乙型脑炎病毒E蛋白毕赤酵母表达系统的构建

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乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定作者：高淑娴，张伟，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建华，马文煜，徐志凯【Abstract】AIM: To construct gene encoding Japanese encephalitis virus (JEV) envelope glycoprotein and to express E protein in BL21(DE3). METHODS: Using RT PCR, the gene encoding E protein was amplified. The gene was cloned into pET28a(+) and the recombinant plasmid pET286His E was transformed into BL21(DE3). The 6HisE protein expressed in BL21(ED3) was determined by SDS PAGE and Western Blotting. The expression product in inclusion body was purified by Ni NTA chromatography. RESULTS: Sequencing of E gene revealed that the mutation rate was 0.2﹪(3/1500) and the base mutation didn t change the amino acid nonsense. The recombinant expression vector pET286His E was constructed and the 6His E protein was successfully expressed in an insoluble form. After expression and purification by metal chelate affinity chromatography, purified 6His E fusion protein was obtained. CONCLUSION: The E protein can be expressed in prokaryotic cell and would be useful for further research on the receptor of JEV and its infection mechanisms.【Keywords】encephalitis virus, Japanese; viral envelope proteins; recombinant fusion proteins【摘要】目的：构建乙脑病毒（JEV）E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法：采用RT PCR扩增片段,定向克隆入pET28a(+)中；重组载体pET28a6His E转化BL21(DE3),通过酶切、SDS PAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达；表达产物包涵体经Ni NTA亲和层析纯化. 结果：构建得到原核融合重组载体pET28a6His E；诱导后表达得到6His E融合蛋白，纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论：表达并纯化得到JEV E蛋白原核表达产物.【关键词】脑炎病毒，日本；病毒包膜蛋白质类；重组融和蛋白质类0引言流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）简称乙脑，是由嗜神经的乙脑病毒（JEV）所致的中枢神经系统性传染病［1］. JEV 属包膜病毒科黄病毒属，呈球型，直径20～30 nm，核心含单股RNA，有衣壳，有三个结构蛋白，即E蛋白、核蛋白C和膜蛋白M. E蛋白为糖蛋白，包裹在病毒的表面，它决定着病毒的毒力及其宿主范围，不仅在与宿主细胞受体结合及随后的膜融合中发挥重要作用，而且可刺激产生中和抗体［2］. 我们对E蛋白进行了原核表达、纯化及鉴定，为进一步研究病毒的受体和病毒的感染机制提供了有利条件.1材料和方法1.1材料pET28a(+)表达载体和XL10, BL21(DE3)宿主菌为本试验室保存. P1，P2引物合成及序列测定由三博远志生物技术有限责任公司完成；限制性内切酶、PMD18T，EX Taq聚合酶和连接试剂盒（宝航公司）；逆转录试剂盒（Invitrogen公司）；JEV鼠源性mAb和兔源多克隆抗体由本实验室制备；猴抗鼠红外标记二抗、羊抗兔红外标记二抗（Rockland公司）；红外成像系统（LI COR公司）；高速低温离心机（BECKMAN公司）；恒温摇床（上海智城公司）.1.2方法1.2.1片段的扩增及表达载体的构建用Trizol提取JEV RNA，以8 μL RNA为模板,1 μL P1为引物,1 μL dNTP 65℃水浴5 min,冰浴1 min, 2 μL 10×RT缓冲液,4 μL 25 mmol/LMgCl2,1 μL RNaseout Recombinant Inhibitor, 42℃水浴2 min；加1 μL superscriptTM混匀；42℃水浴50 s；70℃水浴15 min；加1 μL RAaseH混匀；37℃水浴20 min；将得到的产物进行PCR扩增，5′端引物：5′CGCTCGAGTTAAGCATGCATTGGTCGCTAA3′；3′端引物：5′CGGAATTCTTTAATCGTTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGAC 3′. 反应条件为：94℃5 min，94℃50 s；55℃1 min；72℃1 min 30 s, 30个循环，72℃15 min.10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收目的片段. 将回收的PCR产物克隆入PMD18T载体中转化Ecoli E..XL10感受态细胞，EcoRⅠ和XholⅠ酶切鉴定，阳性克隆送公司测序；测序正确后，EcoRⅠ和XholⅠ双酶切PMD18T E质粒和表达载体pET28a,回收目的片段,连接；转Ecoli E..XL10感受态细胞；挑克隆；提取质粒；酶切鉴定载体构建. 阳性克隆质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)；提取质粒；酶切鉴定；阳性克隆保留菌种.1.2.2工程菌的诱导表达及可溶性分析用载体构建成功的菌种划抗性平板，挑取单克隆在37℃培养至A600 nm为0.4～0.6，加入100 mg/L IPTG诱导4 h. 1000 r/min, 4℃10 min离心收菌. 弃上清后用PBS洗菌体，用去离子水重悬菌体. 加入2×SDS上样缓冲液进行样品处理. 另离心收集菌体，以溶液STE(50 mmol/L Tris﹒Cl (pH 8.0) ,1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl)重悬菌体，超声破菌（间隔10 s,超声8 s,共15 min）. 分别收集上清和沉淀，上清用5×SDS上样缓冲液处理，沉淀用1×SDS上样缓冲液处理后彻底重悬. 取上述各样品做SDS PAGE用2.5 g/L考马斯R25溶液室温染色2 h后脱色.1.2.3重组蛋白的鉴定同上取上清和沉淀样品分别进行处理并做SDS PAGE，随后将电泳蛋白转移到NC膜上（转移缓冲液：甘氨酸39 mmol/L,Tris碱48 mmol/L,SDS 3.7 mg/L,甲醇200 ml/L），100 V转移80 min 后用25 mmol/L TBS平衡NC膜10 min,用0.5 g/L的脱脂奶4℃封闭5 h ，用TBS·T洗膜3次,10 min/次，1∶200稀释JEV鼠源性mAb，1∶100稀释JEV兔源性多抗，4℃孵育过夜，然后用TBS·T洗膜3次，10 min/次，再与1∶2500稀释的猴抗鼠抗体和羊抗兔抗体分别孵育，4℃作用90 min后洗膜3次，10 min/次，然后进行扫描分析.1.2.4重组蛋白的纯化参照Qiagen公司镍离子亲和层析柱（NiNTA）操作说明进行. 离心收集500 mL诱导宿主菌，冰浴15 min；按5 mL/g湿菌的比例加入含8 mol/L尿素的缓冲液B(pH 8.0),室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃, 8563 g离心收集上清，弃去沉淀；将500 mL/L的Ni NTA树脂悬浮液1 mL与一定量的清亮裂解上清于室温轻柔混匀（100 r/min摇动60 min）后，将混合液装柱；收集穿过峰，留小样进行SDS PAGE；然后用缓冲液W(20 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗柱，再用缓冲液E(250 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脱，收集洗脱液. 取不同峰值样品进行SDS PAGE分析.2结果2.1重组表达载体的构建阳性重组质粒酶切产物在大小约1500 bp处出现条带（图1），与预期大小相符. 序列测定结果有三个碱基突变（第30位碱基C突变为T，第705位碱基A突变为G，第1298位碱基T突变为A），皆为无意义突变.M: DL2000 DNA marker; 1: 空pET28a; 2: pET28a E双酶切产物.图1pET28a E的酶切鉴定（略）2.2融和蛋白E的表达与溶解形式的分析经SDS PAGE检测，在Mr约53 000处有明显的条带，与预期的6HisE融和蛋白大小一致. 融和蛋白主要以包涵体形体存在于沉淀中，但上清中也有少量的诱导表达的融和蛋白. 薄层扫描显示其占菌体总蛋白的40%（图2）.M: 标准蛋白质marker; 1: 空pET28a未诱导细胞; 2: 空pET28a诱导细胞; 3: 重组载体pET28a E未秀导细胞; 4: 重组载体pET28a E诱导细胞; 5: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解上清; 6: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解沉淀.图2E蛋白的表达及可溶性分析（略）2.3融和蛋白E的大量表达及纯化利用Ni NTA agarose 柱通过金属螯合亲和层析进行纯化，从大肠杆菌BL21(DE3)表达菌体的沉淀中变性、纯化得到6His E融合蛋白. 纯化的蛋白经PEG4000浓缩后经透析除去尿素，应用紫外光吸收法定量分析表明获得蛋白的浓度约为0.759 g/L（图3）.2.4E蛋白的Western Blotting用Odyssey扫描，在预期大小处可见清晰条带，提示纯化的E蛋白较好地保持了与抗JEV的多抗和单抗的结合活性（图4,5）.M: 标准蛋白质marker. 1: 空pET28a未诱导细胞; 2: 空pET28a诱导细胞; 3: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解上清; 4: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解沉淀; 5~9: 纯化的融和蛋白.图36His E蛋白的纯化（略）1, 2: pET28a E诱导细胞; 3: pET28a E未诱导的细胞; 4: 空pET28a诱导的细胞; 5: 空pET28a未诱导的细胞.图4融合蛋白6His E的JEV多抗Western Blotting鉴定（略）1, 2: pET28a E诱导细胞; 3: pET28a E未诱导的细胞.图5融和蛋白6His E的JEV mAb Western Blotting分析（略）3讨论JEV与西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、登革病毒（Dengue virus, DV）同属黄病科黄病毒属成员［3］，其E蛋白有着与JEV E 蛋白有着相似的结构和功能，例如它们都有着三个结构域，即Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ［2，4］. 蛋白结构域Ⅰ主要承担着整个蛋白结构的形成；结构域Ⅱ包含一个融合环，推测其与病毒与宿主细胞的膜融合有关；而结构域Ⅲ则被认为是病毒与宿主细胞受体结构的部位［2，5］. Chu等［4］用WNV E 蛋白结构域Ⅲ蛋白不仅能抑制WNV对C6/36细胞、V ero细胞的侵入，还能够抑制DV2对这两种细胞的入侵.作为同属病毒它们有着很相似的结构和交叉的功能，但它们又有着种的特异性. 例如，研究已证明WNV E蛋白是三聚体，而不是像DV E 蛋白是二聚体，并且揭示和分析了WNV E蛋白的表位抗原位点［3］，揭示了DV2型E 蛋白晶体结构，明确了DV 2 E 蛋白各区的功能［4］. 另外，已有报道用黄病毒科的其他病毒的E蛋白和E蛋白Ⅲ区蛋白成功的筛选到受体蛋白或受体复合物［6-8］.目前JE仍然威胁着人类的健康，在亚洲国家每年仍有JE 50 000例，其中有10 000例死亡［9］. 然而关于JEV的致病机制到目前为止仍不明确. JEV的E蛋白在病毒与敏感细胞结合过程中起着重要的作用，JEV敏感细胞表面有病毒的相应受体，但其性质和结构尚未明确. 由于E蛋白的真核表达糖基化过多，严重影响了E蛋白的生物学活性，我们力图用原核表达系统表达E蛋白，在多次尝试不同表达载体与宿主菌之后，成功的构建了E蛋白的原核表达载体. 对原核表达产物的可溶性分析结果表明，表达的E蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体裂解后的沉淀中（占表达总量的95%左右）.表达的E蛋白经纯化后用SDS PAGE和Western Blotting 鉴定，结果表明其Mr大约为53 000,与预期大小一致；表达的E蛋白均能与JEV的单抗和多抗结合，表明其具有较好的反应原性. 实验中观察到E蛋白与多抗的结合要强于与单抗的结合，分析其原因，可能是由于多抗所针对的抗原表位多，而单抗只针对单一抗原表位，因此蛋白与单抗的结合受到一定影响.基金项目：国家自然科学基金（30400378）【参考文献】［1］冯国和,窦晓光,王玉梅，等. 流行性乙型脑炎DNA 疫苗研究新进展［J］. 国外医学流行病学传染病学分册，2005,(32):368-370.［2］Lin CW, Wu SC. A functional epitope determinant on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizing antibody combining sites ［J］. J Virol, 2003,77(4):2600-2606.［3］Kanai R, Kar K, Anthony K, et al. Crystal structure of West Nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes ［J］. J Virol, 2006,80(22):11000-11008.［4］Chu JJ, Rajamanonmani R, Li J, et al. Inhibition of West Nile virus entry by using a recombinant domain Ⅲfrom the envelope glycoprotein ［J］. J Gen Virol. 2005;86(Pt 2):405-412.［5］Modis Y, Ogata S, Clements D, et al. A ligand binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(12):6986-6991.［6］Reyes Del Valle J, Chavez Salinas S, Medina F, et al. Heat shock protein 90 and heat shock protein 70 are components of Dengue virus receptor complex in human cells ［J］. J Virol, 2005,9(8):4557-4567.［7］Chu JJ, Leong PW, Ng ML. Charaterization of plasma membrane associated proteins from Aedes albopictus mosquito(C6/36) cells that mediate West Nile virus binding and infection ［J］. Virology, 2005,339(2):249-260.［8］Reyes del Valle J, del Angel RM. Isolation of putative dengue virus receptor molecules by affinity chromatography using a recombinant E protein ligand ［J］. J Virol Methods, 2004,116(1):95-102.［9］Lin CW, Lin KH, Lyu PC, et al. Japanese encephalitis virus NS2B NS3 protease binding to phage displayed human brain proteins with the domain of trypsin inhibitor and basic region leucine zipper ［J］. J Virus Res, 2006,116(12):106-113.。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定赵付荣;华荣虹;王斌;陈娜莎;阿合买提·买买提;步志高【摘要】流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白.本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链.经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEV E蛋白结合.结果表明,所制备的抗JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2010(046)001【总页数】3页(P3-5)【关键词】乙型脑炎病毒;E蛋白;单克隆抗体【作者】赵付荣;华荣虹;王斌;陈娜莎;阿合买提·买买提;步志高【作者单位】新疆农业大学动物医学院,新疆,乌鲁木齐,830052;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;新疆农业大学动物医学院,新疆,乌鲁木齐,830052;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.6流行性乙型脑炎(JE)简称乙脑,是由乙型脑炎病毒引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

重组Ｅ蛋白。重组蛋白纯化后，经免疫印迹检测证明其具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原，建立了检测流行性乙型脑炎病毒抗体的ＥＥＩＡ诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，．ＬＳ
为ＪＶ的快速诊断、免疫猪群抗体监测和ＪＶ流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。ＥＥ关键词：乙型脑炎病毒；Ｅ蛋白；截短表达；间接ＥＩＡＬＳ
第３卷第３２期
２１年３月００
中国预
防兽
医学报
ＶＯ．２．１３Ｎｏ．３Ｍａ．２０１ｒ０
ＣｉｅｅＪｕｎｌｆＰｅｅｔｅＶｅｅｎｒｅｉｉｈｎｓｏｒａｏｒｖｎｉｔｒａｙＭｄｃｖｉｎｅ
中图分类号：￥５．５．８２６９６文献标识码：Ａ文章编号：１０．５９２１）３００．５０８０８（０００．２００
ＤｅｅｏｐｅｔｏｎｉｄｒｃＩＡｏｅｅｔｇａｔｏｉｓｖｌｍｎｆａｎｉｔＥＬＳｆｒｄｔｃｉｎｉｄｅｅｎｂ
流行性乙型脑炎病毒Ｅ蛋白的截短表达与间接ＥＩＡ诊断方法的建立ＬＳ
祖立闯，王金良，管宇，沈志强，ｐ，董林，李娇
（１山东绿都生物科技有限公司，山东滨州２６０；２山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州２６０）５６０．５６０

乙型肝炎表面抗原颗粒在毕赤酵母中的表达

乙型肝炎表面抗原颗粒在毕赤酵母中的表达
刘如石;邱义兰;杨坤宇;张智洪;梁良;张军;夏宁邵
【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》
【年(卷),期】2006(026)002
【摘要】毕赤酵母表达系统是一个高效异源蛋白表达工具，表达载体直接整合到酵母基因组上，可以产生遗传稳定的重组子，有类似于哺乳动物翻译后加工修饰的功能，可在成本低廉的无机盐培养基中进行高密度培养生产重组蛋白。

为提高重组菌株表达的稳定性，本研究选用毕赤酵母表达系统，成功地表达了22nm HBsAg 颗粒，为在毕赤酵母中开发生产乙肝疫苗提供了资料。

【总页数】2页(P143-144)
【作者】刘如石;邱义兰;杨坤宇;张智洪;梁良;张军;夏宁邵
【作者单位】410081,长沙,湖南师范大学生命科学学院;410081,长沙,湖南师范大学生命科学学院;361005,厦门,福建省医学分子病毒学研究中心;361005,厦门,福建省医学分子病毒学研究中心;361005,厦门,福建省医学分子病毒学研究中心;361005,厦门,福建省医学分子病毒学研究中心;361005,厦门,福建省医学分子病毒学研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】R392
【相关文献】
1.鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag10在毕赤酵母中的表达及鉴定
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3.修饰的含前S1、前S2免疫决定簇乙肝表面抗原融合多肽在毕赤酵母中的共表达
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5.羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原嵌合基因的构建及在毕赤酵母中的表达
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毕赤酵母表达系统资料整理

Mut+ 和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一A0X1及A0X2细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。

简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。

为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。

注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

在YPD酵母膏、蛋白豚、葡萄糖）培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h ° Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。

菌株GS115 > X- 33、KM71 和SMD1168 的区另I]GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。

GS115 > KM 71 ' SMD1168在组氨酸脫氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。

这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。

GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts （载体取代AX01基因），可以在MM和MD培养基上鉴定表型。

乙型脑炎病毒E蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用[发明专利]

专利名称：乙型脑炎病毒E蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用专利类型：发明专利
发明人：华荣虹,童光志,步志高
申请号：CN200810126290.9
申请日：20080730
公开号：CN101333248A
公开日：
20081231
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，还公开了该抗原表位多肽在防治和诊断乙型脑炎病毒中的应用，属于分子免疫学领域。

本发明所述的抗原表位多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的其中任意一种氨基酸序列。

将本发明JEV E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽作为免疫原或疫苗免疫动物机体后能够产生针对JEV的中和性抗体，并能够在体内或体外中和JEV，阻止病毒感染动物机体。

本发明抗原表位多肽或其连接物能够作为检测乙型脑炎病毒抗体或抗乙型脑炎病毒多肽抗体的试剂。

申请人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
地址：150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号
国籍：CN
代理机构：北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
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一种强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母及其构建方法与应用

一、概述乳铁蛋白是一种存在于哺乳动物乳汁中的重要蛋白质，具有丰富的营养价值和生物活性。

其在免疫调节、抗氧化、抗菌、抗病毒等方面具有重要作用，因此受到了广泛的关注。

而毕赤酵母是一种常见的真菌微生物，可以被用于多种重要蛋白的表达和生产。

构建一种强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母具有重要的研究意义和应用价值。

二、毕赤酵母的特点1. 毕赤酵母的生物学特性毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种酵母，通过改良的形态和工程学技术，可以高效表达和分泌异源蛋白，其优点包括a. 生长速度快b. 表达异源蛋白能力强c. 分泌蛋白质的能力优秀2. 毕赤酵母在蛋白表达中的应用毕赤酵母在蛋白表达中应用广泛，主要包括医药、工业、生物学等领域。

通过毕赤酵母表达系统，可以实现对多种重要蛋白的高效表达和大规模生产。

三、强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母构建方法1. 选择适合的毕赤酵母表达载体通过对不同毕赤酵母表达载体的筛选和比较，选取适合乳铁蛋白表达的载体。

2. 乳铁蛋白基因的克隆和插入通过PCR扩增、酶切、连接等分子生物学技术，得到乳铁蛋白基因的重组表达载体。

3. 转化和筛选将表达载体转化至毕赤酵母菌株中，进行筛选得到高效表达乳铁蛋白的毕赤酵母菌株。

4. 条件优化与表达通过调节培养基、温度、pH值等条件，优化乳铁蛋白的表达条件，提高其表达量和纯度。

四、强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母的研究进展1. 表达量和纯度的提高通过使用不同的表达载体、优化表达条件等手段，可以显著提高乳铁蛋白的表达量和纯度，满足不同应用的需求。

2. 抗性因子的引入引入抗性因子可以提高毕赤酵母对特定抗生素的抗性，从而提高其在生产中的稳定性和可操作性。

3. 结构与功能分析通过结构生物学等技术手段对乳铁蛋白在毕赤酵母中的结构和功能进行深入研究，为其应用提供理论基础。

五、强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母在食品、医药等领域的应用1. 食品领域强化乳铁蛋白表达的毕赤酵母可以用于生产高营养价值的乳制品，如乳粉、奶酪等，提高其抗菌、抗氧化等功能。

毕赤酵母表达蛋白步骤

毕赤酵母表达蛋白步骤一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。

其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。

本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。

二、构建表达载体毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。

首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。

然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。

同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。

三、转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。

转化方法包括电击转化、化学转化等。

其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。

转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。

四、表达蛋白经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。

接下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。

常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。

五、蛋白纯化在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。

同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。

六、蛋白鉴定和功能分析蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。

常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。

功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。

七、应用和展望毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。

通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。

乙脑病毒E蛋白基因的克隆、表达及纯化的开题报告

乙脑病毒E蛋白基因的克隆、表达及纯化的开题报告一、选题背景和意义乙型脑炎（简称乙脑）是一种由乙型脑炎病毒引起的急性传染病，常常表现为中枢神经系统炎症。

该病在我国发病率较高，尤其在南方地区更为普遍，给人民群众的生命健康和经济发展带来了很大的危害。

目前，乙脑的防治措施主要集中在疫苗的研制和治疗手段方面。

因此，对乙脑病毒的研究具有重要的科学意义和社会价值。

病毒的基础研究对于新型疫苗和药物研发、乙脑病毒流行病学特点的研究以及病原学机制的探究等方面具有重要的促进作用。

基因工程技术的发展为病毒研究提供了新的手段和方法。

其中，病毒的主要蛋白基因的克隆、表达和纯化是病毒分子研究比较重要的一步。

针对乙脑病毒，E蛋白是一种重要的抗原，因此对其进行研究具有重要的理论和实践价值。

二、研究目的本研究的目的是克隆、表达和纯化乙脑病毒E蛋白基因，为后续的研究提供基础材料和方法支持，为乙脑的防治提供有力的科学依据。

三、研究内容1. 乙脑病毒E蛋白基因的克隆：采用PCR技术从乙脑病毒基因组中扩增目的基因，并进行酶切连接到表达载体上。

2. 表达乙脑病毒E蛋白基因：将目的基因表达于大肠杆菌中，并利用蛋白印迹检测方法鉴定表达蛋白。

3. 纯化表达的乙脑病毒E蛋白基因：利用亲和层析技术和离子交换层析技术分离纯化表达出的乙脑病毒E蛋白。

四、研究方法1. 基因克隆：利用PCR扩增乙脑病毒E蛋白基因，并进行酶切连接到表达载体上。

2. 表达乙脑病毒E蛋白基因：将表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，利用IPTG诱导表达乙脑病毒E蛋白基因，并利用蛋白印迹检测方法鉴定表达蛋白。

3. 纯化表达的乙脑病毒E蛋白基因：利用His标签对表达的乙脑病毒E蛋白进行亲和层析，再利用离子交换层析技术分离纯化目的蛋白。

五、预期结果和意义通过本研究，预计可以成功克隆、表达和纯化乙脑病毒E蛋白基因。

通过对E蛋白的研究，进一步认识乙脑病毒的病理机制及其与宿主细胞的相互作用，从而提供新的思路和方法，为乙脑的防治提供有力的科学依据。

乙脑E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区融合酵母表达载体的构建

乙脑E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区融合酵母表达载体的构建葛菲菲;邱亚峰;杨耀武;陈溥言【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2005(25)B04【摘要】构建乙型脑炎E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosis hear shock protein70,Mt．hsp70)的肽连接区(Binding domain)基因融合表达载体,利用酵母表达系统,为下一步研究肽连接区是否能增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性作准备。

以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建,以酶切位点BamHI连接这2个基因,用电穿孔法转化酵母X-33,Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。

E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为 68kDa,与实际大小相符且为分泌表达,表达量约为97mg／L,经Western印迹验证,抗原性较好。

将用同样的酵母表达载体表达的乙脑E蛋白主要抗原片段(另文发表)与上述融合蛋白均以50pmol．的量分别对6-8周龄的:BALB／c小鼠进行腹膜内注射,3周后进行第二次免疫,从淋巴细胞的增殖和抗体滴度两个方面进行比较,最后得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比乙脑E蛋白主要抗原片段效果要好,在试验中肽连接区可以增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性。

【总页数】5页(P244-248)【关键词】乙脑E蛋白主要抗原片段;结核杆菌hsp70肽连接区;巴斯德毕赤酵母;淋巴细胞的增殖【作者】葛菲菲;邱亚峰;杨耀武;陈溥言【作者单位】南京农业大学动物医学院传染病组农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室;中国预防医学科学院【正文语种】中文【中图分类】Q782;S572【相关文献】1.乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达 [J], 葛菲菲;邱亚峰;杨耀武;高小飞;陈溥言2.人源乙型肝炎病毒表面抗原抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体的筛选 [J], 罗荣城;尤长宣;韩焕兴;胡栋平;王传斌;苏瑾3.人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αA-干扰素融合蛋白原核表达载体的构建 [J], 郑伟4.G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析 [J], 刘波;孙泽强;刘庆勇;陈杰;王司军;杨广笑;王全颖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

毕赤酵母内源蛋白表达系统发酵优化策略

毕赤酵母内源蛋白表达系统发酵优化策略随着生物技术和生物医药行业的快速发展，蛋白表达成为了研究和生产领域中一个至关重要的环节。

毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种有效的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白表达、酶制备等领域。

本文将从毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略进行探讨，以期为相关研究提供一定的参考和借鉴意义。

一、毕赤酵母内源蛋白表达系统简介毕赤酵母是一种酿酒酵母，具有真核生物和原核生物的特点，具有许多原核和真核表达系统的优点。

Pichia pastoris作为一种高效的真菌表达系统，广泛应用于蛋白质表达、酶制备、重组激素和疫苗生产、抗体工程等领域。

毕赤酵母在高密度、大规模表达的过程中具有许多优点，例如可以利用化石燃料产生的甲醇为碳源并利用氧化酶将甲醇作为能源，这使得它在蛋白质大规模表达中的应用有了很大的便利；其次methylotrophic yeast P.pastoris是一种易于操作的槽稠传播。

分泌蛋白在生成后由细胞外酶直接切割。

得到的目的蛋白质易纯化和分离。

由于其许多优点，毕赤酵母内源蛋白表达系统在生物技术和制药行业中受到极大的关注。

二、毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略（一）基础培养基的选择在毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵过程中，培养基的选择对于蛋白质的表达和纯化至关重要。

通常情况下，毕赤酵母内源蛋白表达系统常用的基础培养基包括YPG液体培养基、BMGY培养基和BMMY培养基。

其中，BMGY培养基在毕赤酵母的扩大培养和生长过程中被广泛应用，其主要成份包括酵母抽提物（yeast extract）、复合酵母粉（peptone）、甘油（glycerol）和缓冲盐溶液等。

而BMMY培养基主要用于毕赤酵母内源蛋白表达系统的诱导表达过程，其主要成份包括酵母醣（yeast extract）、蛋白胨（peptone）、抗泡剂（anti-foaming agent）以及甲醇（methanol）等。

乙脑病毒E蛋白在大肠杆菌中的水溶性表达及优化

乙脑病毒 E蛋白在大肠杆菌中的水溶性表达及优化摘要：本研究采用聚合酶链反应( PCR)扩增出乙型脑炎病毒( JEV) E蛋白基因, 并进一步克隆入原核表达载体pMBP-C, 经测序验证无误后转化大肠杆菌BL21 Gold表达乙型脑炎病毒E 蛋白。

经异丙基巯基半乳糖( IPTG)诱导表达后, 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)分析表达产物，表达量约占菌体上清液总蛋白的40 %，分析证实确为乙型脑炎病毒E蛋白且有生物学活性。

本研究为实验室制备乙型脑炎病毒E蛋白诊断抗原和为今后研制乙脑分子诊断试剂盒和基因工程疫苗打下了基础。

关键词：脑炎病毒； E 蛋白；基因表达；大肠杆菌；优化流行性乙型脑炎(乙脑)病原体为乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)，简称乙脑病毒，又称日本脑炎病毒[1]。

乙脑病毒经蚊子(库蚊、伊蚊等)叮咬后在禽畜和人类之间相互传播（有报道认为蠓、螨、蝙蝠也可能是传播媒介)。

该病主要流行于远东及东南亚, 每年导致约50000 人患病, 其中约10000人死亡。

而我国作为乙脑发病人数最多的国家, 年发病数大概1万例。

研究发现，JEV有3种结构蛋白：核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)、囊膜糖蛋白(E)；7个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)[2]。

E蛋白为JEV的主要结构蛋白, 含500 个氨基酸残基，其分子量约为53kDa。

作为病毒粒子表面最重要的结构成份，E蛋白是主要的毒力抗原，参与病毒复制的许多过程，包括结合受体、膜融合和毒粒包装等[3,4]。

因此，人们一直以来重点研究E蛋白。

过往研究发现，E蛋白含有3个抗原域：域Ⅰ包含130个氨基酸残基, 拥有血清学及生物活性的抗原表位；域Ⅱ包括181个氨基酸残基，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；域Ⅲ包括100 个氨基酸残基, 参与受体结合过程[5,6]。

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。

转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。

在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。

载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。

如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。

单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。

乙型肝炎病毒PreS2S基因在毕赤酵母中表达的研究

ｐａｍｉｆＰＬ－／ｒＳＳｈｓｂｅｏｓｒｃｅｕｃｓｆｌｎｅｕｎｅａａｙｉｓｇｅｔｄｔａｈｎｅｔｄｆｒｌｓｄｏＨＩ — Ｄ２Ｐｅ２ａｅｎｃｎｔｕｔｄｓｃｅｓｕｌａｄｓｑｅｃｎｌｓｕｇｅｈｔｔｅｉｓｒｅｏ — ｙｓｓ．
达。通过ＰＲ扩增获得Ｐｅ２段，入含ＡＸＣｒＳＳ片插ＯＩ启动子的ＰｃｉＰｓｏｉ表达载体ＰＬＤ中，建重组ｉａａｔｒｈｓＨＩ— ２构表达质粒ＰＬＤ／ｒＳＳ转化酵母宿主菌Ｇ１５ＨＩ — ２Ｐｅ２，Ｓ１。挑取阳性克隆摇床培养，醇诱导表达。通过ＥＩＡ、甲ＬＳＲＨ鉴定表达产物。成功构建了ＰＬＤ／ｒｓｓ真核表达载体。过序列分析，入的基因为在中国流行ＰＡＨＩ— ２Ｐｅ２经插的ａｒｄ亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了Ｓ蛋白，白的表达量为３．／Ｐｅ抗原检测为强阳性。Ｓ蛋４９ｍｇＬ，ｒ利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的Ｐｅ２ｒＳＳ蛋白，ｒＳＳ蛋白具有良好的生物学活性。Ｐｅ２
ＡｂｔａｔＩｒｅｏｃｎｔｕｔｒｃｍｂｎｎｌｓｄＰＬＤ２Ｐｅｚｎｘｒｓ－ｓｒｃｎｏｄｒｔｏｓｒｃｅｏｉａｔｐａｍｉＨＩ — ／ｒＳＳａｄｅｐｅｓＩＢＶｒｓｚｅｅｉｃｉＩＰｅＳＳｇｎｎＰｉｈａｐｓｏｉ，ｔｅＰｅ２ｅｅａｌｉｙＰｒｍａｔｒｓｈｒＳＳｇｎｍｐｉｅｂＣＲｆｏＰＭＤ一８ＳＳｗａｓｒｅｎｏｔｅＰ．ａｔｒｓｅｐｅｓｏｅｔｒｆｄ１Ｔ／ｚｓｉｅｔｄｉｔｈｐｓｉｘｒｓｉｎｖｃｏｎｏＰＬＤ２ｃｎａｎｎＨＩ－ｏｔｉｉｇＡＯＸ１ｐｏｔｒｒｍｏｅ．ＴｈｅｏｉａｔｅｐｅｓｏｌｍｉｅｒｃｍｂｎｎｘｒｓｉｎｐａｄＰＨＩ－／ｒＳＳｗａｏｓｒｃｅｎｓＬＤ２Ｐｅｚｓｃｎｔｕｔｄａｄｔａｆｒｄｉｔ１５．Ｔｈｏｉｉｅｔａｓｏｍａｔｒｎｕｅｙｍｅｈｎ１ｆｒｔｅｅｐｅｉｎｏｈｅＳｒｎｏｍｅｏＧＳｓｎ１ｅｐｓｖｒｎｆｒｎｓｗｅｅｉｄｃｄｂｔａｏｏｈｘｒｓｏｆｔｅＰｒｔｓｇｎ．ＰｏｕｔｆｅｈｎｕｔｎｗｅｅａａｙｅｔｅｅｒｄｃｓａｔｒｔｅｉｄｃｉｒｎｌｚｄｗｉＥＬＩＡｎＨＡ．ＴｈｅｕｔｈｗｅｈｔｒｃｍｂｎｎｏｈＳａｄＲＰｅｒｓｌｓｏｄｔａｅｏｉａｔｓ

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

［图分类号］Ｑ８３２１中７；Ｒ９．
［文献标识码］Ａ
［章编号］１０ — ０２２１）３０４ — ５文０９００（０１ — ３４００
ＣｏｔｕｃｉｎｆｔｅｎｓｒｔｏｏｈＲｅｏｂｎａＡｔｅｕｅｃｍｉｎｔｔｎａｔｄＳｌｏｅｌｔｐｈｍｕｒｕａｍｎｌａｙｉｉｍ
ｉｔｘｒｓｉｎｖｃｏＹＡ３４１ｈｅｏｉａｔｐａｍｉＹＡ３４－ｓｅｅｔ－ｒｎｆｒｄｉｔｔｎａｅ．－ｎｏｅｐｅｓｏｅｔｒｐ３．Ｔｅｒｃｍｂｎｎｌｓｄｐ３１ＥｗａｌｃｒｔａｓｏｍｅｎｏａｔｕｔｄＳｔｏｅｙ
ｐｅｓｇｔｅＥａｔｅｆＪｐｎｓｎｅｈｌｔｉｓＪｒｓｉｈｎｉｎｏａａｅｅｅｃｐａｉｓｖｒ（ＥＶ）ｎｇｉｕ．Ｍｅｈｄ：ＴｅＥｅｅｏＥｓｃｏｅｎｎｅｅｔｏｓｈｇｎｆＪＶｗａｌｎｄａｄｉｓｒｄｔ
（失ａｄｃａｃ缺ｓ、、ｒｙｐ基因）获得重组疫苗菌株Ｘ５０ｐＡ３１Ｅ）鉴定重组菌Ｅ蛋白的表达，定重组菌的稳定，４５（Ｙ３４一；测
性、长曲线、全性，生安以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果：切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功；酶ＳＳＰＧ检测有目的蛋白条带；ｓｒ印迹证实表达的Ｅ蛋白能与猪抗ＪＶ阳性血清特异性结合；重组菌株在Ｄ－ＡＥＷｅｔｅｎＥ

流行性乙型脑炎病毒SA14142株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产..

２００３。

１９（５）中国人兽共患病杂志ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｎ∞ｅｓ３２ａ（＋）／ＢＬ２１诱导对照，ＢＬ２１诱导对照和未诱导的ｐＥＴ—Ｅ／ＢＬ２１对照。

各取出ｌｍｌ，１２０００ｒ／ｒａｉｎ离心３０ｓ，弃上清，沉淀加１００出１×ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳上样缓冲液重悬，１００＂（２变性３ｍｉｎ，然后上样行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳。

１２９表达产物的纯化和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ取１００ｍｌ经ＩＰＴＧ诱导表达的ｐＥＴ—Ｅ／ＢＬ２１菌液，按照Ｈｉｓ·ＢｉｎｄＰｕｒｉｆｉｅａｔｉｏｎＫｉｔ说明书进行纯化，然后将纯化后的表达产物参照文献【１０Ｊ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．最后加入ＤＡＢ底物液显色并拍照。

２结果２１ＲＴ—ＰＣＲ结果从Ｖｅｍ细胞培养的乙脑病毒中提取ＲＮＡ，并以此为模板进行ＲＴ—ＰＣＲ，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有一条大小为１．１ｋｂ左右（１１３１ｂｐ）的电泳带（图２），与预期大小相符。

该扩增片段包括了Ｅ蛋白基因上游Ｍ蛋白基因的３３个核苷酸。

围１重组表达载体ｐＥＴ—Ｅ的构建ｎｇⅡｒｅ１Ｃｏｍｔｒｕｃｔｌｏｎｏｆｒｅ∞ｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｇｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ２．２重组克隆载体的鉴定将目的片段和克隆载体ｐＵＣ一１９的连接产物转化ＤＨ５ａ，３７１２培养过夜后挑取单个菌落。

小量提取质粒后用ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ双酶切消化。

经琼脂糖凝胶电泳检测，可见两条大小分别为２．７ｋｂ和１．１ｋｂ左右的片段（图３），与预期结果相符。

将该重组克隆载体命名为ｐＵＣ一１９一Ｅ。

圈３克隆裁体ｐＵＣ－１９一Ｅ的酶切鉴定Ｆｉｇｕｒｅ３ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｈｌｅｎｔｉｆｌｅａｔｌｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｖｅｃｔｏｒｐＵＣ一１９一ＥＡ．Ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；Ｂ．ｐＵＣ一１９一ＥｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩａｎｄＨｉｎｄⅢ；Ｃ．Ｍａｒｋｅｒ（ＤＬｌＳ０００）．２３测序与序列分析通过将ＲＴ－－ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ载体中进行序列测定，结果（图４）如下：扩增的目的基因全长１．１ｋｂ（１１１３ｂｐ），共编码３７１个氨基酸，利用计算机软件ＤＮＡｓｔａｒ进行序列比较发现：该基因片段与减毒株ＳＡｌ４—１４—２、强毒株ＳＡｌ４、标准强毒株ＪａＯＡｒＳ９８２碱基序列同源性ｌ’‘。

毕赤酵母表达步骤

毕赤酵母表达系统的构建1.确定转入的目的基因，并设计相应引物，进行PCR反应，获取目的基因片段。

（所需药品-高保真酶，引物，dntp，胶回收试剂盒。

）2.对目的基因及载体Ppic9k进行酶切产生粘性接头并纯化回收。

（所需药品- SalI、StuI、SacI 【用于于GS115产生His+Mut+】；BglII【用于于GS115产生His+Muts】）酶切体系酶切体系50 μL目的DNA 10 μL酶切缓冲液 5 μL限制性内切酶 1 μL超纯水34μL37 ℃酶切 1～4小时。

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

3.将酶切正确的目的片度与质粒相连（所需药品-连接试剂盒SolutionⅠ[宝生物]）载体DNA0.5µL目的片段DNA 4.5µL连接试剂盒SolutionⅠ 5 µL充分混匀，置于16 ℃连接4 h或4 ℃连接过夜。

4.转入DH5α扩繁质粒（所需药品- A mp；DH5α；CaCl2）将DNA目的片段和载体的连接产物与200µL感受态细胞混匀，冰浴30min。

45℃热击45-60s，冰浴3min后加入800μL LB 液体培养基37℃震荡培养1h。

（1 ）转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul A mp 的LB平板上，选择A mp 抗性克隆（2）挑取10 个A mp 抗性转化子，接种含150ug/ul A mp 的培养基，37 度振荡培养过夜（3 ）提取质粒进行PCR及酶切检测并送交测序。

（pPIC9k 测序时，用α-factor 引物及3’AOX1 测序引物。

将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul 溶液）4 在0.85ml 过夜培养菌液中加入0.15ml 灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入标记好的储存管中。

在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70 度保存。

5 测序证实结构正确后，可准备转化DNA5.毕赤酵母电转化：细胞准备：毕赤酵母感受态制备：（1）取1 mL GS115过夜培养物(OD6006．0～10．0)转接于100 mL YPD液体培养基中28℃-3O℃、250—300 r／min培养至酵母菌的对数生长期(OD600 1．0～1．3)（2）取此菌1 mL分装到1．5 mL EP管中，4℃、10 000 g离心1 min，弃上清液，沉淀用无菌水(4℃预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。

（生物化学与分子生物学专业论文）人Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及表..

人ｎｅｕｆｉｔｉｎ毕赤酵母表达系统的构建及表达产物的功能研究结果３．１重组穿梭质粒ｐＰＩＣ９Ｋ—ｎｅｕｒｉｔｉｎ的鉴定３．１．１ＰＣＲ扩增产物ｎｅ埘ｔｉｎ片段的鉴定以ｐＰＩＣ９Ｋ－ｎｅｕｒｉｔｉｎ质粒为模板，Ｐｌ／Ｉ＇２为引物扩增ｎｅｕｒｉｔｉｎＯＲＦ，电泳结果显示在约４４０ｂｐ处出现特异性条带，与预期结果一致（图２）。

图２ＰＣＲ扩增产物ｆｌｅｕｒｉｔｉｎ的鉴定泳道ｌ：ＤＮ＾Ｍａｒｋｅｒ泳道２—６：Ｎｅｕｆｉｔｉｎ的ＰＣＲ产物泳道７：阴性对照（ＰＣＲ反应未加模板）３．１．２阳性转化子的菌落ＰＣＲ鉴定从氨苄青霉素ＬＢ琼脂培养基平板上随机挑取单菌落作为模板，Ｐ１／Ｐ２为引物进行ＰＣＲｊｉｆ＂增。

琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示：第２、３、４、５、６、７泳道均在４４０ｂｐ处扩增出特异性条带（图３），表明挑选的五个单菌落均为阳性转化子，ｎｅｕｒｉｔｉｎ基因片段已插入质粒ｐＰＩＣ９Ｋ中。

人ｍｍｒｉｔｉｎ毕赤酵母裹达系统的构建及裹达产物的功麓研究圈３ｐＰＩＣ９Ｋ－ｎｅｕｒｉｔｉｎ重组转移载体的Ｐ勰鉴定泳道ｌ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ泳道２＿＿７：菌落ＰＣＲ产物泳道８：阴性对照（ＰｃＲ反应未加模板）３．１．３测序结果分析将测序结果与ＧｏｎＢａ．ｋ收录的序列号（ＮＭ０１６５８８）ｎｅｕｒｉｔｉｎ的核苷酸序列进行比对，结果显示与Ｇ∞ＢａＩｌｌ【奠丛．Ｑ！§５婴：２序列同源性１００％，证明重组子ｐＰＩＣ９Ｋ－ｎｅｕｒｉｔｉｎ召＂有读框正确的ｎｅｕｒｉｔｉｎ基因。

测序结果如图４所示。

一。

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毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法

一、概述毕赤酵母是一种常见的真菌，它在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。

在这些领域，研究人员经常需要对蛋白质进行糖基化修饰的研究，而毕赤酵母表达系统正是其中的一种重要工具。

本文将就毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法进行介绍。

二、毕赤酵母表达系统简介1. 毕赤酵母表达系统的原理毕赤酵母表达系统是指利用毕赤酵母表达载体，将目标蛋白基因导入毕赤酵母中，使其在毕赤酵母中进行表达。

该系统具有高度的复制和表达效率，能够在较短的时间内高效地产生目标蛋白。

2. 毕赤酵母表达系统的优势和应用毕赤酵母表达系统具有许多优势，例如能够进行大规模的表达，提高了蛋白质的产量；同时也能够实现正常的翻译后修饰以及蛋白折叠功能。

在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用，如药物开发、生物能源等领域。

三、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法1. 利用质粒表达毕赤酵母表达载体中含有丰富的糖基化因子，对于糖基化位点的研究提供了便利。

研究人员可以将目标蛋白基因克隆至毕赤酵母表达载体中，通过大规模的表达筛选，筛选出糖基化位点进行研究。

2. 利用质粒诱导表达研究人员还可以通过对毕赤酵母进行质粒诱导，使其表达特定的糖基化酶，从而实现对特定蛋白质的糖基化位点的研究。

这种方法能够有效地降低研究成本，是当前常用的研究手段之一。

3. 基因敲除或过表达最近，基因敲除或过表达技术在毕赤酵母的研究中得到了广泛的应用。

研究人员可以通过敲除特定的糖基化酶基因或过表达其基因，从而实现对糖基化位点的研究。

这种方法能够帮助研究人员更深入地了解糖基化位点在蛋白质功能中的作用。

四、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点研究的意义1. 为蛋白质功能研究提供重要依据研究糖基化位点能够帮助人们更深入地了解蛋白质的结构和功能。

糖基化位点通常与蛋白质的功能密切相关，通过研究糖基化位点，可以为蛋白质功能的研究提供重要的依据。

2. 为药物研发提供理论支持糖基化位点在药物研发中也有着重要的意义。

许多药物的研发过程中需要考虑蛋白质的糖基化修饰，因此对糖基化位点进行研究能够为药物研发提供理论支持。

毕赤酵母表达系统简介

巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。

酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。

以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。

作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。

表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。

它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。

当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。

含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。

1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。