研究生 PCR

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中国药科大学现代生化药物复习资料(适用于期末、研究生入学考试)

•现代生化药学复习提要第一章 PCR1 PCR的英文全称：Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应2 PCR是发明者：Kary Mullis 美国科学家 1985申请专利。

Perkin-Elmer Cetus公司第一台PCR扩增仪。

3 PCR的基本原理是什么？以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照办保留复制到机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。

A．混合模板DNA，四种核糖的三磷酸盐和DNA聚合酶，加入过量的2种DNA引物，与模板中需要的序列的起始和结束区域结合。

B．加热反应液至94℃以使模板DNA的双链变成单链（变性）C．冷却至50℃，引物与模板DNA的单链结合（退火）D．升温至72℃，DNA聚合酶催化DNA复制以产生双螺旋DNA（延伸）E．重复步骤2-4至满意为止4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？一种是与预期长度的片度，一种是比预期长度长的多的产物。

目的产物以指数级数2n增加；另一种产物以几何级数 2n增加，在总产物中所占的比重很小，可以忽略。

5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？7种：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子、石蜡油○1模板DNA：是待扩增序列的核酸,不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂、结合DNA的蛋白。

○2特异性引物：引物是靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。

引物是决定PCR扩增片断的长度、位置和结果的关键。

引物设计的必要条件：与引物互补的靶DNA序列必须是已知的。

○3热稳定DNA聚合酶：○1聚合作用（5’→3’）、○23’→5’的外切酶活力、○35’→3’的外切酶活力○4脱氧核苷三磷酸（dNTP）：原料。

分子生物学实验报告

分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。

（2）了解引物设计的基本要求。

1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。

pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。

pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。

经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。

因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。

pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。

PCR实验操作常见问题及解决方法

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量与特异性；④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

Q可能原因：1.模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

2.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

3.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

4.Mg2 浓度：Mg2 离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

5.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul，或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

重复引物PCR技术在超大片段动态突变疾病基因检测中的应用_陈晟

遗传Hereditas (Beijing) 2014年11月, 36(11): 1145―1151 综述收稿日期: 2014-07-19; 修回日期: 2014-10-14作者简介: 陈晟，硕士研究生，专业方向：神经遗传病。

E-mail: chensheng0039@通讯作者:吴志英，博士，主任医师，研究方向：神经遗传和变性病。

E-mail: zhiyingwu@ DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.1145 网络出版时间: 2014-10-16 11:39:42URL: /kcms/detail/11.1913.R.20141016.1139.003.html重复引物PCR 技术在超大片段动态突变疾病基因检测中的应用陈晟1，吴志英21. 福建医科大学附属第一医院神经内科，福州 350005；2. 复旦大学附属华山医院神经内科，上海 200040摘要: 动态突变疾病是指基因编码区或非编码区发生核苷酸重复序列异常扩增所导致的一类遗传性疾病。

发生于非翻译区的动态突变常常伴有超大片段重复序列，应用普通PCR 法无法对该片段进行扩增，而传统的Southern blot 等技术费时费力，无法应用于临床基因诊断。

在此背景下，重复引物PCR 技术应运而生，并随着应用范围的扩大而逐渐改进，适用于强直性肌营养不良症、Friedreich 共济失调、脊髓小脑性共济失调10型及C9orf72基因突变引起的额颞叶痴呆或肌萎缩侧索硬化等遗传性动态突变疾病的临床基因检测。

文章简要介绍了重复引物PCR 技术的原理，着重阐述了重复引物PCR 技术在相关超大片段动态突变疾病临床基因检测中的应用进展。

关键词: 重复引物PCR 技术；超大片段重复序列；基因诊断；动态突变疾病Advances on repeat-primed PCR assay for the genetic diagnosis of dy-namic mutation diseases with large pathogenic expansionsSheng Chen 1, Zhiying Wu 21. Department of Neurology , First Affiliated Hospital , Fujian Medical University , Fuzhou 350005, China ;2. Department of Neurology , Huashan Hospital , Fudan University , Shanghai 200040, ChinaAbstract: Dynamic mutation diseases are genetic diseases caused by unstable repeat expansions in coding ornoncoding regions. The unstable repeat expansions located in the noncoding region usually accompany large expan-sions which are difficult to amplify using the standard PCR assay. Traditional detection methods, including South-ern blot, are usually time-consuming and labor-wasting. A new method called fluorescent repeat-primed PCR assay was brought into clinical applications. With the development of genetic diagnoses for dynamic mutation diseases, such as myotonic dystrophy, Friedreich’s ataxia, SCA10, and amyotrophic lateral sclerosis or frontotemporal demen-tia caused by C9orf72 mutations, the clinical use of repeat-primed PCR assay has been broadened. Here, we review the principle of repeat-primed PCR assay and its advances on the genetic diagnoses of related dynamic mutation dis-eases with large pathogenic expansions.1146 遗传Hereditas (Beijing) 2014第36卷Keywords:repeat-primed PCR assay;large pathogenic expansions; genetic diagnosis; dynamic mutation disease动态突变疾病是指基因编码区或非编码区发生核苷酸重复序列异常扩增导致的一类遗传性疾病，根据其发生扩增的分子生物学机制不同，大致可分为三类：第一类是异常扩增引起转录过程受阻，如脆性X综合征(Fragile X syndrome, FXS)、Friedreich 共济失调(Friedreich ataxia, FRDA)等；第二类是异常扩增导致病理性RNA毒性蓄积，如强直性肌营养不良症症1型(Myotonic dystrophy 1, DM1)、脊髓小脑性共济失调10型(Spinocerebellar ataxia 10, SCA10)等；以上两类均为非编码区重复序列异常扩增。

PCR实验室社会效益评估

PCR实验室社会效益评估在我国，PCR实验室广泛应用于疾病诊断、法医学鉴定、生态监测等多个领域。

通过实际案例分析，我们可以看到PCR实验室在社会中具有显著的经济效益、公共卫生效益和科研教学效益。

一、经济效益PCR实验室在医学领域发挥着重要作用。

以新冠病毒检测为例，PCR技术在短短几小时内就能准确判断患者是否感染病毒。

疫情期间，我国建立了大量PCR实验室，有效支撑了疫情防控工作的开展。

据数据显示，PCR实验室的建设和运营为我国节省了大量医疗资源和财政支出。

PCR实验室在法医学鉴定中也具有重要意义。

以DNA检测为例，PCR技术可以实现对微量样本的准确分析，为案件侦破提供关键证据。

据统计，我国每年约有10万起案件涉及到PCR实验室的技术支持，平均每起案件节省侦查时间约20天。

二、公共卫生效益PCR实验室在公共卫生领域的作用不容忽视。

以水质监测为例，PCR技术可以快速检测出水中的微生物含量，为政府部门制定水资源保护政策提供科学依据。

在食品安全领域，PCR实验室可以及时发现食品中的病原体，保障人民群众的饮食安全。

以我国某地为例，当地政府投资建设了PCR实验室，对饮用水、食品等进行定期检测。

结果显示，PCR实验室的建设使得当地食品安全事故发生率降低了30%，水质合格率提高了20%。

这些数据充分展示了PCR实验室在公共卫生领域的显著效益。

三、科研教学效益PCR实验室是科研教学的重要平台。

在我国，许多高校和科研机构都建立了PCR实验室，为研究人员提供高效、准确的实验手段。

以基因编辑技术研究为例，PCR实验室可以实现对目标基因的快速扩增和检测，为基因治疗、生物制药等领域的研究提供有力支持。

PCR实验室还承担着培养人才的任务。

在我国，许多PCR实验室对本科生、研究生和博士生开放，让学生在实际操作中掌握PCR技术，提高实践能力。

据调查，经过PCR实验室培训的学生，在就业市场上具有更高的竞争力。

PCR实验室在我国社会中具有显著的经济效益、公共卫生效益和科研教学效益。

研究生分子生物学实验讲解

⑥物理化学因素：低温，合适的pH值
⑦取组织样品时要快速
RNA完整性的鉴定
RNA样品电泳后，可见28S、 18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase。 28S和18S RNA比值约为2：1, 表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。
(2) 如何保证RNA的纯度？
2、加250ul裂解液，颠倒4次混匀；加10ul碱性蛋白酶溶液，颠倒4次混匀；室温放5分钟。 3、加350ul平衡液，颠倒4次混匀；10000rpm离心10分钟。 4、上层清液转移到离心柱上。10000rpm离心1分钟，弃去收集管中溶液。
5、加入750ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。
RT：Reverse transcription
PCR的基本过程三个基本步骤
①变性(denaturation):双链DNA模板解开成单链 94–96℃，速度快，1min
②退火(annealing)：两个寡核苷酸引物结合到单链模板退火温度依赖Tm(Tm-5) Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ℃
1. The electric charge effect（电荷效应） PH（8.3） > PI（4.0－4.5）, DNA -
2. The sieving effect （分子筛效应） a The molecular weight of DNA b The structure of DNA
共价闭环 DNA ＞直线 DNA ＞开环的双连 DNA
3. The concentration of agarose gel （琼脂糖凝胶的浓度）
EB（溴化乙锭）

PCR_管内温度的精准预测及快速控温

引用格式：张月业, 姚佳, 张芷齐, 等. PCR 管内温度的精准预测及快速控温[J]. 中国测试，2023, 49(11): 150-156. ZHANG Yueye,YAO Jia, ZHANG Zhiqi, et al. Accurate estimation and rapid temperature control methods of PCR temperature in tube[J]. China Measurement & Test, 2023, 49(11): 150-156. DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2023020082PCR 管内温度的精准预测及快速控温张月业1,2，姚佳2，张芷齐2，李金泽2，周连群1,2(1. 长春理工大学机电工程学院，吉林长春 130022; 2. 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所中国科学院生物医学检验技术重点实验室，江苏苏州 215163)摘　要: 聚合酶链式反应（PCR ）分析仪以样品块（Block ）温度为控制对象实现样本温度控制，易产生热滞效应。

为减小管内迟滞，缩短样本的变温时间，该研究在利用有限元分析技术建立单孔样本热传导模型的基础上，构建一种融合初始温度-目标温度-等效热阻的三参数模型预测管内实际温度，实现PCR 过程管内温度实时跟踪。

根据模型精准预测管内温度，对样品块进行精准快速控温，大幅缩短升降温时间，降低了管内样品的传热迟滞。

实验结果表明，与管内实际温度相比，管内样品温度预测方法误差低于±1.5 ℃；样品块温度控制目标曲线优化后，管内温度迟滞时间缩短了27%以上。

该文提出精准控制温度过冲的优化方法在保证管内样本温度的基础上显著缩短了PCR 热循环整体时间，有利于实现更快速、更精准的核酸定量检测结果。

关键词: 聚合酶链式反应; 有限元分析; 温度预测; 温度优化中图分类号: R318.6; TB9文献标志码: A文章编号: 1674–5124(2023)11–0150–07Accurate estimation and rapid temperature control methods ofPCR temperature in tubeZHANG Yueye 1,2, YAO Jia 2, ZHANG Zhiqi 2, LI Jinze 2, ZHOU Lianqun 1,2(1. School of Mechanical and Electrical Engineering, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130022, China; 2. Key Laboratory of Bio-medical Diagnosis, Suzhou Institude of Biomedical Engineering andTechnology, Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, China)Abstract : The polymerase chain reaction (PCR) analyzer takes the sample block temperature as the control object to control the sample temperature, resulting in thermal hysteresis. To reduce the thermal hysteresis and shorten the temperature change time of sample, this paper is based on the establishment of single-hole sample thermal conduction model by the finite element analysis technique, a three-parameter model that fused the initial temperature-target temperature-equivalent thermal resistance is constructed to predicted the sample temperature in tube and achieve real-time temperature tracking in the PCR process. According to the predicted temperature in the tube, the temperature of the sample block is accurately and quickly controlled, which greatly shorten the heating and cooling time and reduce the heat transfer hysteresis of the sample in the tube. The收稿日期: 2023-02-11；收到修改稿日期: 2023-04-07基金项目: 国家重点研发计划资助项目（2022YFC2409300）；江苏省社会发展重点研究开发项目（BE2020768）；中国科学院生物医学检验技术重点实验室开放课题资助项目(A2023F001)作者简介: 张月业（1997-），男，河南台前县人，硕士研究生，专业方向为PCR 温度控制。

pcr教程研究生用

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（三）试剂的要求 1.引物：人工合成的单链DNA。
A：长度15-30bp，最好20-24 bp。 B：内部的互补序列。 C：引物间的互补序列。 D：序列的随机。 E：识别序列的单拷贝。 F：浓度：02-1μmol/L。 G：应纯化低温保存。
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2.DNA模板 A：量10-50ng左右。 B：纯，无污染。
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步骤 1.PCR扩增遗传标记特异性由特异性引物决定。 2.电泳分离PCR产物
A：凝胶：聚丙烯酰氨凝胶（polyacrylamide gel,PAG），
成分：丙烯酰氨与甲叉丙烯酰氨凝胶浓度（T）：6-8%，与分析的片段大小有关。
交联度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨与甲叉 B:载样缓冲液：甘油（蔗糖）密度重力，防扩散。
2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）增加膜通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋白质变性。
蛋白酶K酶解组蛋白。
3.有机溶剂：酚：变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。
氯仿：变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。
异戊醇：除酚，除泡沫。
4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。
2
（四）基本步骤 1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（0.2%）或细胞悬浮液。
3.DNA聚合酶 A：根据具体实验要求选择。60-
150/S,Taq DNA酶5ˊ-3ˊ外切酶活性。 1/300-18000错配。
B：注意外切酶活性，5ˊ-3ˊ或3ˊ-5ˊ。 C：活性最适温度70-75℃，半衰期一般 95℃40 min ；92℃130 min D：镁离子依赖。 E：低温保存。
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（四）常见问题与处理
泳速指示剂：溴酚蓝（5%，65bp）二甲苯青（5%，260bp）
C：电压：100-200V

研究生实验测序引物设计方法介绍及注意事项

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
• 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于 58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
• 6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
• 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（ meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm 为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。

实验23PCR扩增目的基因_基础生物学实验(安徽大学研究生复试用,生物生命科学)

实验二十三 PCR扩增目的基因一、实验目的了解用PCR方法体外扩增DNA的基本原理，掌握PCR技术的常规操作。

二、实验原理1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室K. Mullis等发明了一种DNA 体外扩增方法，即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。

这项重大的技术突破为分子生物学研究和基因工程发展提供了强大的工具，Mullis也因此获得1993年诺贝尔化学奖。

PCR技术的原理类似于原核细胞和真核细胞中DNA聚合酶催化下的DNA半保留复制过程。

以待扩增的DNA为模板，由与待扩增的DNA两侧互补的两个人工合成的寡核苷酸短链作引物，在DNA聚合酶和4种dNTP存在的情况下，经加热变性、降温退火和延伸，进行DNA的扩增。

多次重复类似循环能使微量的特异模板DNA得到极大程度的扩增(图24-1)。

1．变性：加热使待扩增的模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂形成两条单链，即变性阶段。

2．退火：降低体系温度，使人工引物在低温下(50～60℃)与待扩增的模板DNA片段按碱基配对原则特异性结合，形成部分双链，即退火阶段。

3．延伸：体系温度上升至中等温度(72℃)，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为原料，在引物的引导下催化合成互补的DNA，即引物的延伸阶段。

由变性、退火和延伸这3个基本步骤组成一轮循环。

理论上每一轮循环将使样品中的靶序列加倍，新合成的DNA又可作为下一轮循环的模板，结果产物将以指数速度扩增。

但实际反应中，DNA酶并非总处于最佳状态，而且引物退火也难以最大化，还有模板链变性分离不完全的问题，等等。

这些因素造成PCR效率达不到100%。

PCR效率公式可表示为：PCR产量=（初始模板量）×（1+%效率）循环数。

以此计算，在效率为70%的条件下，为实现106的扩增倍数，约需要26个循环，通常仅用几个小时就能完成。

2011 研究生3 PCR-STR实验

医学遗传学教研室
Department of Medical Genetics
短串联重复序列（短串联重复序列（short tandem repeats, STR) 特征：重复单位特征：重复单位2bp-6bp 实质也是一种VNTR 实质也是一种微卫星DNA 微卫星不宜用RFLP方法分析方法分析不宜用 PCR扩增没有优势扩增扩增没有优势扩增适用于降解DNA的鉴定的鉴定适用于降解
通过获得相关个体DNA片段或等位基因图片段(或等位基因通过获得相关个体片段或等位基因)图谱用于个体鉴定的一种技术以完全个体特异的DNA多态性为基础，其多态性为基础，以完全个体特异的多态性为基础个体识别能力足以与手指指纹相媲美，个体识别能力足以与手指指纹相媲美，极少有两个人完全相同，故称为指纹” 少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹” 指纹可用来进行个体识别及亲权鉴定等
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2. DNA遗传标记遗传标记是个体特异的碱基序列遵循孟德尔遗传规律遗传具有终身不变的遗传特征
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3. DNA指纹指纹(DNA fingerprint ) 指纹
实验三聚合酶链反应-短串联实验三聚合酶链反应重复序列分析技术
PCRPCR-STR
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一实验目的
掌握PCR-STR实验原理及实验方法实验原理及实验方法掌握
熟悉PCR-STR分析技术的应用分析技术的应用熟悉
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分子生物学考试知识点(研究生)

名词解释1、沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。

2、启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合，并启动转录的特定DNA序列。

至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。

3、复制子（replicon）：是从一个DNA复制起点开始的DNA复制区域，是独立完成复制的功能单位4、终止子(terminator T)：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。

5、增强子(enhancer)：指远离转录起始点、决定基因的时间和空间特异性、增强启动子转录活性的DNA序列。

其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。

6、操纵子：每一个由若干个结构基因及其上游的调控序列组成的转录区段，共同组成一个转录单位。

一个操纵子只含一个启动序列（promoter）及数个可转录的编码基因。

7、结构基因：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。

大多数真核生物结构基因的DNA 序列由编码序列和非编码序列两部分组成。

8、重复基因：指染色体上存在多数拷贝基因。

重复基因往往是生命活动最基本，最重要的功能相关的基因。

9、断裂基因：编码序列中间插入的无编码作用的碱基序列。

10、重叠基因：指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。

11、管家基因：在生物体中有些基因的表达在生命的全过程中都是必需的．是维持细胞最低功能所必不可少的基因．在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，这些基因称为管家基因。

12、跳跃基因（jumping gene）:转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumping gene）。

是那些能够进行自我复制，并能在生物染色体间移动的基因物质。

13、假基因(pseudogene)：一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

荧光定量PCR常见问题解析

荧光定量PCR常见问题解析荧光定量PCR是目前分子生物学研究中最常使用的技术手段之一，但很多初学者在做荧光定量PCR实验时都会遇到一些问题，为了更好地指导研究生的实验教学，结合我们实验室的经验，特将常见问题总结如下：一、什么样的试剂盒性能较好？性能较好的试剂盒熔解曲线出现单一峰，扩增特异性高，扩增“S”型曲线典型，CT 值较早出现。

目前Roche、ABI、Biog等的试剂盒性能都不错，反应特异性高，有效避免非特异扩增，提高实验效率。

二、熔解曲线出现多峰是什么原因？怎么解决？较为理想的熔解曲线是单峰曲线，如出现多峰有以下原因：1）非特异性扩增：主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高，可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度PCR 对引物退火温度（Tm值）进行优化，上调Tm值，选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂，提高核酸提取质量，等等。

2）引物二聚体可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。

引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。

引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请按照以下方面进行优化：A.优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。

通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60℃。

B.引物浓度太高，适当降低引物浓度。

通常引物的Tm低于目的基因，熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。

大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200 nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。

C.cDNA模板带有基因组DNA污染：重新制备cDNA模板。

在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理，然后逆转录为cDNA。

如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况，就要考虑及时更换试剂盒，避免耽误实验进度。

三、扩增曲线形状异常，如“S”型曲线反应体系引起的扩增曲线不光滑---扩增效率偏差（过高或过低）A. 扩增效率过高出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差，可能导致出现抑制PCR 反应的现象。

组织RT-PCR注意事项

1.抽提RNA都是为了得到其mRNA，而mRNA和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。

而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。

2.提取RNA前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna的降解。

研磨要充分，使组织块变小。

3.加入trizol后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与rna分离。

4.其次是注意外源性的rna酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。

操作速度要快，冰上进行。

我做过大鼠下丘脑组织的RT-PCR，在动物房将组织取好先放在RNa－free的EP管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的－70°冰箱内，在抽RNA的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善RNA抽提的质量。

用生理盐水或PBS冲洗掉血液，分切成50-100mg大小的组织块，早点把提RNA的试剂盒买过来就可以根据说明书加入变性液中（ep管内），－80储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。

如果试剂盒没到，那就直接放在EP管中，提RNA的时候再拿出来再加也可以。

就是组织可能会不容易撵碎一些。

我觉得你可以用高压过的EDPC处理的水进行清洗（2－3次），后迅速切成合适的大小的组织（具体大小与RNA提取方法相关，我用的是TRNZOL法，一般取50－100mg，）于EP管中，直接放到－80度冰箱，不需要液体浸泡！到时直接取出提取RNA即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好DEPC处理过！1.组织块若没有很多血液，可直接冻存；2.若有较多血液，可用生理盐水冲洗；3.我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗；4.一般1cm左右就可以，根据标本将来的用途。

5.直接原组织冻存。

本实验室做过人子宫内膜FGF基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组织，冻存与液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总RNA。

研究生《生物信息学》作业模板

研究生《医学生物信息学》作业班级：专业：姓名：一、实验目的:（1）掌握中文文献全文的检索和获得方法。

（2）掌握Pubmed数据库文献的检索和交大图书馆英文数据库全文的获得方法。

（3）掌握核酸序列搜索的方法。

（4）掌握核酸序列相似性分析的方法。

（5）掌握PCR引物设计软件的原理、使用及特点。

（6）掌握蛋白质序列搜索的方法。

（7）掌握蛋白质序列分析常用软件的使用方法。

二、研究背景:AIB1基因为近年来发现的p160类固醇受体转录共激活因子SRC-1家族成员，是新定义的一个原癌基因[1]。

该基因表达的蛋白在许多生物学过程中发挥重要作用，如细胞生长，增殖，分化，性成熟，女性生殖功能等[2]。

近年发现，该基因的表达异常与多种肿瘤的发生发展有关，以在乳腺癌中研究最多。

AIB1基因的高表达与乳腺癌的发生和发展有关[3]。

AIB1蛋白通过与雌激素受体相互作用，能强烈地增强雌激素受体的促进靶基因转录的效应，进而引起细胞增殖和肿瘤形成，此外，AIB1蛋白还在多条信号传导通路中发挥作用[4]。

AIB1基因(amplified in breast cancer1)又称为ACTR，TRAM1，RAC3，SRC3，NCoA3，P/CIP等。

本人选择其为研究对象。

三、实验方法、步骤及结果:1．在中国知网（CNKI）中查找中文文献：2．在PubMed中查找英文文献：登陆NCBI主页，网址：/guide/，选择gene数据库4. 使用NCBI网站中的BLAST工具进行序列比对登陆/，选择核酸序列比对nucleotide BLAST，界面显示如下，输入登录号，AF012108，点击“BLAST”。

结果如下：共有2条核苷酸序列和2条基因组序列和其匹配：第一条核苷酸序列为“Homo sapiens nuclear receptor coactivator 3 (NCOA3), transcript variant 2, mRNA”，登录号：NM_006534。

荧光定量PCR技术

本文作者屈晓超女士，西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室，生命科学与技术学院生物医学工程研究所硕士研究生;张镇西先生，博士、生命科学与技术学院副院长、教授、博士生导师。

关键词: 聚合酶链式反应(PCR) 荧光定量PCR(FQ-PCR)一引言核酸研究已有100多年的历史。

本世纪60年代末70年代初，人们开始致力于研究基因的体外分离技术。

1971年，Korana 最早提出核酸体外扩增的设想: “经过DNA 变性，与合适的引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程，便可克隆tRNA 基因”。

PCR 基本原理示意图 Cr 值的确立PCR技术的发明人为Kary Mullis。

他于1983年在一家生物高技术公司(Cetus)的人类遗传研究室工作。

该研究室的主要任务是为公司的其他实验室合成寡核苷酸。

当时有一种方法称为“DNA印迹法”，能够鉴定和比较DNA片段的长度，但是此方法步骤繁琐，时间周期长，还有放射性，Mullis很不喜欢这种方法。

他着手用简单的方法鉴定DNA片段。

经过一段时间的摸索，Mullis及同事于1985年成功地研制了PCR技术。

此方法在分子生物科学家中也引起了链式反应。

大家纷纷采用这个方法。

在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛应用，被许多科学家视为近十年来，分子生物学领域最重要的一项技术突破。

1993年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。

二聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种在短时间内大量扩增特定DNA片段的核酸扩增方法。

在介绍PCR之前，我们先简单回顾一下DNA的复制。

DNA是由四种碱基按互补配对原则(腺嘌呤A对胸腺嘧啶T，鸟嘌呤G对胞嘧啶C)组成的螺旋双链。

在细胞内，DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链，每个单链做各自模板，然后，另一种酶—RNA聚合酶合成一小段引物(Primer)结合到DNA模板上，DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链。

检验科pcr实习自我鉴定

竭诚为您提供优质文档/双击可除检验科pcr实习自我鉴定篇一：实验实习总结在这两年半的硕士研究生生涯里，从各位老师尤其是我的导师喻红教授和各位师兄师姐、师弟师妹那里学到了很多，这里面不仅有科研技术和理论知识，还包括很多为人处事的道理。

总之，两年多的时间里我成长了很多，懂得了很多，学到了很多，我明白这些对于我今后的人生都是一笔宝贵的财富。

还记得刚一进实验室的那段时间，本就好奇心重的我对什么都有兴趣。

师兄师姐们做实验时我都会从一边看着，不时的还会问很多问题。

有时我的问题很浅薄幼稚，但是师兄师姐们都一一详细地给我解答。

有时因为自己的知识积累不足，一时还听不明白，翻看文献的效率又是非常的慢，自己很是沮丧。

这时，导师和师兄师姐们就会开导并引导我一步一步来。

让我以最快的速度融入科研生活中来。

通过这两年半的磨练，我从一个刚入门的菜鸟逐渐成长为一个能单独完成各种实验的科研小能手。

比如：基因组DnA、总RnA的提取，引物设计，RT-pcR技术、荧光定量pcR技术，免疫组化技术，转基因小鼠的饲养与管理，动物取材与处理，细胞培养及w-bloting技术等。

尤其是荧光定量pcR技术，整板复孔之间误差基本能控制在绝对cT值0.2以下，得到了老师和师兄师姐的肯定和认可。

在这两年多的时间里，我也曾遇到过很多困难，面对不理想的实验数据和结果也曾沮丧懊恼过。

有段时间还一度怀疑自己的科研能力。

比如刚一上手引物设计的时候，有很多不懂的地方，设计出来的引物扩增效率不高，bLAsT方面的知识很多不会，不会摸退火温度条件等。

后来通过一步一步努力和别人的帮助，这些很快都能做的得心应手。

总之，一路走来让我成长了许多，学会了许多。

更是导师和同学帮我打开了科研世界的大门，面对这个有很多未知的世界我不知道我能走多远登多高，但是我想我不会轻言放弃。

在这里我要感谢我的导师喻红教授及其它亦师亦友的老师，还有这些朝夕相处的师兄师姐师弟师妹们。

**老师您好：我叫谢光辉，是武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学专业的一名硕士三年级学生，本科是武汉大学医学检验专业（5年制）。

生化-年研究生实验2 PCR检测apoB基因多态性

实验二：PCR检测apoB基因多态性
中山医学院生化教研室
实验内容
• 1、基因PCR（已完成）；
• 2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；
一、DNA琼脂糖凝胶电泳
1 原理
在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度5 2.0
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
2 实验材料及试剂
琼脂糖电泳缓冲液：1TAE（Tris acetate-EDTA buffer ） 6加样缓冲液（溴酚蓝/二甲苯青/甘油） EB染色液（溴化乙锭，ethidium bromide）
DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
3
1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
• 1 DNA分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢； • 2 构象：共价闭环DNA分子>直线DNA>开环双链DNA； • 3 凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢； • 4 电压：电压越高， DNA分子迁移越快； • 5 缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电荷。
Buffer不要用成H2O，称量相对准确
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的