荧光素酶及其报告基因的应用和检测

荧光素酶及其报告基因的应用和检测

一生物发光

生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。

与荧光的区别在于

荧光：荧光检测需要激发光源，发射光的能量来源于激发光，荧光反应为瞬时反应。

发光：生物发光、化学发光，发光反应无需激发光源，发射光的能量来源于化学反应，发光有一定的持续时间。

二荧光素酶

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。

发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～

580 nm 的荧光,其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。

三荧光素酶报告基因

报告基因（report gene）是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达,

通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。

1 常见的报告基因：

β‐半乳糖苷酶（β‐Gal）

葡萄糖醛酸酶（GUS）

绿色荧光蛋白（GFP）

分泌型碱性磷酸酶（SEAP）

荧光素酶（LUC）

2 报告基因简单实验流程

●构建包含有报告基因的质粒

●将构建好的质粒转染细胞

●提供相应的刺激（诱导）

●检测报告基因

●数据分析

3 荧光素酶作为报告基因的优势：

✧内源性低，哺乳动物无内源性表达

✧荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响

✧发光检测，检测方便

✧灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子

✧检测范围广，大于7个数量级

4 其它报告基因

正因为荧光素酶与底物的结合特异性很强，检出的灵敏度高，没有激发光的非特异性干扰，信噪比较高，具有其他报告基因不可替代的优势，它作为报告基因显示出良好的前景。荧光素酶已成为医学研究领域的重要工具, 在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法，对于推动基因工程研究的发展具有重要作用。

四它的检测方法

依赖生物发光特性,利用闪烁计数器( scintillationcounter) 对荧光素酶的活性作出定量检测。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测。

五利用MicroChemi检测植物叶片中的荧光素酶生物发光

1 打开MicroChemi相机开始制冷

2将植物叶片喷加发光底物（喷底物的过程需遮光）

3 将样品置入MicroChemi暗室室温孵育10min（孵育时间随样品而定）

4 打开MicroChemi软件，设置拍摄参数

5利用binning3x3，每10分钟曝光一次，共曝光三张

6添加伪彩，调节照片的对比度，得到最佳照片

附：利用MicroChemi2.0检测烟草叶片中荧光素酶的发光，曝光10min，binning3x3