抗菌肽的研究进展
抗菌肽的研究进展抗菌肽是一种生物活性肽类分子，具有广泛的抗菌谱和多种生物活性。
其研究涉及基础生物学、生物技术和医疗健康等多个领域，近年来得到了广泛关注。
一、抗菌肽的概述抗菌肽最初被发现于20世纪50年代，是一类长度在10~100个氨基酸之间、分子量在1~10千道尔顿的小分子化合物。
它们主要存在于植物、动物、微生物等生物体内，为一种特殊的免疫分子，具有广谱的抗菌、抗病毒和抗真菌等生物活性。
因此，抗菌肽已成为新型抗感染药物的研究热点之一。
抗菌肽可以激活宿主免疫系统，促进嗜中性粒细胞吞噬病原体，调控炎症反应等，同时还可以直接破坏细菌膜、DNA和RNA分子等，具有强大的杀菌能力。
二、抗菌肽的种类目前已经发现和鉴定的抗菌肽有数百种，其中最为常见的是以下几类：1、防御素：是由哺乳动物的单核细胞、肺泡、胃液和吐泄物等分泌的一种抗菌肽，主要作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
2、宏观藻类鱼类抗菌肽：是由宏观藻类和鱼类细胞制造出的一些无效肽类，主要杀菌作用是针对革兰氏阳性菌。
3、微生物抗菌肽：是由某些微生物体分泌的与内共生菌、外来菌和真菌等有广泛抗菌作用的肽类。
4、合成抗菌肽：与其他抗菌肽不同，合成抗菌肽是经过化学合成得到的一系列分子，因此其抗菌谱、抗菌速度、抗菌强度等性质可以根据需要调整和改进。
三、抗菌肽的应用前景抗菌肽作为新型抗感染药物具有很好的应用前景。
据报道，美国一些单位已经使用抗菌肽制成肺炎克雷伯菌感染的口服制剂，并且该制剂已进入三期临床试验，有望在未来取代现有的抗生素。
此外，抗菌肽还可以用于保健食品、动物饲料、化妆品等领域。
比如抗菌肽可以用于保健食品中，改善人体免疫系统的健康水平，饲料则可以用于提高家禽、畜禽的生产效益和健康水平。
四、抗菌肽研究的挑战和机遇尽管抗菌肽的应用前景广阔，但是其研究也面临一些挑战和机遇。
1、抗菌肽的生产技术尚不成熟，生产成本较高；2、抗菌肽的应用场景和使用规模有待进一步扩展和加大；3、抗菌肽的作用机理和毒副作用还需要深入研究和认识，以及合适的应用剂量等。
抗菌肽的研究进展
抗菌肽的研究进展摘要：由于细菌对抗生素耐药性不断出现, 研发新型抗菌物质已迫在眉睫。
而抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽。
本文介绍了抗菌肽的结构，抗菌肽的生物学活性，抗菌肽的作用机理和作用机制，以及抗菌肽的应用和前景。
关键词：耐药性，抗菌肽；作用机理；前景抗菌肽，简称ABP,是由宿主产生的一类能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽。
广泛存在于各种生物体内。
1980 年，瑞典科学家Boman 等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素( cecropin ) 抗菌肽，使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识。
目前世界上已知的抗菌肽共有1 700余种。
由于热稳定性强，且对较高离子强度环境有较强的适应性，不仅有广谱抗细菌能力, 而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又极少破坏动物体内的正常细胞，因此，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外昆虫学、生理学、药理学研究热点，在动植物转基因工程及药物开发领域及农业、食品等领域具有广阔的应用前景。
1 .抗菌肽的结构1 .1 一级结构据报道，已分离并测定其氨基酸序列一级结构的抗菌肽达几十种，且一级结构都比较相似，具有以下典型的特征：由20~70多个氨基酸残基组成的肽链，其N 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，C 端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸，中间部分则富含脯氨酸，且在许多特定位置都有一些较保守的氨基酸残基，这些高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的，1. 2 二级结构通过圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结构特征，结果表明，抗菌肽在一定条件下形成a-螺旋和β-折叠结构。
a-螺旋是一个近乎完美的水脂两亲结构,即圆柱形分子的纵轴一边为带正电-的亲水区，而对称面为疏水区。
这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键，改变a-螺旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。
抗菌肽的应用现状
４ 抗 菌 肽 在 基 因工 程 上 的应 用
有报 道 ，柞蚕抗 菌肽用 于预防及 治疗鸡 的白痢 效果 明 抗菌肽对疱疹病毒 、 流感病毒等均有抑制作用 ； 另有报道 ， 一 一 黑龙江职业学院。双城 １ ５ ０ １ １ １ ） 显。 应用含抗菌 肽的柞蚕免疫血淋 巴粉添加于断奶仔猪饲料 中， 饲喂试 验结 果表明 ， 柞蚕抗菌 肽可减轻 断奶 仔猪的腹泻 。 根据 马卫 明等 （ ２ ０ ０ ５ ） 的报道 ， 猪小肠抗 菌肽对鸡 大肠杆 菌 、
菌， 使其释放炎症介质 ； 促进巨噬细胞非调理素吞噬功能 ， 清
留问题 等优 点 ， 目前 已成
为抗病原微 生物药物开发
除细菌 ； 抑制组织纤维蛋 白溶解 ， 防止感染扩散 ， 刺激 成纤 维 细胞和上皮 细胞 的有丝分裂 ， 促 进成纤维 细胞 的生 长 ， 促 进
和细菌 的细胞 以及癌细胞 。 关键词：抗菌 肽；多肽；抗菌谱 ２ 抗菌肽在畜牧业 中的应用
研究 中的热点之一 ， 尤其 对多重耐药菌和杀伤肿瘤细胞而不
破坏机体正常细胞等特性 ， 是 继青 霉素等传 统抗 生素之后又
一
创伤 愈合 ， 在体外可 以激 活人 的淋 巴细胞 ， 可清 除感染病 毒 已分 离鉴 定 了 Ｉ Ｏ ０多 ０ｏ 三 ０ ． ∞ ① ９ ／ Ｊ ＿ ｌ ｓ∞Ｚ． ． １ ０ ． Ｉ ● ０ － ２ ｏ ＿ Ｉ ∞－ ０ ． ０ ０ 类重要的新型抗菌药物 。迄今为止 ， 种新抗菌肽 ， 利用不 同种类抗菌 肽治疗肺 炎 、 败 血性休克 和 口腔黏膜炎症等疾病模 型， 都取得 了显著成效 。 有研究表 明， 些抗菌肽在 亚毒 性浓度下可抑制 Ｈ Ｉ Ｖ 一 １的基因表达 。抗 菌 肽特异性抑制肿 瘤生长 ， 并对人 正常细胞无 害 的特性 ， 极有 可能成为无毒或低毒 的抗肿瘤新 药。国内外在抗 菌肽 的研究 与开发方 面已有 多年经 验 ， 当前是如何在加 紧基础研究 的同 时， 促进研究成果转化为生产力 的问题 。抗菌肽 的作用机理
水产动物抗菌肽基因异源表达研究进展
２ １ ，５ １ ） ３ ０ １４ （ １ ：４～３／ 晓枫 ， ６单 等
水 产 动 物ห้องสมุดไป่ตู้ 菌肽 基 因异 源 表达 研 究 进 展
单晓枫 吴 同垒 王贵生 钱 爱东 ， ， ，
（． １ 吉林农业 大学动物科学技术学院 ， 长春 １ １８ ２ 柳河县安 口镇中学 ， ３ １ ；． ０ 吉林柳河 １ ３４ ３ ０） ５ ［ 收稿 日 ］０ １ ０ １ ［ 期 ２ １ — ４— ２ 文献标识码 】 ［ Ａ 文章编号］０ ２— ２ ０ ２ １ ） １ ０ ３ ０ ［ １０ １８ （０ １ １ — ０４— ３ 中图分类号 】 ７６ Ｑ８
厦门大学以鱼类抗菌肽做为饲料添加剂即将 问世 的报 道 ， 但水 产 动 物 抗 菌肽 种 类 繁 多 ， 到抗 菌能 找
力更 强 、 用 范围更 广 的重组 抗 菌肽 仍是 当下 研究 应
污染环 境等 优点 而成抗 生 素最 可能 的替 代 品之 … 在 众多 来源 的抗 菌肽 中 ， 生 动物 的抗 菌 肽 水 以其 杀 菌作 用 更 强 、 血 效应 较小 、 类 更 多 样 化 溶 种 而显示 了更 具优 势 的应 用 前景 。因此 ， 廉价 的方 用
一
。
的热点。为此 ， 本文对水产动物抗菌肽在不 同表达 系统 中的研究 进展 做一综 述 ， 以期为 水 产动 物 抗 菌
肽 相关研 究提 供参 考 。
１ 大肠 杆菌 表达 系统
法大量获取水生动物抗 菌肽是对其进行深人研究 及广范应用的前 提。传统 的方法是直接分离并对 其进 行 相 应 的研 究 ， 此 方 法 工作 繁 琐 、 界 条 件 但 外 对抗菌肽的提取影 响较大 ， 而天然抗菌肽含量低 、 无法从体内大量提取 ； 另一种方法化学合成肽则价 格昂贵。因此 ， 利用基 因工程技术生产水产动物抗 菌肽 就成 为一 种必然 选择 。 目前 ， 内已有 国 家海 国
动物源抗菌肽的研究现状和展望
动物源抗菌肽的研究现状和展望汪以真（浙江大学饲料科学研究所，生物饲料安全与污染防控国家工程实验室，动物分子营养学教育部重点实验室，动物营养与饲料农业部重点开放实验室杭州310058）摘要：动物源抗菌肽是机体先天免疫系统的重要效应分子，因其具有广谱高效抗菌活性、细胞选择性及不易产生耐药性等特点，一直被人们认为是抗生素的理想替代品。
此外，由于动物体自身分泌的抗菌肽远未达到抑制细菌所需浓度，因此其生物学功能不仅局限于抗菌活性。
大量研究表明，抗菌肽不仅具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤等效果，在体内还表现出抗炎症反应、招募免疫细胞、促进上皮损伤修复、促进细胞吞噬细菌等重要作用。
然而抗菌肽在一些方面的研究尚不透彻或存在争议，如抗菌肽是否存在耐药性以及通过重组表达技术生产的抗菌肽是否能安全有效的应用。
关于抗菌肽的一些生物学功能与分子机制还有待系统深入的研究，如抗菌肽的构效关系、抗菌肽对益生菌的影响、抗菌肽与抗生素的互作效应、抗菌肽的稳定性及其吸收与代谢情况、营养物质调控内源抗菌肽的表达等。
因此本文旨在从动物源抗菌肽的生物学功能、作用机制、稳定性与吸收、表达规律与营养调控、分子改良以及重组表达6大方面进行综述，为研发新型、高效、环保型抗生素替代品提供重要信息和策略。
关键词：抗菌肽；生物学功能；稳定性；表达规律；分子改良；重组表达中图分类号：S816.7抗菌肽，又名宿主防御肽，是机体抵抗外来致病菌侵袭的重要屏障。
成熟抗菌肽一般包含12～100个氨基酸残基，由于其带正电荷、呈两亲性的分子结构，使得其便于与带负电荷的微生物膜或其他细胞靶点相互作用[1]。
人们一直认为抗菌肽具有广谱抗菌、不易产生耐药性、无残留等优点，然而随着对抗菌肽研究的不断深入，人们发现它并不是“万能的”，某些细菌仍然能对抗菌肽产生耐药性，而且某些抗菌肽对动物体内的益生菌也有一定的杀伤作用。
另外，外源抗菌肽的吸收、在动物体内的稳定性以及与抗生素相互影响等都不甚明了。
抗菌肽表达策略
抗菌肽表达策略抗菌肽是一类存在于生物体内的小分子肽链，具有广谱杀菌活性，对抗多种细菌、真菌和病毒具有重要作用。
由于其天然存在和广泛应用的潜力，越来越多的研究者开始关注抗菌肽的表达策略。
本文将针对抗菌肽表达策略进行探讨，介绍几种常见的表达方法及其优缺点。
一、原核表达系统原核表达系统是最常用的抗菌肽表达策略之一。
其中，大肠杆菌表达系统是最常用的原核表达系统之一。
通过将抗菌肽基因克隆到原核表达载体中，然后在大肠杆菌中进行表达，可以高效地获得目标抗菌肽。
此外，大肠杆菌对于异源蛋白的折叠和修饰能力较强，能够在较短时间内实现高产和纯化。
然而，原核表达系统也存在一些限制。
首先，大肠杆菌表达系统对于一些复杂的抗菌肽可能无法实现正确的折叠和修饰，导致功能丧失。
其次，原核表达系统中的内毒素问题，可能会对宿主细胞产生毒性作用，降低表达效率。
因此，在使用原核表达系统进行抗菌肽表达时，需要对宿主细胞进行优化，以提高表达效率和抗菌肽的活性。
二、真核表达系统真核表达系统是另一种常用的抗菌肽表达策略。
在真核表达系统中，酵母表达系统是最常用的一种。
酵母表达系统具有真核细胞的优势，能够实现正确的折叠和修饰，对于复杂的抗菌肽表达具有一定的优势。
然而，酵母表达系统也存在一些局限性。
首先，酵母表达系统相对于原核表达系统来说，表达效率较低。
其次，酵母细胞对于复杂抗菌肽的折叠和修饰能力仍有限制，无法实现所有抗菌肽的正确表达。
因此，在选择真核表达系统进行抗菌肽表达时，需要根据具体的抗菌肽结构和功能要求进行选择。
三、细胞外表达系统细胞外表达系统是一种新兴的抗菌肽表达策略。
通过将抗菌肽基因克隆到细胞外表达载体中，然后在细胞外环境中进行表达，可以避免宿主细胞中毒性物质的积累，提高抗菌肽的产量。
细胞外表达系统具有一些独特的优点。
首先，细胞外表达系统能够避免宿主细胞中的毒性物质对抗菌肽产量和活性的影响。
其次，细胞外表达系统能够提高抗菌肽的产量，从而满足大规模生产的需求。
抗菌肽的基因工程研究及应用
第31卷第7期中南林业科技大学学报Vo l.31N o.72011年7月Journal of Central South University of Forestry &Technology Jul.2011收稿日期:2011 03 18基金项目:荷叶及莲附属物抗口腔疾病活性成份深度开发关键技术(2009NK3121);生物化学与分子生物学校级重点学科建设基金作者简介:崔 奕(1981 ),男,湖南长沙人,硕士研究生,从事生物制药方面研究;E mail:cuiyi8123@ 通讯作者:王 平(1964 ),男,湖南澧县人,教授,博导,主要从事生物技术、环境科学方面的教学与科研工作;E mail:wangping@抗菌肽的基因工程研究及应用崔 奕1,2,王 平1,黄赤夫2(1.中南林业科技大学生命科学与技术学院,湖南长沙 410004;2.美国肯塔基大学口腔医学院,美国肯塔基 40503)摘 要:抗菌肽(Antimicrobial Peptides)是由生物细胞特定基因编码,经特定外界条件诱导产生的一类多肽,它是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽,是两性分子,常带正电荷。
抗菌多肽广泛存在于多种生物体内,具有广谱抗菌、调节免疫、抑制肿瘤等多种生物功效,作用机制独特,是目前基因工程研究的热点之一。
抗菌肽以及人工合成的抗菌肽基因可以通过动植物体表达并呈现出相应的抗菌活性。
就抗菌多肽的一般特性及其在基因工程的应用进行了系统地介绍,旨在为了解和研究抗菌肽动态的科研人员提供参考。
关键词:抗菌肽;抗菌肽基因;转基因;综述中图分类号:Q 789文献标志码:A文章编号:1673923X(2011)07020908Antibacterial peptide and application of genetic engineeringCU I Y i 1,2,W A NG Ping 1,H U A NG Chi fu 2(1.School of L ife Science and T echnolog y,Centr al South U niver sity o f Fo restry and T echno lo gy ,Chang sha410004,Hunan,China; 2.Dentist Co llege,K entucky o f U niver sity,Kentucky 40503,U SA)Abstract:A nt ibacter ial peptide is a kind of peptide that co nsists of biolo gica l cells of specific gene enco ding and induced by a specific ex ternal condition,w hich ex ists w idely in biolog ical activity of a class of small peptide,being amphipathic molecule,often w ith a positive char ge.Antibacterial peptide is widely dist ributed in v ario us biolog ical bo dy ,w ith br oad spectrum antibact erial,immune,inhibition of tumor and other bio log ical effects,and unique mechanism of action,and it is o ne of ho t issue of g enet ic engineer ing.A nt ibacter ial pept ide and its synthetic peptide g ene can be ex pressed in plant and animal body and has antibact erial activity.T he g ener al characterist ics o f antibacterial peptides and its appli catio n in genet ic eng ineering system is intr oductio n to prov ide a reference fo r scientific research o f antibacterial pep tides.Key words:antibacter ial pept ide;ant ibacter ial peptide gene;tr ans g ene;review ar ticles抗菌肽(antibacterial peptide)又称抗微生物肽(antimicrobial peptide),是多细胞生物体自身防御系产生的具有高效广谱抗菌活性的小分子肽,它对细菌、真菌以及病毒、原虫和癌细胞都有作用。
抗菌肽基因表达系统研究进展
点 突 变 的方 法改 变某些 碱 基 但对 于 抗 菌肽 小 分 子 而 言 这 两 种 方 法 均 显 繁 琐 由于 分 子 量 小 直 接 根 据 表
、
，
的
TCG
、
抗 菌 活性 的组 分无 疑是
一
件非 常繁琐
作 且不同
．
，
编码 Le
，
的 CT G CT A 等 其使用 频 率几 乎 是 0
。
的实验条件对 于 组 分 的纯 度 影 响很 大
，
天 然存在 的抗
般来 说 含 有较 高 比例 的稀 有密 码 子 f或稀 有 密码
，
菌 肽 产 量 很 低 无 法 从 动 植 物 体 内 大 量 提 取 ：而 化 学 合 成 肽 价 格 昂 贵 所 以 国 内 外 都 将 目光 瞄 向 利 用 基 因
文 中进 行 了 简要 综 述
关键词
抗 菌 肽 ；基 因 表 达 ；大 肠 杆 菌 ；毕 赤 酵 母
S 8 16 1 5
．
中图分类号
抗 菌 肽 (A n t i b a
、
c
te
r
i a l p e p t ide )是
生物细胞 特定基
一
同来 源 的 抗 菌 肽 进 行 了 重 组 表 达 的 尝 试 涉 及 的 表 达
营
> 饲 《 硝 I ~ > 2 0 0 9 垂塑 璺 堂璺 Z 塑 Q
-
目
抗 苗 肽 基 因 襄 达 蔡 统 研 究 进 展
唐 摘
要
抗
勇
，
菌肽 是 生 物 体 产 生 的
，
一
种 阳 离子 短 肽 具 有 天 然 的 抗 菌 活 性
Hepcidin研究进展
Hepcidin研究进展张丽;张连峰【摘要】Hepcidin是肝脏特异性表达的一种小分子抗菌肽,是铁代谢的负调节激素.与炎症性贫血、遗传性血色沉着病等疾病的发病机制密切相关.证据显示,Hepcidin直接抑制肠上皮细胞铁吸收和诱导单核巨噬细胞铁滞留.同时,Hepcidin还具有广谱抗菌活性,与固有免疫密切相关.铁超载、感染、炎症及细胞因子可诱导Hepcidin表达,而贫血和缺氧则抑制其表达.Hepeidin的发现及其相关的铁离子运输机制的研究,将为铁离子吸收及分配的铁稳态调节和炎症性贫血、遗传性血色沉着病中的铁代谢障碍的分子机制探索开辟新的途径.本文就Hepcidin 的分子特征、表达调控及生物学功能等方面研究进展进行综述.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)001【总页数】5页(P52-56)【关键词】铁代谢;固有免疫;激素;调控;心脏【作者】张丽;张连峰【作者单位】中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京100021;中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京100021【正文语种】中文【中图分类】R-33Hepcidin是 2000年发现的由肝脏特异表达的小分子防御性抗菌肽,但后来的研究表明其不仅具有广谱抗菌活性,而且还参与调节铁吸收,目前被认为是维持铁稳态极其重要的负调节激素[1]。
实验表明,Hepcidin具有抑制小肠对铁的吸收和可能促进铁在网状内皮系统中滞留等作用,介导血色素沉着病、慢性病贫血等多种铁代谢紊乱性疾病,但其作用机制仍停留于假说阶段,迄今为止也还未找到Hepcidin的受体。
因此,Hepcidin功能与作用机制的研究已成为当前铁代谢及相关疾病研究领域中的热点问题之一。
本文就 Hepcidin的分子生物学功能、作用机制及最新的研究进展进行综述。
天蚕素抗菌肽的研究进展
纯化、 拼接、 克隆等一系列步骤合成了一个以植物 偏爱的遗传密码子编码的天蚕素抗 菌 肽 Ｂ基 因。 桑春果等
［ ９ ］
人工设计并合成了抗菌肽 Ｂ基因的 ４
膀胱癌细胞有很强的抑制作用。
个寡聚核苷酸片段， 通过重叠区扩增法， 扩增出了 相当于抗菌肽 Ｂ基因全长的寡聚核苷酸片段。
动物营养学报 ２ ０ １ ２ ， ２ ４ （ １ ） ： ４ １ ４ ７ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅＪ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ Ｎ ｕ ｔ ｒ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ６ ２ ６ ７ ｘ ． ２ ０ １ ２ ． ０ １ ． ０ ０ ７
７ ］ 成也是一条较好的获得抗菌肽的途径。徐飞等 ［
抗菌 肽 对 肿 瘤 有 明 显 的 抑 制 作 用， 抑瘤率高达
１ ６ ］ １ ７ ］ ５ ０ ． ８ ８ ％ 。胡云龙 ［ 和 许 玉 澄 等［ 报 道， 家蚕抗
菌肽对小 鼠 Ｓ １ ８ ０肉 瘤 细 胞 和 子 宫 瘤 细 胞 有 明 显 的抑制作用， 抑瘤率达 ３ ０ ％～ ５ ０ ％， 但对外周血白
［ ６ ］
３ ． ３ 抗肿瘤作用 近年来， 天蚕素抗菌肽在肿瘤细胞上的作用
１ ５ ］ 的研究已被广泛开展。郭玉梅等 ［ 报道， 天蚕素
对家蚕进行饥饿、 电
击和注 射 大 肠 杆 菌 （ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａｃ ｏ ｌ ｉ ） 等诱导处理 后， 采用乙酸浸提法提取家蚕抗菌肽， 结果 ３种诱 导源诱导家 蚕 产 生 的 抗 菌 肽 对 大 肠 杆 菌、 金黄葡 萄球 菌 （ Ｓ ｔ ａ ｐ ｈ ｙ ｌ ｏ ｃ ｃ ｏ ｃ ｕ ｓａ ｕ ｒ ｅ ｕ ｓ ） 和四联球菌（ Ｍｉ ） 等细菌均有抑菌活性。 ｃ ｒ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｔ ｅ ｔ ｒ ａ ｇ ｅ ｎ ｕ ｓ ２ ． ２ 人工合成 随着人 们 对 抗 菌 肽 结 构 研 究 的 深 入， 化学合
抗菌肽基因表达系统研究进展
达宿主偏爱密码子， 设计并合成编码抗菌肽基因，从 表达， 产物用肠激酶切割后反向高效液相色谱纯化，
而避 免 不同 物 种对 不同 密 码子 使 用 频 率 的 不 同 对 表 结果获得了高纯度的 rhBD3 蛋白，其活性水平与人工
达效果产生负面影响。
合成和提取的天然多肽一致。 Peng 等(2004)将人 β-防
在原核表达体系中直接表达具 有 天然 生 物活 性的 抗 hBD2 的可 溶 性表 达 ，产 量 达 到 1.31 g/l，占 菌 体 可 溶
菌肽。 防止抗菌肽对表达宿主菌的伤害，是提高抗菌 性蛋白总量的 41.6％， 纯化后的蛋白具有抗 菌活 性 ，
肽基因表达水平的关键问题。 现在一般采用以融合蛋 该研究显示了应用基因工程技术大规模制备抗菌肽
《饲料工业》·2009 年第 30 卷第 7 期
营养研究
抗菌肽基因表达系统研究进展
唐勇
摘 要 抗菌肽是生物体产生的一种阳离子短肽，具有天然的抗菌活性。由于抗菌肽具有与传统 抗生素不同的作用机制，不产生耐药性，因而具有重要的临床应用价值，可作为新型绿色、安全、环保 的饲料添加剂。但是怎样用廉价的方式大量地得到抗菌肽是对它进行深入研究和广泛应用的前提，基 因重组的方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法，许多研究对不同来源的抗菌肽进行了重组表 达的尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统、昆虫系统。针对近年来抗菌肽开发的基因工 程策略和实践，尤其是大肠杆菌表达系统和酵母表达系统，文中进行了简要综述。
合，致不形成成熟的天然或完全解链的蛋白。 包涵体 可以诱导基因发生重组的同源序列和在大肠杆菌中
能，因此，融合表达不仅可以提高抗菌肽的表达量，还 伟 等 （2007）将牙 鲆 抗菌 肽 Hepcidin 基 因 重组 至 融 合
抗菌肽的研究进展及其应用
抗菌肽的研究进展及其应用一、本文概述抗菌肽，作为一类具有广谱抗菌活性的多肽分子，自发现以来就在全球科研领域引起了广泛关注。
这些肽类分子以其独特的抗菌机制、良好的生物相容性和低毒性等优点，为解决日益严重的抗生素耐药性问题提供了新的可能。
本文旨在全面综述抗菌肽的研究进展及其应用现状，为相关领域的研究人员提供有价值的参考。
文章首先简要介绍了抗菌肽的基本特性、分类及作用机制，然后重点分析了近年来抗菌肽在合成生物学、分子生物学、遗传学等领域的最新研究进展，包括抗菌肽的基因克隆、表达调控、结构改造等方面。
文章还对抗菌肽在农业、医药、食品工业等领域的应用进行了详细阐述，展望了其未来的发展前景。
通过本文的综述，期望能为抗菌肽的深入研究与广泛应用提供有益的启示和借鉴。
二、抗菌肽的分类与来源抗菌肽，作为一种天然的抗菌物质，其来源和分类具有多样性和复杂性。
从来源上看，抗菌肽可以分为两大类：一是来源于生物体的内源性抗菌肽，这类抗菌肽主要由生物体的免疫系统产生，用于抵抗外来病原体的入侵；二是来源于人工合成的抗菌肽，这类抗菌肽则是通过人工基因工程技术合成，具有特定的抗菌活性。
从分类上看，抗菌肽可以根据其结构、功能和作用机制的不同进行细分。
其中，根据结构特点，抗菌肽可以分为α-螺旋结构抗菌肽、β-折叠结构抗菌肽、环状结构抗菌肽等；根据功能特性，抗菌肽可以分为广谱抗菌肽、特异性抗菌肽等；根据作用机制，抗菌肽可以分为膜作用型抗菌肽、细胞内作用型抗菌肽等。
不同的抗菌肽具有不同的生物学活性和抗菌效果，因此在医药、农业、畜牧业等领域具有广泛的应用前景。
深入研究抗菌肽的分类与来源，对于理解其抗菌机制、发掘新的抗菌肽资源、开发新型抗菌药物具有重要意义。
三、抗菌肽的作用机制抗菌肽的作用机制是其生物学活性的核心，也是抗菌肽研究和应用的关键。
抗菌肽的作用机制主要包括破坏细菌细胞膜、抑制细菌细胞壁合成、干扰细菌蛋白质合成和抑制细菌DNA、RNA合成等几个方面。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抗菌肽及 基因表达体系研究进展罗振福1 李俊波2 贺建华1 范志勇111湖南农业大学科学技术学院21湖南省唐人神研发中心 摘 要 抗菌肽是20世纪70年代由瑞典科学家H G Boman首次发现,其具有优良的光谱抗菌性能,无残留,不会导致耐药菌株的出现,是目前抗生素类较有潜力的替代品。
早在20世纪80年代,人们就已试图通过转基因等生物工程技术改良物种或大量表达该类物质,目前已有众多表达体系和转基因动植物研究成功,并有一些抗菌肽类药物投入临床使用。
关键词 抗菌肽 基因工程 提取 表达 抗菌肽(antimicrobial peptide)是生物体用来抵制外来入侵病原体,具有抗菌作用的一类小分子蛋白质或短肽,并且在生物体内广泛存在。
20世纪70年代H GBoman在用大肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)时分离得到世界上第1个真正意义上的抗菌肽—天蚕素(cecropin)。
此后,人们相继从各种小到细菌大到高等动植物体内分离获得该类物质,其发现种类和数量也随着时间的推移而不断增加。
抗菌肽具有优良的广谱抗菌性能,对革兰阳性菌和阴性菌都表现出良好的抑菌效果,相对于抗生素具有效价高和无残留等特点,一直受到各国学者的广泛关注。
随着基因工程和生物工程的发展,对于抗菌肽在体外的克隆和转载表达等研究也在积极进行中,各种转抗菌肽基因动植物及产品相继问世,对抗菌肽的大规模利用提供了一条前景广阔的道路。
文章试图通过介绍抗菌肽的一些基本作用、获得方式及在基因工程方面的研究进展,以期增加对该类物质的认识,并为今后规模化利用提供参考。
1 抗菌肽作用1.1 杀菌和抗菌抗菌肽是一种肽类抗生素,对于各种革兰阳性收稿日期:2008-09-17通讯作者:李俊波菌和阴性菌都具有较高的抗性,可杀灭侵入宿主体内的细菌或抑制其生长繁殖。
如人类防御素hBD-2对大肠杆菌及其他常见致病菌具有明显的抑制和杀灭作用,并且活性比hBD-1高10倍(但有浓度限制,只有超过100μg/m L时才能抗金黄色葡萄球菌)。
目前,无论是人工合成还是生物提取的抗菌肽,均表现出较好的广谱抗菌性能,是传统抗生素较有潜力的替代品。
1.2 抗病毒众多研究证实,抗菌肽能通过影响病毒的复制和转移,或直接杀灭病毒而发挥作用。
如从嗜中性粒细胞中提取的Ind olicidin在浓度为60～100m g/m L的50 %抑制剂量时对HI V-1型病毒(333m g/m L)具有一定杀灭作用;caerin1.1,caerin1.9和m aculatin1.13种抗菌肽可抑制HI V的感染,阻断病毒向T细胞转移;防御素则可使单纯疱疹病毒(HS V)、水泡性口膜炎病毒(VS V)和流感病毒(I V)失活等。
1.3 抗肿瘤M Anderss on等首次发现,NK-lysin具有抗肿瘤活性并得到后人证明,此后,人们加深了其在医学上的研究。
究其抗肿瘤原因,可能与抗菌肽直接杀灭和抑制肿瘤细胞有关,如从欧洲林蛙分离出来的tem porin L能诱导肿瘤细胞坏死,具有一定阻止肿瘤细胞扩散的作用;从鲎血细胞中提取的速普肽(又名中国鲎肽T achyplesin)和鲎肽(polyphemusin)则可和整联蛋白结合序列RG D结合,破坏细胞膜并诱导细胞凋亡,以此来抑制肿瘤细胞和内皮细胞的增殖等。
1.4 免疫调节抗菌肽在适当浓度时以直接杀灭病菌来发挥免疫作用,而在低于适当浓度时是以免疫调节的形式保护生物体或本身就只起到免疫调节的作用,调节免疫系统。
如α-防御素能增强其巨噬细胞的吞噬作用,β-防御素则可吸引T细胞、未成熟的DC和单核细胞至感染部位上起作用,诱发体液和细胞免疫应答,具有免疫增强作用等。
2 抗菌肽获得途径2.1 生物提取抗菌肽在生物体内广泛存在,具有原料来源广、工艺相对简单及产量大的特点目前,各国学者已从各种动植物组织和器官中提取出多种抗菌肽,如从非洲蟾蜍胃中可提取出构和性质不同,但均证明对大肠杆菌和白色念珠菌等革兰阳性菌和阴性菌有抑制作用的抗菌肽。
此外,从蟾蜍皮肤中提取的magainin家族被证明是其重要的生理屏障,在皮肤破损情况下起抗菌作用,从而保证不被感染。
生物提取法包括有机溶剂提取法、水浸提法和有机酸提取法等,虽然具有众多优点,但其尚未进入大规模应用阶段,主要是由于提取后杂质较多、提取率较低且成本相对较高造成。
国内已有学者探索的加热—层析法提取蝇蛆抗菌物质,其抗菌肽得率为0.26%,虽然获得率较低,但却是海藻酸吸附法的52倍。
未来生物提取法即是朝着获得率高且成本进一步低的方向发展,为工农业生产提供便宜、安全和可靠的抗菌肽产品。
2.2 人工合成随着人们对抗菌肽结构的深入研究,通过化学方法人工合成抗菌肽已变为可能。
而对于一些难以经生物提取的抗菌肽,通过化学合成也是一条较好的解决途径,且合成的产品被证明同样在相应生物基质中具有优良的抗菌性能。
P19(8),D-P19(9/ B)和L-P19(9/B)便是3种经模板链编码、人工合成和纯化等一些列步骤获得的抗菌肽,虽然结构相似,仅存在3个残基差异,但抗菌性能却不同,对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)也不同。
尽管化学合成法在生产上可行,但同样也具有合成费用高、产品纯度低和合成长链肽时效率较低的问题,因而使用受到限制,经改进后,现行的工艺较以往有很大发展,但仍不及通过基因和生物工程在体外表达的发展潜力。
2.3 体外表达通过转基因技术实现抗菌肽在体外的广泛表达是今后的研究重点和发展方向,具有广泛的临床和生产应用前景。
如牛气管抗菌肽(T AP)是牛体内重要的生理屏障,保障气管不受感染,但其有限的活性影响了在医药和农业上的应用。
S Y arus通过转基,从而较长、在后期提取和纯化过程中存在费用过高的问题。
且经细菌表达体系表达时可能对宿主菌有杀伤作用,通过基因工程改造后的动植物是否存在排异这些问题仍有待研究。
3 抗菌肽的表达体系研究3.1 真核和原核生物表达体系体外大量获得抗菌肽,需利用不同的表达体系。
目前,各种真核和原核生物表达体系已较成熟,所表达的抗菌肽种类和数量也较以前有很大丰富和提高。
3.1.1 真核生物表达系统3.1.1.1 大肠杆菌表达体系Y ang等(2004)将人的阳离子抗菌肽hC AP-18/ LL-37、凝血酶识别位点和硫氧还蛋白三者构建成表达载体pET-mh-C AP-18,然后在大肠杆菌中进行表达,获得的融合蛋白经凝血酶消化后形成重组的G S LL-39,重组的G S LL-39与其天然形式相比,在N末端多出2个氨基酸残基,但与其天然形式相似,具有抗革兰阳性菌和阴性菌的活性。
李景鹏采用从pUC18载体上回收的防御素H NP-1外源基因片段,使其与载体pET30b连接,获得pET30b-I-I NP-1重组质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达,结果发现,人防御素融合蛋白得到表达,由此认为,人防御素基因(H NP-1)可在大肠杆菌BL-21 (DE3)株中表达,目的蛋白在菌体内以包含体形式存在。
大肠杆菌表达体系是真核生物表达系统中研究较多的一种,具有一定简易性和大众性,国内外学者也取得了众多成果,但仍有一些缺陷:1)缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程,表达后的抗菌肽活性受到影响。
2)表达的蛋白质多以包含体形式存在,不利于抗菌肽纯化和回收。
3)杂蛋白多,纯化步骤复杂等。
3.1.1.2 杆状病毒表达体系杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system,BE VS)是近年出现的适用范围最广和表达效率最高的杆状病毒—昆虫表达系统之一,由转移质粒、线形化苜宿银夜蛾核型多角体病毒(autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)和草地夜蛾细胞(spodoptera frugiperda,S f21)构成。
杆状病毒也是抗菌肽基因工程原核表达中一种重要的表达体系,其发现时间较早。
Anders ons D(1991)指出,抗菌活性短肽(AMP)的表达体系即杆状病毒,并使用该表达体系融合表达了抗菌肽cecropin。
此外,T T ana2 ka(2003)将编码牛乳铁蛋白(b LF)的基因插入杆状病毒转移载体,分离表达bLF的重组病毒,使用抗bLF的单克隆抗体从重组的杆状病毒中检测到约80ku的b LF相关蛋白,并证明rbLF在氮末端含有糖蛋白结合位点,说明杆状病毒表达体系成功的表达了目的蛋白。
与大肠杆菌表达体系相比,杆状病毒表达体系具有操作相对简便、培养成本低、表达量高及所表达蛋白与天然蛋白特性相似等优势,具有较强的应用潜力。
但目前后者的研究和报道及所表达的抗菌肽种类较少,可能与杆状病毒宿主范围较窄有关。
3.1.2 原核生物表达系统3.1.2.1 酵母表达体系酵母表达体系是目前抗菌肽基因和生物工程中重要且应用最为广泛的表达体系之一(其中应用较多的是赤氏巴斯德酵母),具有基因操作相对简单、外源蛋白能正确加工与修饰、表达量高、易大量发酵培养和易纯化等优点,国内学者在这方面做了大量工作,如扈进冬(2006)等根据惜古比天蚕Cecropin B 成熟肽段的氨基酸序列,将其C端的甘氨酸用谷氨酰胺替代,选用酵母偏爱密码子人工合成Cecropin B 基因,并在毕赤酵母中成功地表达了Cecropin B。
此外,国外学者在酵母表达体系方面也有许多报道,如Heterolog ous蛋白质、elicidor蛋白质及Pisum sativum 防御素1(Psd1)等均在毕赤酵母中成功表达。
应注意的是,转入基因的转录和表达的效率、宿主菌的种类和状态及内源蛋白酶的活性等因素均能影响外源蛋白在毕赤酵母中表达,所以在生产和试验中应注意选择。
3.1.2.2 小球藻表达体系小球藻属于绿藻门小球藻属的一种单细胞真核微藻,是近年来发展较快的抗菌肽表达体系。
以防御素为例,目前已有许多关于兔防御素基因在小球l基因转入小球藻,体外离体抑菌试验证明整合到小球藻基因组中。
小球藻能作为优良的生物反应器,从而正确表达所需蛋白。
此外,各种因素,如随机整合与同源重组对外源抗菌肽基因表达也有一定影响,改变其表达后的活性。
3.2 利用转基因技术提高抗菌肽表达的研究3.2.1 表达技术3.2.1.1 人工合成编码基因,构建表达载体抗菌肽自身的氨基酸序列不长,通常只有几十个残基,因而其编码基因的cDNA序列也相对较短,只有几百个bp,甚至几十bp。
利用以往文献报道的抗菌肽序列,参照一定设计策略,如改变α-螺旋的螺旋度和增加电荷数等,可合成所需抗菌肽基因,从而进行转基因表达,避免了生物合成费时费力的缺点。
目前,已有多种合成的抗菌肽基因片段在体外成功表达的先例,如I L-2基因在大肠杆菌中的表达,国内报道的有FcyRIIb1和S B基因等,这些基因片段长短不一,从几十bp到几千bp不等,显示出人工合成编码基因进行表达的强大潜力。