发酵工程中的染菌原因及解决办法

学生综述性论文
题目：发酵过程中染菌的分析、检测及预
防
姓名：刘莉学号：2008132114
专业：生物技术班级：083班
课程名称：微生物工程
指导教师：燕平梅
课程学期：2010至2011学年第一学期
发酵过程中染菌的分析、检测及预防
姓名：刘莉指导老师：燕平梅
（太原师范学院生物系083班学号：2008132114）
摘要：通过分析发酵过程中染菌的各种原因，总结检测染菌的方法，并提出染菌后应采取哪些措施及预防染菌的方法。

关键词：发酵；染菌；危害；检查；预防
前言：发酵工业生产中，污染杂菌造成发酵失败的事故时常发生，严重影响发酵生产，关于发酵过程是否污染杂菌，如何检测，染了菌后如何处理等等，这些问题的研究是十分有意义的。

内容：
1发酵染菌的危害
1.1不同种类的杂菌对发酵的影响
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大
链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大
四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大
柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌
肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大
谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大
1.2不同染菌时间对发酵的影响
1.2.1种子培养期染菌
菌体浓度低、培养基营养丰富
1.2.2发酵前期染菌
杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成
1.2.3发酵中期染菌
严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成
1.2.4发酵后期染菌
如杂菌量不大，可继续发酵。

如污染严重，可采取措施提前放罐
1.3不同染菌途径对发酵的影响
种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性
空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐
培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性
设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大
1.4染菌对产物提取和产品质量的影响
1.4.1对过滤的影响
发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。

造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。

1.4.2对提取的影响
a.有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开
b.离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量
1.4.3对产品质量的影响
a.对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。

对产品的纯度有较大影响。

b.对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。

1.5染菌对三废处理的影响
使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。

2发酵过程中染菌的检查判断
2.1杂菌的检查方法
借助适当的方法，才能正确而及时地发现发酵过过程是否污染杂菌和染菌的原因与途径。

检查杂菌的方法，要求淮确可靠和快速，这样才能在短时间内获得效果。

目前生产上常用的检查方法有：①显微镜检查；②平板划线检查；③肉汤培养检查。

判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。

除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据pH值、尾气中CO2含量和溶解氧等参数的异常变化来判断是否染菌。

无菌试验的目的：
（1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底
（2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入
（3）了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角
2.2各种检查方法的比较
3种方法各有优缺点，显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易捡出早期杂菌。

平板划线法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能捡出更少的杂菌[1]。

3.发酵染菌原因的分析
3.1从染菌的规模来分析染菌原因
3.1.1大批发酵罐染菌
整个工厂中各个产品的发酵罐都出现染菌现象而且染的是同一种菌，一般来说，这种情况是由使用的统一空气系统中空气过滤器失效或效率下降使带菌的空气进入发酵罐而造成的。

大批发酵罐染菌的现象较少但危害极大。

所以对于空气系统必须定期经常检查。

3.1.2分发酵罐(或罐组)染菌
生产同一产品的几个发酵罐都发生染菌，这种染菌如果出现在发酵前期可能是种子带杂菌，如果发生在中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的。

通常同一产品的几个发酵罐其补料系统往往是共用的，倘若补料灭菌不彻底或管路渗漏，就有可能造成这些罐同时发生染菌现象。

另外，采用培养基连续灭菌系统时，那些用连续灭菌进料的发酵罐都出现染菌，可能是连消系统灭菌不彻底所造成的。

3.1.3个别发酵罐连续染菌和偶然染菌
个别发酵罐连续染菌大多是由设备问题造成的，如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损，特别是冷却管的不易觉察的穿孔等。

设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，即第二批的染菌时间比第一批提早，第三批又比第二批提早。

至于个别发酵罐
的偶然染菌其原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。

3.2从染菌的时间来分析
发酵早期染菌，一般认为除了种子带菌外，还有培养液灭菌或设备灭菌不彻底所致，而中、后期染菌则与这些原因的关系较少，而与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关。

3.3从染菌的类型来分析
所染杂菌的类型也是判断染菌原因的重要依据之一。

一般认为，污染耐热性芽抱杆菌多数是由于设备存在死角或培养液灭菌不彻底所致。

污染球菌、酵母等可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的。

在检查时如平板上出现的是浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)，由于这种菌主要生存在水中，所以发酵罐的冷却管或夹套渗漏所引起的可能性较大。

污染霉菌大多是灭菌不彻底或无菌操作不严格所致。

综上所述，引起染菌的原因很多。

“世界上的事情是复杂的，是由各方面的因素决定的。

”我们不能机械地认为某种染菌现象必然是从某一途径引起的，应该把染菌的位置、时间和杂菌的类型等各种现象加以综合分析，才能正确判断从而采取相应的对策和措施[2]。

4.发酵染菌的防止
4.1种子带菌及其防治
1、保藏斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌、种子培养所涉及的设备和装置染菌。

2、严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理；在制备种子时对砂土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。

为了防止染菌，种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度，保存温度尽量保持相对稳定，不宜有太大变化；对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌污染后才能使用；对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌[3]。

4.2空气带菌及其防治
要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。

1、加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气的洁净度[4]。

2、设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。

3、设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。

选用除菌效率高的过滤介质，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路，避免过滤介质烤焦或着火，防止过滤介质的装填不均而使空气走短路，保证一定的介质充填密度。

当突然停止进空气时，要防止发酵液倒流入空气过滤器，在操作中要防止空气压力的剧变和流速的急增。

三、操作失误导致染菌及其防治
1、通常对于淀粉质培养基地灭菌采用实罐灭菌较好，一般在升温前先通过搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化；有大颗粒存在时应先经过筛除去，再行灭菌；对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多的培养基，采用罐外预先配料，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。

2、在灭菌升温时，要打开排气阀门，使蒸汽能通过并驱除罐内冷空气，一般可避免“假压”造成染菌。

3、要严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫的大量产生。

4、避免蒸汽压力的波动过大，应严格控制灭菌温度，过程最好采用自动控温。

5、发酵过程越来越多的采用自动控制，一些控制仪器逐渐被应用。

一般常采用化学试剂浸泡等方法来灭菌。

四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀（发酵代谢所产生的有机酸等发生腐蚀作用）、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。

5．染菌的挽救和处理
5.1种子培养期染菌的处理
1、一旦发现种子受到杂菌污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。

2、采用备用种子，选择生长生产无染菌的种子接入发酵罐，继续进行发酵生产。

3、如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产的正常进行[5]。

5.2发酵前期染菌的处理
1、当发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；
2、如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。

3、也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。

5.3发酵中、后期染菌处理
1、发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加入适当地杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其它措施，进行处理。

2、如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。

3、对于没有提取价值得发酵液，废弃前应加热至120℃以上、保持30min后才能排放。

5.4染菌后对设备的处理
染菌后的发酵罐在重新使用前，必须在放罐后进行彻底清洗，空罐加热灭菌至120℃以上、保持30min后才能使用。

也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。

噬菌体污染及其防治
一、症状：发酵液光密度不上升或回降；pH值逐渐上升；氨利用停止；糖耗、温升缓慢或停止；产生大量泡沫，使发酵液呈粘胶状；镜检时菌体数量显著减少，甚至找不到完整菌体；发酵周期延长、产物生成量减少或停止等。

二、根源：环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。

三、防治：严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌；严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内；抑制罐内噬菌体的生长；轮换使用菌种或使用抗性菌株。

四、挽救措施
1、尽快提取产品
2、药物抵抗（如四环素可抵抗乳糖杆菌噬菌体；吐温60等表面活性剂可抑制噬菌体的增殖和吸附）
3、罐内灭噬菌体法（60-70℃，5min可灭活）
参考文献
[1]高自召.抗生素生产中染菌原因及解决方法[J].中国兽药杂志.2004,38(1):51-53.
[2]储炬,李有荣.现代工业发酵调控学[M].北京:化学工业出版社,2002
[3]刘振宇.发酵工程技术与实践[M].上海:华东理工大学,2007
[4]党建章.发酵工艺教程[M].北京:中国轻工业出版社,2003
[5]梁世中,孙连贵,陈合,等.生物工程设备[M].北京:中国轻工业出版社,2002。