膜片钳技术
膜片钳实验技术(高级生理课程,201310)
Sutter公司微电极拉制器
P-97
P-2000
日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪
软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是 Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master 软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处 理软件，如Origin等软件。
MDC公司Pclamp采集和分析软件
膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜 电位的基础上改变膜电位，记 录离子通道电流的变化，记录 的是诸如通道电流；EPSC;IPSC 等电流信号。是膜片钳的基本 工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入 刺激电流，记录膜电位对刺激 电流的反应。记录的是诸如动 作电位，EPSP;IPSP等电压信号。
AXON200B
MultiClamp700B
EPC10
数据采集、分析系统
光学部件和光电接口：膜片钳实验是一 个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃 电极和细胞的封接，因此需要高质量的 显微镜和成像系统，如果所用的细胞是 培养的单个细胞，需要一台倒臵相差显 微镜，而如果所用的标本是脑片或其他 组织片，所用的光学系统必须是红外微 分干涉差成像系统，这样才能“看”到 组织中的单个的细胞，才能在可视条件 下进行组织膜片钳的操作。
膜片钳记录模式
————————
细胞吸附模式
Cell-attached mode; on-cell mode 细胞内环境保持正常条件下可对离子通道的活 动进行观察记录。 到达与电极接触的膜片外部，如果刺激浴液中 加入刺激物质不能有效，则说明刺激物质是经 过细胞内第二信使介导间接起作用。 不能人为直接控制细胞内环境条件，不能确切 判定细胞内电位，不清楚膜片上的实效电位。
+
膜片钳技术
测试题：
1. 膜片钳的主要记录方式有哪几种，各
有何优缺点? 2. 什么叫整流，产生整流的原因是什么？
膜的被动反应
离子通道开放 膜的主动反应
外向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠 近。如IK电流。
内向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠 近。如烟碱电流。
去极化方向
去极化方向
IK电流的外向整流
烟碱电流的内向整流
尾电流（Tail current）
指通道在激活因素结束时的关闭过程中，所记录
6. 基本概念及参数设置
输入漏电流（Input leakage current）
理论上讲，不施加外部命令时，通过放大 器探头的电流应该为0，如果由于放大器本 身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于 放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电 流都很小。
封接电流（Seal current）
由于封接质量不高（没有形成良好的高 阻封接），从封接处产生的电流。成为噪 声。
第三部分
全细胞记录结果举例
+80mV
+40mV
0mV
-40mV
-80mV 200ms
Iso Hypo
Current Density (pA/pF)
-40
60
30
0 -80 0 -30 40 80
Voltage (mV)
-60
Iso 4 Iso 2 Hypo Hypo
Current (nA)
0
倒 置 相 差 显 微 镜
EPC-7膜片钳放大器(德国)
4. 膜片钳的记录方式及基本操作
细胞吸附式（Cell-attached
膜片钳技术及应用
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径1.0~1.2
㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉 制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁 电容就越小，噪声也就越低。
玻璃微电极及膜片的几何形状
电极拉制仪
拉制方法：两步拉制法。
第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形 成一个细管，即拉制电极的颈部；
高阻封接形成的电流图
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于
清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电 极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流， 称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整 性，
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的
电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流， 从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注 射电流的大小与离子流的大小相等、方向相 反。因此它可以反映离子流的大小和方向。
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实 验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压 使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电 极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步 使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
膜片钳记录法
膜片钳记录法（Patch Clamp Recording）是一种生理学实验技术，用于测量细胞膜离子通道或受体的电生理特性和活动。
该技术的基本原理是使用微型玻璃电极将一个非常小的玻璃管（称为膜片）贴附到单个细胞的表面上，从而形成一个微小的、高阻抗的突触点。
然后在膜片和细胞膜之间形成一个密封，并使用微电极或电极芯片记录跨越这个突触点的电位变化。
这种技术可以测量非常小的电流变化（尤其是亚毫安级别），因此非常适合研究离子通道和受体的活动。
通过控制细胞环境的情况，例如改变温度、pH值或添加化学物质，可以进一步调节离子通道和受体的电生理属性及其响应模式。
这种方法还可以用于研究各种细胞类型的电生理特性，包括神经元和心肌细胞等。
膜片钳记录法是一种十分精密的技术，在操作过程中需要非常小心谨慎，以避免损坏细胞或膜片。
同时，该技术需要一定的专业知识和设备支持，因此通常由有经验的生理学家和技术人员来执行。
总之，膜片钳记录法是一种重要的电生理技术，已经成为研究离子通道和受体的电生理学特性的关键工具之一，对于揭示神经、心血管等多种疾病的发病机制和治疗方法也具有重要意义。
膜片钳技术
膜片钳技术1、膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳技术的原理图[51]Rs是与膜片抗阻串联的局部串联电阻（或称入路阻抗），Rseal是封接阻抗。
RS通常为1~5MΩ，如果Rseal高达10GΩ以上是成为Ip/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。
此Ip可作为I~V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻（Rf）的电压下降而被检测出。
实际上这是场效应管运算放大器（A1）的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大器（A2）时被减掉。
本实验采用的是全细胞记录模式。
全细胞记录构型(whole-cell recording)高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，而与浴槽液绝缘，这种形式称为“全细胞”记录。
膜片钳技术
膜片钳技术膜片钳技术是一种用于夹持和夹持薄膜材料的高精度工具。
它被广泛应用于各种领域，包括医疗、电子、航空航天、光学等。
本文将介绍膜片钳技术的原理、应用、优势和未来发展方向。
膜片钳技术的原理是利用薄膜的柔性和弹性特性，将其夹持在两个夹持片之间，通过施加适当的压力来固定和控制膜片。
它的结构简单，通常由两个平行的金属夹持片组成，夹持片之间有一层薄膜，可以是金属、塑料或橡胶材料。
膜片钳技术在医疗领域中广泛应用于微创手术。
它可以用于夹持和处理各种组织样本，如血管、肾脏、肺部等。
膜片钳可以通过精确控制夹持力来保护脆弱的组织，减少手术风险和创伤。
此外，膜片钳还可以用于制作微小的缝线和缝合器，用于手术缝合和内脏重建。
在电子领域，膜片钳技术用于处理和夹持微小的电子元件。
由于膜片钳的夹持力可调节且均匀，它可以用于精确地定位和安装电子组件，确保元件之间的准确对齐和联系。
此外，膜片钳还可以用于处理柔性电路板和柔性显示屏等薄膜电子产品，保证其完整性和性能。
在航空航天领域，膜片钳技术用于夹持和固定航天器表面的绝热膜。
夹持膜片的合适压力可以确保膜片与表面的紧密贴合，提供良好的隔热性能，减少航天器受到的热能损失。
此外，膜片钳还可以用于夹持航天器的其他部件和设备，确保它们在运行过程中的稳定性和可靠性。
在光学领域，膜片钳技术用于夹持和夹持光学元件，如透镜、棱镜和滤光片。
膜片钳的夹持力和表面平整度可以确保光学元件的精确定位和对准度，从而提供高质量的光学性能和成像效果。
此外，膜片钳还可以用于夹持光学材料的样本，如光学薄膜和光学纤维，用于实验和测试。
膜片钳技术具有许多优势。
首先，它具有高精度和可调节的夹持力，可以适应不同材料和应用的要求。
其次，膜片钳结构简单，易于制造和操作。
此外，膜片钳具有快速响应和高灵敏度的特性，可以快速调整和控制夹持力。
最重要的是，膜片钳技术可以保护薄膜材料的完整性，减少损伤和污染的风险。
未来，膜片钳技术有许多发展方向。
上海细胞生物学膜片钳电生理技术原理及步骤
上海细胞生物学膜片钳电生理技术原理及
步骤
细胞生物学是研究细胞结构、功能和生理过程的学科，而膜片钳电生理技术是细胞生物学中的一种重要技术手段。
本文将介绍上海细胞生物学膜片钳电生理技术的原理及步骤。
一、原理
膜片钳电生理技术是一种用于研究细胞膜离子通道的技术。
其原理是利用玻璃微管制成的膜片钳，将其吸附在细胞膜上，形成一个微小的封闭空间，称为膜片钳封闭空间。
通过在膜片钳封闭空间中加入不同离子浓度的溶液，可以观察到细胞膜离子通道的开放和关闭，从而研究细胞膜离子通道的特性和功能。
二、步骤
1. 制备膜片钳
制备膜片钳需要用到玻璃微管，将其拉制成细长的管状，然后用火烧制成膜片钳。
制备好的膜片钳需要经过精细的打磨和校准，以确保其尺寸和形状符合要求。
2. 建立膜片钳封闭空间
将制备好的膜片钳放置在细胞膜上，通过负压吸附在细胞膜上，形成一个微小的封闭空间，即膜片钳封闭空间。
在膜片钳封闭空间中
加入不同离子浓度的溶液，可以观察到细胞膜离子通道的开放和关闭。
3. 记录电信号
在膜片钳封闭空间中加入不同离子浓度的溶液后，可以通过记录电信号来观察细胞膜离子通道的开放和关闭。
记录电信号需要用到电极和放大器等设备，将电信号转换成可视化的信号，以便进行分析和研究。
三、总结
上海细胞生物学膜片钳电生理技术是一种重要的细胞生物学研究技术，其原理是利用玻璃微管制成的膜片钳，在细胞膜上形成一个微小的封闭空间，通过加入不同离子浓度的溶液来观察细胞膜离子通道的开放和关闭。
该技术可以用于研究细胞膜离子通道的特性和功能，对于深入了解细胞生物学的研究具有重要意义。
第十五 膜片钳技术简介
磷脂双层的 屏蔽作用
Na-K 泵
离子的跨膜分布
[K+]o << [K+]i [Na+]o >> [Na+]i
离子的跨膜分布
胞外
Na+ Cl-
Membrane
A- K+
胞内
通道蛋白——离子通道
配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体
乙酰胆碱受体
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Electrophysiology-Apparatus
Electrophysiology-Apparatus
Patch clamp
Patch clamp-application
取材形式 脑片(slices)
单细胞
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
OUTLINE
1、电生理学简介 2、膜片钳技术概述 3、膜片钳技术应用
Singlechannel recording
Singlechannel recording
Macrocurrent recording
Macrocurrent recording
Advantages
Major Disadvantage
Physiological conditions
Easy to obtain
膜片钳技术及应用
膜片钳技术及应用膜片钳技术及应用是一种常见的力学装置，由薄膜片、夹持手柄和支撑结构组成。
膜片钳可用于夹持和固定物体，并且在广泛的领域中有着重要的应用。
下面将对膜片钳的技术原理和应用领域进行详细介绍。
膜片钳的技术原理主要基于材料的力学性质。
一般情况下，膜片钳采用弹性薄膜片作为夹持物体的夹持部分。
当施加外力使薄膜片发生形变时，薄膜片会产生力与形变量成正比的特性，这种力被称为弹性力。
通过调整薄膜片的形变程度和位置，可以达到对不同物体的夹持和固定的目的。
膜片钳的应用领域非常广泛。
以下是一些常见的应用领域：1. 医疗行业：膜片钳被广泛用于医疗器械的设计和制造。
例如，在手术中，膜片钳可以用于夹持和固定组织、血管和器官，以便医生进行手术操作。
膜片钳的特点是夹持力均匀，不会损伤组织和血管。
2. 实验室研究：膜片钳在实验室研究中也有广泛的应用。
例如，在细胞学研究中，膜片钳可以用于夹持、拉伸和操纵细胞，以研究细胞的力学特性和细胞间的相互作用。
此外，膜片钳还可以用于微流体实验中的液滴操纵和胶体粒子的固定。
3. 微机电系统（MEMS）：膜片钳是制作微机电系统中常用的工具。
在MEMS 器件制造过程中，需要对微米级物体进行精确操纵和固定。
膜片钳结构简单，加工工艺成熟，可以实现对微米级物体的夹持和固定。
4. 机械制造：膜片钳在机械制造过程中也有重要的应用。
例如，在精密加工中，膜片钳可以用于夹持和固定零件，以确保加工精度。
另外，膜片钳还可以用于装配过程中的夹持和定位。
总的来说，膜片钳技术及其应用在医疗、实验室研究、微机电系统和机械制造等领域起到了重要的作用。
膜片钳具有结构简单、操作方便、夹持力均匀等特点，使其成为一种广泛使用的力学装置。
随着科技的不断发展，膜片钳的应用领域还将不断扩大，为各个领域的科研和应用带来更多的便利和可能性。
膜片钳技术原理及相关基本知识
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
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膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术的应用领域
神经科学
研究神经元离子通道与动作电 位的产生和传播，以及药物对
神经元功能影响。
心血管
研究心脏离子通道与心律失常 的关系，以及抗心律失常药物 的作用机制。
药理学
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，以及新药的开发和 筛选。
其他领域
膜片钳技术还可应用于内分泌 、免疫等领域，研究相关细胞
利用膜片钳技术，可以研究神经元在长期和短期内的电生理变化，了 解学习、记忆等认知过程的神经机制。
药物筛选与开发中的应用
药物作用机制的研究
膜片钳技术可以用于研究药物对离子通道或受体电流的影响，从 而揭示药物的作用机制。
药物筛选
通过膜片钳技术，可以在细胞或组织水平上快速筛选出具有特定 药理作用的药物候选物。
物或其他因素对细胞膜功能的影响。
03 膜片钳技术的应用实例
神经科学研究中的应用
神经元电活动的记录
膜片钳技术可以用来记录单个神经元在静息状态和刺激下的膜电位 变化，从而研究神经元的兴奋性和电生理特性。
突触传递的研究
通过膜片钳技术，可以记录突触后电位，研究神经递质释放、受体 激活和信号转导等过程。
神经可塑性的研究
在医学诊断与治疗中的应用
疾病诊断
膜片钳技术可用于检测细胞膜离子通道的异常变化，从而对某些 疾病进行早期诊断，如癌症、神经退行性疾病等。
药物研发
通过膜片钳技术可以研究药物对离子通道的作用机制，为新药研发 提供有力支持。
个体化治疗
根据患者的离子通道基因变异情况，膜片钳技术可以为个体化治疗 提供精准的用药建议。
高通量与高灵敏度
通过改进膜片钳技术的设计和材料，有望实现高通量和高灵敏度的检测， 从而能够同时记录多个细胞或同一细胞的不同活动，提高实验的效率和 精度。
心脏电生理技术基础(膜片钳)
膜片钳实验操作技巧
准备工作
细胞处理
操作步骤
准备好玻璃微电极、电极填充
获取目标细胞，如心肌细胞或
将玻璃微电极进入细胞膜，形
液和录音设备。
神经元，进行培养和处理。
成一个密封，调整电极位置，
记录和分析电流。
结论和展望
膜片钳是研究心脏电活动和细胞膜离子通道的重要工具。随着技术的进步，
膜片钳的应用范围将进一步扩大，为心脏病、神经科学和药物研发等领域提
供更多的研究突破。
膜片钳的分类
全细胞膜片钳
内外膜片钳
通过破坏细胞膜，将膜片与细胞内外连接，可
只破坏细胞膜的一侧，可以选择性地记录细胞
以记录到细胞内外的完整电活动。
内或细胞外的电活动。
斜膜片钳
差分膜片钳
将膜片与细胞膜倾斜连接，可以记录到细胞内
通过使用两个膜片钳同时记录细胞内外的离子
部的离子通道电流。
通道电流，可以获得更精确的记录。
心脏细胞的电活动和离子通道功能。
变化，帮助研究神经传递机制。
药物筛选和研发
基因工程研究
膜片钳可以用来评估潜在药物对离子通道的作用，
通过记录细胞膜上的电活动，可以研究基因工程对
帮助药物筛选和研发。
细胞功能的影响。膜片钳的优源自点1优点 高分辨率记录细胞膜上的离子电流；可以精确地控制实验条件。
2
缺点
膜片钳的工作原理
膜片钳使用一根玻璃微电极将电极进入细胞膜，形成一个密封。通过施加负压，使电极与细胞膜贴合，形成一
个高阻抗的接触。然后，通过改变电极与细胞膜之间的电位差，可以测量细胞膜上的离子电流。
研究应用举例
心脏细胞的离子通道研究
神经生物学实验原理与技术
神经生物学实验原理与技术一、神经元的电生理实验神经元的电生理实验是研究神经元信号传导和电活动特性的重要方法之一、实验常用的技术包括膜片钳技术和全细胞钳技术。
1.膜片钳技术膜片钳技术是通过在神经元膜上形成一个微小的玻璃电极负压，使其与神经元膜紧密接触，从而记录神经元的电位变化。
膜片钳技术主要用于研究神经元的静息电位、动作电位等电生理特性。
2.全细胞钳技术全细胞钳技术是通过在神经元内注入一种特殊的电解质溶液，形成电极与神经元内部的紧密接触，从而记录神经元内部的电活动和离子流动。
全细胞钳技术常用于研究神经元的离子通道、突触传递等特性。
二、神经解剖实验神经解剖实验是研究神经系统结构和功能的基本方法之一、通过解剖神经系统，可以了解其组织结构和神经元连接的方式。
1.脑切片技术脑切片技术是将大脑等神经组织切成厚度在10-200微米的薄片，然后通过显微镜观察和研究。
脑切片技术常用于研究神经元结构、突触形成和突触传递等。
2.神经示踪技术神经示踪技术是通过标记和追踪神经纤维的方法，研究神经元之间的连接方式和传递路径。
常用的示踪技术包括逆行示踪和顺行示踪等。
三、分子生物学实验分子生物学实验是研究神经系统基因表达和蛋白质功能的重要方法。
通过分子生物学技术，可以探索神经系统的发育和功能调控机制。
1.基因克隆技术2.基因转染技术基因转染技术是将外源基因导入到细胞中，并使之在细胞内表达的方法。
常用的基因转染技术包括质粒转染、病毒介导转染等。
3.蛋白质分离与检测技术蛋白质分离与检测技术是分析神经系统中蛋白质表达和功能的重要手段。
常用的蛋白质分离与检测技术包括SDS-凝胶电泳、Westernblotting、免疫组织化学方法等。
总结起来，神经生物学实验原理与技术主要包括神经元的电生理实验、神经解剖实验和分子生物学实验。
通过这些实验，可以深入研究神经系统的结构、功能和发育机制，为神经生物学领域的研究提供有力的手段。
膜片钳技术
配体门控性离子通道（ligand-gated ion channel）
电压门控性离子通道（voltage-gated ion channel）
离子通道开关要经过三种以上状态转换：
（二）两个重要的方程：
HUST
Ohm’s law：
I=gE or E=IR or I=E/R
Nernst equation：
HUST
Cell-attached configuration
电极仅与细胞膜很小部分形成Giga-seal,不 损害细胞膜的完整性;
用于单通道记录（single-channel recording) 某一特定的离子通道 细胞不同部位的电流
内面向外式：
HUST
Inside-out configuration
Vh=-80mv Vt=-40mv Unitary
current=2.2pA
2. K+通道电流记录：全细胞记录HUST
K+通道电流记录：单通道记录HUST
Cell-attached
1 pA
Inside-out
0
50
100
150 0
50
100
150
Time (ms)
Time (ms)
3. Ca2+通道电流记录：全细胞记录HUST
电压门控（依赖性）离子通道
3. 膜片钳技术 HUST
Patch-clamp techniques
1980年前后，Neher and Sakmann实验室发明 膜片钳技术，引发电生理 技术一次革命性的突破:
封接阻抗: Giga-seal GΩ级 （109 Ω)
记录电流：pA级（10-12A)
Neher and Sakmann 获1991年诺贝尔生理学或医
膜片钳技术及其应用
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
膜片钳技术概述
2）屏蔽罩：用铜丝网制成，防止周围环境 的杂散点场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。 有的膜片钳实验所测试的细胞或某种物质是光 敏感的，或者膜片钳实验是与光学测量联合进 行测需要采取光屏蔽，则屏蔽罩的外壁用黑色 布遮盖或在暗室里操作以减少强光的干扰。
2、光学部分
倒置显微镜 优点： 具有较好的视觉效果 便于将玻璃微电极与细胞的顶部接处。 具有较好的机械稳定性。
荧光染料Fu ra-2 可被紫外光激发发射出 荧光, 它可选择性地结合钙离子, 而与钙离子 结合的Fu ra-2 越多, 以相同紫外光激发出的 荧光就越弱, 因此可根据荧光强度的变化计算 出单位体积中钙离子浓度的变化。具体过程为: 在做全细胞记录之前, 以孵育或经电极扩散的 方法使荧光染料Fu ra-2 进入细胞, 然后对该 细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞 膜电容等多种指标变化情况进行观测,并分析 这些变化间的相互关系。
电极电容Cp极小，只有几各pF，相应的 电路时间常数甚小，因而对于Cp瞬态补偿称为 快电容补偿，细胞膜电容的值约为1µF／cm2， 由于此时的充电电流需要流经串联电阻Rs（Rs 的值约为几个兆欧），时间常数较大，故Cm 的补偿称为慢电容补偿。此外，串联电阻Rs因 跨接在Cp和Cm之间，当有电流经过时，将产 生可观的压降，如当Rs＝5MΩ ，I＝2mA时， 可导致钳制电位误差达10mV；消除这种误差的
3、电子部件：包括膜片钳放大器、刺激器、示
波器及记录系统。 膜片钳放大器：
是膜片钳实验中一个核心仪器，通过它 把生物电信号放大。从原理来说，膜片钳放大 器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形 式，即电阻反馈式和电容反馈式，前者是一种 典型的结构，但是相比较而言，后者降低了噪 声，所以特别适用超低噪声的单通道记录。
膜片钳技术的基本原理
（一）膜片钳技术的基本原理：膜片钳技术是用尖端直径1~2μm的玻璃微电极吸管与经蛋白酶处理干净的细胞膜接触，通过20~30cm H2O的负压吸引造成电极尖端与细胞膜形成高阻封接（10~100GΩ），使电极尖端下的小块膜片与膜的其它部分在电学上绝缘，并在此基础上固定膜片电位，监测几个μm2膜片上1~3个离子通道活动的方法。
高阻封接的形成：高阻封接形成与否是记录细胞离子通道电流能否成功的前提，是进行膜片钳实验的关键一步。
微电极尖端与细胞膜形成封接的过程，可以采用软件或刺激器发出一个脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流，再通过示波器或显示屏，观察电极电流幅度的变化来确定封接程度。
在电极未入溶液之前，在显示器或示波器上可见一直线。
当电极入液后，软件或刺激器发出的电脉冲经记录微电极、浴液及参考电极形成回路，1mV的封接电压流径5MΩ的电极阻抗，则会产生0.2nA的电流浮动，随着微电极尖端接近、接触细胞膜，电极电阻则进一步增加，而电流幅度则随之减小，当在显示器或示波器上看到电流方波变为直线时，则形成低阻封接（50MΩ），然后经微电极给予负压（-10~-30cm H2O），即可形成高阻封接。
再将电脉冲调为10mV，调节快、慢电容电流补偿，消除电容电流，就可进行细胞贴附式膜片钳实验，如果在此基础上再次给予负压或电脉冲，使微电极尖端下膜片破裂，则形成全细胞式。
进行高阻封接时，需注意的是：①在微电极未入液之前常施以正压，使电极内有液体从电极尖端流出，防止浴液表面灰尘或溶液中粒子附着于电极尖端，影响高阻封接。
②如果微电极尖端与细胞膜接触后，仍不能形成高阻封接，则电极即不能再用，需重新换一根微电极继续封接。
③电极尖端与细胞膜接触，稍加负压后电流波形变得平坦，此时，如使电极超极化，则有助于加速形成高阻封接。
④电极入液后封接的成功率与入浴液后的时间呈反比，电极内液中的肽类或蛋白质成分也会有碍于封接形成。
芜湖细胞生物学膜片钳原理
芜湖细胞生物学膜片钳原理
芜湖细胞生物学膜片钳原理
细胞生物学膜片钳是一种技术，它可以用来快速地将膜片放置于细胞，并在细胞和膜之间分离特定的细胞。
膜片钳原理是：使用钳子将膜片置于细胞上，然后形成一种锚固体，形成一个物理障碍，使得细胞紧锁在膜片上，从而形成一个细胞膜夹。
膜片钳可以将固有或抗原特异性的细胞的膜片放置在细胞上，以及可以促进细胞脱落和凋亡，而不是直接被其他宿主细胞吞噬。
膜片钳技术可用于完成许多实验，包括细胞-细胞接触的研究，细胞的膜片抑制实验，细胞膜的活性研究，基因组学研究，以及其他生物技术研究。
与其他技术相比，这种技术具有许多优势，其中包括：可以快速而准确地处理大量细胞；可以控制细胞的形状，以及细胞的比例；可以使用更少的时间去完成实验；可以用来进行详细的技术研究；可以降低实验成本；而且可以用来测试膜片及其相关的配套实验，以及进行其他分离相关的实验。
另外，这种技术还具有易于使用，安全可靠等优点。
然而，在实验过程中，也应注意这些实验的准确性以及精确度，以及实验结果可信度的问题。
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膜片钳技术PPT
总结
▪ 膜片钳技术实用、快速、灵敏、准确及重 复性好等技术优势已经在大量的研究中得 到证实，这项技术的创立取代了电压钳技 术，是细胞电生理研究的一个飞跃，为离 子通道疾病的研究提供了技术基础
6.应用范围日趋广泛
▪ 为解决实际问题的需要，膜片钳技术已经 渗透到生物学领域的许多学科中，如分子 生物学、药理学、免疫学等等，成为生物 学研究中的一种主要技术手段，与其它生 物学技术的结合应用已经成为膜片钳技术 的主要发展趋势
7.全自动膜片钳技术的崛起
传统膜片钳技术的局限
☆每次只能记录一个细胞，是一项耗时耗力 的工作
膜片钳技术
08生物技术 80812009 肖文福
什么是膜片钳技术？
▪ 膜片钳技术是一种通过微电极与细 胞膜之间紧密接触的方法，采用电 压钳或电流钳技术对生物膜上离子 通道的电活动进行记录的微电极技 术。
基本原理
▪ 利用负反馈电子线路, 将微电极尖端所吸附 的一个至几个平方微 米的细胞膜的电位固 定在一定水平上,对通 过通道的微小离子电 流作动态或静态观察, 从而研究其功能。
膜片钳技术的记录方式
1. 细胞贴附式（单通道记录） 2. 内面向外模式 3. 外面向外模式 4. 全细胞模式
膜 片 钳 技 术 的 基 本
记 录
模 式
优点
缺点
细胞吸附模式 内面向外模式 外面向外模式
不破坏细胞的完 电流小，分辨率地，
整性, 内环境保持 对技术要求高，难
正常。
度较大
可以分别观察化 学因素对细胞膜 内侧面和外侧面 结构的影响。
▪ 若将特异的膜片探针插入卵母细胞，可检 测细胞内第二信使含量，此为膜片填塞技 术（Patch 研究细胞的胞吞与胞吐机制，发展了膜 电容测定法（Mem-brane capacitance measurement ）