缺血性脑卒中患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变的研究 Genetic Mutations of Homocysteine Meta

遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#!$%!#&!$!&&’研究报告收稿日期!!&&!()&()*"修回日期!!&&#()&()#作者简介!吴军民!)$*!("$男$澳门人$硕士$住院医生$专业#脑血管病%+,-./0#1233/435"!)63768-通讯作者!周天鸿!)$9"("$男$福建人$教授$博导$专业#遗传学%+,-./0#:;:<"=3>721>763缺血性脑卒中患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变的研究吴军民)!王彤歌)!李月琴!!宋雪文)!刘咏仪)!云泓若!!钟振宇!!周天鸿!!)?暨南大学医学院附属第一医院$广州9)&"#&&!?暨南大学生命科学技术学院$广州9)&"#!"摘!要!为研究同型半胱氨酸代谢相关酶亚甲基四氢叶酸还原酶!/&!0#"基因@"**A 和胱硫醚,!,合成酶!@B C "基因A %##@位点碱基突变与缺血性脑卒中的关系$对*’例缺血性脑卒中患者和%#例健康对照者$采用聚合酶链反应(限制性片段长度多态性!D @E ,E F G D "技术检测/&!0#基因@"**A 基因型$用扩增阻滞突变体系法!H E I C "检测1)(基因A %##@突变%实验检出患者组/&!0#基因&纯合基因型’杂合基因型和&等位基因频率分别为!?*J ’9)?’J 和!%?’J $对照组分别为)?!J ’#$?%J 和!)?)J %患者组1)(基因1纯合基因型和1等位基因频率分别为)#?9J 和’#?$J $对照组分别为"?&J 和#%?&J %I >0:/K 02G 85/4:/6E 25L 244/83分析显示#@"**A 位点&等位基因$A %##@位点1等位基因以及年龄均与缺血性脑卒中发病有关!2"&?&9"$@"**A 位点&等位基因的比值比!M E "为)?*’!$9J@N )?&"!!?%""和A %##@位点1等位基因的比值比为)?*#!$9J@N )?&*!(!?%)"%实验显示/&!0#@"**A 和1)(A %##@基因位点突变与缺血性脑卒中发病有关$上述两个基因位点突变可能是缺血性脑卒中发病的遗传因素%关键词!缺血性脑卒中&胱硫醚,#,合成酶&亚甲基四氢叶酸还原酶&基因突变&基因频率中图分类号!O $%*!!!文献标识码!H !!!文章编号!&!9#($**!!!&&’"&#(&!$%(&9!"#"$%&’($)$%*#+*,-*.*&/+$"%#"’"$)0*1%+.2"1)$"34#5/."+%#6)$%"#$+7%$89+&8".%&:$;*<"P Q R >.3,I .3)$SH P Q A 835,Q 2)$G NT >2,O /3!$C M P Q U >2,S 23)$G H M S 235,N )$T V P W 835,E >8!$X W M P QX <23,T >!$X W M V A /.3,W 835!!)?$*34567*-689:*;58<8.=$0+5>6!8>3+64<’99+<46*?@+6A/*?+B 4<18<<*.*89C +-4-D -+E *5>+6=$F ;4-.G A 8;9)&"#&$1A +-4&!?18<<*.*89H +9*(B +*-B *4-?&*B A -8<8.=$C +-4-D -+E *5>+6=$F ;4-.G A 8;9)&"#!$1A +-4"=0+$;)&$#A 84:>1Y5232:/6->:.:/8348Z-2:<Y 0232:2:L .<Y 1L 8Z 80.:2L 21>6:.42!/&!0#"@"**A.316Y 4:.:</83/32,#,4Y 3:<.42!@B C "A %##@L 20.:21:8<8-86Y 4:2/32-2:.[80/4-/3K .:/23:4\/:</46<2-/64:L 8]2$:<2/&!0#5232@"**A 5232->:.:/83.31:<2@B CA %##@5232->:.:/83\2L 212:26:21[Y D @E ,E F G D8LH E I C-2:<81/3*’K .,:/23:4\/:</46<2-/64:L 8]2.31%#38L -.0K 28K 02Z 8L 683:L 807E 24>0:44<8\21:<.::<2Z L 2^>236/248Z /&!0#5232A <8-85232:/6:Y K 2!!?*J "$<2:2L 85232:/6:Y K 2!9)?’J ".31A.00202!!%?’J "/3/46<2-/65L 8>K \2L 2</5<2L :<.3:<842/3683:L 805L 8>K !)?!J 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C(基因错义突变是引起其酶缺乏或活性降低的主要机制##%&本研究旨在探讨中国人/&!0#基因@"**A和1)(基因A%##@位点突变与缺血性脑卒中的关系&)!材料和方法?@?!研究对象选取)$$$年)!月至!&&&年)!月我院神经内科住院的缺血性脑卒中患者*’例$其中男’$例$女!9例$年龄#9!%!岁$平均’"9?9‘$?!(岁$均为南方汉族人$均经临床检查和@A或IE N检查确诊$诊断符合中华神经科学会第四届全国脑血管病学术会议修订的)各类脑血管疾病诊断要点’)$$9(*标准$有肝+肾+甲状腺疾病+心脏瓣膜病和糖尿病$以及由感染性疾病+血液病+外伤性及其他物理因素+药物等所致的缺血性脑卒中病例均除外&对照为同一时期我院门诊健康体检的成人%#例$为南方汉族人$无脑血管病病史和存在神经系统缺损表现$无肝+肾+甲状腺疾病+心脏瓣膜病和糖尿病$其中男’%例$女#9例$年龄#!!%*岁$平均’")?"‘)&?9(岁&?@A!研究方法抽外周静脉血#-G$!J依地酸钠’+a A H(抗凝$利用常规酚,氯仿抽提法提取基因组a P H&采用聚合酶链反应(限制性片段长度多态性’D@E,E F G D(技术分析/&!0#基因型$根据文献设计引物#’%$由上海生物工程公司合成$其序列为!9b(A Q H H Q Q H Q H H Q Q A Q A@A Q@Q Q Q H( #b$9b(H Q Q H@Q Q A Q@Q Q A Q H Q H Q A Q(#b& D@E的反应条件!反应总体积9&$G$含有)&c D@E缓冲液9$G$)&--80,G1P A D)$G’终浓度!&&$-80,G($两种引物各)9K-8G,G$基因组a P H&?!9$5&反应程序为经$’d预变性#-/3后$加入&4I a P H聚合酶!V$进行#!个循环的$’d 变性’&4$"!d退火9&4$*!d延伸)-/3$最后*!d延伸*-/3结束&%J聚丙烯酰胺凝胶电泳’D H Q+(检查D@E扩增产物$其D@E产物为)$%[K的a P H片段&取)&$G D@E产物$加入)&V!+-ZN酶’P2\+350.31B/80.[4@87(及)&U缓冲液$#*d消化’<$%&d灭活!&-/3终止反应&酶切产物进行%J聚丙烯酰胺凝胶电泳’D H Q+()小时后摄像鉴定&采用扩增阻滞突变体系法’H E I C(检测1)(基因A%##@位点突变$根据文献设计引物#9%$由上海生物工程公司合成$上游引物.!9b,Q Q H Q H H Q A Q A@@A Q Q H A Q@H, #b$下游引物[’野生型(!9b,@@@A A@Q Q Q H A@, @H@@@@H H,#b$下游引物6’突变型(!9b, @@@A A@Q Q Q H A@@H@@@@H Q,#b&D@E反应分!管进行$每管反应总体积!&$G$含有&4I D@EI.4:2L I/e’O N H Q+P+公司()&$G$基因组a P H&?)!9$5$实验H中含有引物.和引物[各)&K-8G,G$而实验B中含有引物.和引物6各)& K-8G,G&反应程序为经$#d预变性#-/3后$进行#9个循环的$#d变性)-/3$9$d退火)-/3 #&4$*!d延伸)-/3#&4$最后*!d延伸*-/3结束&D@E产物为%"*[K片段$进行%J聚丙烯酰胺凝胶电泳’D H Q+()<后摄像鉴定&另外$1)(基因D@E产物经纯化后进行单链a P H测序’上海生工公司($测序结果与文献序列一致$证实本实验所扩增的a P H片段为目的片段&?@B!基因分型经!+-Z N酶消化后/&!0#基因型有#种$即1纯合基因型’(,(($图谱显示为)$%[K片段$杂合基因型’f,((有)$%[K片段+)*9[K片段和!#[K片段’!#[K片段太小$电泳图不显示($&纯合基因型’f,f(有)*9[K片段和!#[K片段’!#[K片段太小$电泳图不显示(’图)(&经H E I C,D@E扩增1)(基因$有#种1)(基因型$即&纯合基因型’(,((在实验H中可扩增出%"*[K片段$杂合基因型’f,((在实验H和B中均扩增出%"*[K片段$1纯合基因型’f,f(为仅第!管扩增出%"*[K 片段’图!(&$$!!#期!!!!!!!!!吴军民等!缺血性脑卒中患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变的研究图?!!"#$%基因6C 2产物#&’,9酶切结果I !K B E #!!"/>3N 标准#)!基因型$f "(%#!&#&9&"!基因型$("(%#’!基因型$f "f %’D %E F ?!’)G *,"1"&$;*G8*;"+%+*,6C 2H 2D I 6*,!"#$%E "#"’!’);<";G J 2B A A 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:2/32!W6Y#血浓度升高是脑血管疾病的一个独立风险因素!但高同型半胱氨酸血症致卒中的机制尚不完全清楚$近年来发现高W6Y水平可能与血管内皮损伤和功能失调!刺激血管平滑肌细胞增殖!促进血小板聚集及破坏体内凝血%纤溶平衡等方面有关$通过上述环节!W6Y促进了脑血管病发病的进程$血中W6Y水平取决于遗传和环境营养两方面因素!包括IA W F E%@B C%甲硫氨酸合成酶缺乏或活性降低!以及某些辅助因子如叶酸%维生素B"% B)!缺乏!引致W6Y代谢障碍!最终使血中W6Y水平升高"高同型半胱氨酸血症#$)$$’年!Q8Y2::2等采用荧光原位杂交!把人/&!0#基因定位于染色体)K#"?#上!6a P H全长!?!][$F L844:等&’’应用聚合酶链反应(单链构象多态性"D@E,C C@D#分析证明IA W F E基因在"**位发生突变与冠心病及脑卒中密切相关!由碱基A置换了碱基@!其编码氨基酸也由缬氨酸代替了丙氨酸$这样IA W F E的耐热性和活性都大大降低!从而影响W6Y再甲基化!导致血浆W6Y水平升高$/&!0#基因中以@"**A位碱基突变最常见&’’!而且不同的人种中/&!0#@"**A突变频率分布是不同的&"’$在我们的研究中!发现@"**A突变纯合子")?!J#及A等位基因"!)?)J#在中国南方汉族人群中的频率比中国北方汉族人群&*’%日本&%’%爱尔兰&$’%意大利%高加索&’’%犹太人群&)&’都要低$由此表明!@"**A基因突变存在着人种地域的差异$/&!0#基因@"**A基因突变与脑卒中的关系目前国外研究结果尚不一致!国内对/&!J 0#@"**A基因突变与脑卒中关系的研究尚少$我们的研究显示@"**A位点突变与缺血性脑卒中发病有关"2g&?&!%!M E)?*’!$9J@N)?&"!!?%"#!因此@"**A位点突变可能是导致缺血性脑卒中发病的遗传因素之一$本研究的这一结果与W.L-83等在爱尔兰人群&$’!I8L/:.等在日本人群&%’!周宪梁等在中国北方人群的研究结果基本一致&))’!而与G.08>46<2]等在澳大利亚人群&)!’!D L244等在波特兰人群的研究结果不一致&)#’$I>3]2等")$$%年#将人1)(基因定位于染色)&#!#期!!!!!!!!!吴军民等(缺血性脑卒中患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变的研究体!)K!!?#!全序列全长!%&’"[K"1)(基因中以A%##@位和Q$)$H位碱基突变较常见##$"A4./等报道1)(基因A%##@及Q$)$H位点突变可使酶的活性降低!引起高W6Y血症#9$"目前!国外对1)(基因的临床研究报道较少!主要在冠心病%神经管畸形方面的研究"国内!许海燕等#*$曾报道1)(基因A%##@点突变与冠心病发病有关!但国内尚未见报道1)(基因A%##@位点突变与脑卒中的关系的研究"我们的研究显示A%##@位点突变与缺血性脑卒中发病有关&2g&?&!9!M E)?*#! $9J@N)?&*!!?%)’!因此A%##@位点突变可能是导致缺血性脑卒中发病的遗传因素之一"我们的研究发现!虽然/&!0#@"**A和1)(A%##@基因突变均与缺血性脑卒中发病有关!但根据I>0:/K02G85/4:/6E25L244/83分析得出IA W F E@"**A和@B CA%##@两个基因位点突变对缺血性脑卒中的作用并无协同作用!可以认为该两个基因位点突变的作用是相互独立的"由此看来!/&!0#@"**A和1)(A%##@位点突变所起的效应等同于微效基因所起的效应"脑血管病是多基因疾病!它们的发生受多种因素的影响!即使该基因确实与疾病相关也可能会得出相反的结论"因此!在研究此类疾病时!我们认为不仅应考虑到病人整体情况及伴随疾病的影响!还应注意到人种%人群%统计方法的差别"并进一步增加候选基因!以利对疾病的全面认识"参考文献!2",";"#&"+"##)$!@8>00B I!I.0/38\I E!B2.-2LP!C2e:83Q!P8L1:F!12 Q.L-8D7+02_.:21K0.4-.<8-86Y4:2/32683623:L.:/83.4.K844/[02/312K23123:L/4]Z.6:8L Z8L4:L8]27(658K*!)$$&!!)( 9*!7#!$!W8>4:83D+!E.3.C!C2]<4.L/.C!D2L0/3+!R/-C!@.4:L80 M G7W8-86Y4:2/32/34/6]0262001/42.42(E20.:/834</K:8 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/*?C1A+-4!)$$$!*$&"’(’)’!’)"7许海燕!陈在嘉!汤!健!姜玉新!张晨晖!朱大明!张春玲!叶!珏!赵如冰!杨跃进!陈纪林!惠汝太7冠心病患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因多态性的研究7中华医学杂志!)$$$!*$ &"’(’)’!’)"7#%$!I8L/:.W!R>L/<.L.W!A4>[.]/C!C>5/Y.-.A!W.-.1.@!R>L/<.L.T!C</318A!M<,<.4</T!R/:.->L.R!T.;.]/T7 I2:<Y0232:2:L.<Y1L8Z80.:2E21>6:.42Q232D80Y-8L K</4-.31 N46<2-/6C:L8]2/3i.K.32427’56*5+8>B<*5&A587LM4>B)+8<!)$$%!)%()’"9!)’"$7#$$!W.L-83aG!a8Y02E I!I202.1Y E!a8Y02I!C</2014a@!B.L L Y E!@8.]02Y a!Q L.<.-N I!S</:2<2.1H C7Q232:/6H3.0Y4/48Z:<2A<2L-80.[/02h.L/.3:8Z9!)&,I2:<Y0232:2:L., <Y1L8Z80.:2E21>6:.42.4.E/4]F.6:8LZ8LN46<2-/6C:L8]27’56*5+8>B<*5&A587LM4>B)+8<!)$$$!$$(!&%!!))7#)&$F L/21-.3Q!Q80146<-/1:P!F L/210.312LT!B23,T2<>1.H!C20<>[i!B.[.2Y C!I23120I!R/1L83I!B.L,M3W7H @8--83->:.:/83H)!$%@/3<>-.3-2:<Y0232:2:L.<Y1L8Z8,0.:2L21>6:.42&IA W F E’.4486/.:/83\/:<K0.4-.:8:.0<8-8,6Y4:2/32.31Z80.:2683623:L.:/8347C:;65!)$$$!)!$&$’( )"9"!)"")7#))$X W M V U/.3,G/.35!WV H/,W>.!WV NE>,A./!Q H M E>3, G/3!G N V G/,C<235!G NT.,X<235!E+P S>,U/.3!WV H P Q O/,O/35!X WH P 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