如何确认RNA提取后的质量(优.选)

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如何确认RNA提取后的质量

一般通过总量，纯度与完整性三大项检测来确认RNA质量：
1总量：
微量分光光度计测260nm吸收值计算。

2纯度：
微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。

3完整性：
以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillaryelectrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。

RNA质检参数中
260、280、
320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。

其中：
A230:测定其它碳源物质，如酚，糖类等。

A260：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。

A280：蛋白质的吸收xx。

一般的，我们只看OD260/OD280(Ratio，R)在
1.8~
2.1范围内时，我们认为RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于2（一般应该是<
2.2的）。

当R <
1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。

当R >
2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了，而纯RNA的OD260/OD280的比值为
2.0。

RNA的质量和纯度鉴定

RNA的质量和纯度鉴定2011年02月22日星期二04:17摘自RNA:A Laboratory Manual,by Donald C.Rio,Manuel Ares Jr,Gregory J.Hannon,and Timothy W.Nilsen.CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,USA,2010.RELATED INFORMATIONSeveral methods for RNA purification are described in Purification of RNA by SDS Solubilization and Phenol Extraction(Rio et al.2010a)and Ethanol Precipitation of RNA and the Use of Carriers (Rio et al.2010b).RNA samples contaminated with DNA can be purified using DNAse I,as described in Removal of DNA from RNA(Rio et al.2010c).RNA molecules≤600kb can be analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis(Polyacrylamide Gel Electrophoresis of RNA [Rio et al.2010d]),whereas larger RNA molecules such as messenger RNA(mRNA)are more effectively analyzed on agarose gels(Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA[Rio et al.2010e]).A protocol is also available for Northern Hybridization(Sambrook and Russell2006). Before attempting to use any of the following procedures for DNA quantitation,it is important to have a"ballpark"idea of what you expect the yield to be(see Table1).DETERMINING YIELD BY SPECTROPHOTOMETRY OR FLUORIMETRYThe easiest way to determine the quantity of RNA in a sample is to measure the absorbance at 260nm(A260)using a spectrophotometer.Because the bases in RNA absorb ultraviolet(UV)light in the250-to265-nm range,one can use this property to quantitatively measure the concentration of an RNA solution,using an average absorbance for the four nucleotide bases.A solution of RNA at40µg/mL will have an absorbance of~1.Accordingly,if50µL of the same solution is diluted in1mL of H2O and read in a1-mL cuvette,the absorbance will be0.05;this is the absolute minimum that we recommend for accurate optical density(OD)readings.The advent of nanospectrophotometers,such as the Thermo-Fisher NanoDrop and GE Healthcare NanoVue,has greatly increased the ease,sensitivity,and accuracy of determining the concentration of low-volume(microliters)samples by UV absorbance(see below).With this equipment,one can measure the A260without dilution and with minimal waste of the sample.If you do not have access to these spectrophotometers,we recommend that OD be used as a measure of concentration only when you have a significant amount of RNA present in a concentrated solution,e.g.,at least1.0µg/µL.We have often observed students interpret A260 readings of0.003or less,but measurements as low as this are essentially meaningless. Although measuring A260is generally a reliable way to quantitate RNA concentrations,this method can be confounded if the RNA is contaminated with DNA,protein,or phenol,all of which absorb some UV light at260nm.A diagnostic for protein contamination is absorbance at280nm. Phenol and TRIzol Reagent both absorb at270nm and230nm.The chaotropic agents guanidine-HCl and guanidinium isothiocyanate,commonly used for RNA purification,absorb at ~230nm and~260nm,respectively.For purified DNA the A260:A280ratio should be~1.8,and for purified RNA this ratio should be~2.0,because the unpaired bases in RNA absorb more UV light than the base-paired bases in duplex DNA.However,these ratios are"rules of thumb"and assume an average base composition of the RNA sample,because different bases each have different A260:A280ratios.If the A260:A280ratio is<2.0,protein contamination is probable and re-extraction with phenol is recommended.If the A260is high,phenol contamination is probableand another round of ethanol precipitation and resuspension is recommended. Contamination with DNA is harder to detect because RNA and DNA essentially have identical absorbance spectra.Therefore,if the A260of the sample is higher than expected and protein and phenol contamination have been ruled out,the sample is likely contaminated with DNA.In this case,DNase treatment followed by phenol extraction and ethanol precipitation is recommended (see Purification of RNA by SDS Solubilization and Phenol Extraction[Rio et al.2010a]and Ethanol Precipitation of RNA and the Use of Carriers[Rio et al.2010b]).In addition,it is possible to use the A260:A230ratio as an indicator of nucleic acid purity,with ratios commonly in the range of2.0-2.2.Note that absorbance is pH dependent,so for accurate readings,keep the pH constant and near7.5.UV Absorbance Determination of RNA Concentrations Using a NanospectrophotometerSmall-volume(0.5-2µL)UV-visible spectrophotometers can now be used to sensitively measure RNA or DNA concentrations and fluorochrome(e.g.,Cy3/Cy5)dye coupling to allylamine-modified cDNA,or for protein concentration determination.These instruments(e.g., the Thermo-Fisher NanoDrop or GE Healthcare NanoVue nanospectrophotometers)use fiber optic technology and surface tension to hold a1-µL sample in place;thus,they eliminate the need for traditional sample holding by cuvettes.The dynamic range of these instruments is high, ranging from2ng/µL to3700ng/µL.The following discussion provides practical information about the use of this equipment and interpretation of results.Step-by-step instructions for operation are supplied in the manufacturers’instrument manuals.ProcedureThis procedure is simple.Place1.0-1.5µL of the RNA sample onto the sample pedestal.The UV absorbance of the sample is then read either at a fixed wavelength or in a UV-visible scan. Typically,pure RNA(or DNA)samples are read at A260and A280.It is possible also to use these instruments to scan a full UV and visible wavelength absorbance spectrum,from220nm to750 nm.The UV-visible wavelength scanning procedure is more useful in microarray studies when one wants to quantitate fluorochrome dye coupling to cDNA.Figure1shows some results obtained using a nanospectrophotometer and how these results are interpreted.Tips and Troubleshooting1.As with the UV absorbance methods described previously,any compounds(e.g.,free nucleotides,phenol,or other organic compounds such as guanidinium isothiocyanate)that absorb UV light near260nm will interfere.Often,a simple ethanol precipitation can be used to remove the contaminating substance.2.When adding a sample to the pedestal,ensure that the sample is placed over the"eye"(the eye is the little metal circle with the tiny hole in the NanoDrop).3.Bubbles are incompatible with accurate readings.Although the instructions may claim that only1µL is needed,in practice a larger volume(1.3-1.5µL)will produce more reliable readings because the droplet will have better optical characteristics.Small-volume droplets can give incomplete coverage across the pedestal.4.It is possible to saturate the spectrophotometer with high-concentration solutions of RNA or DNA.This will cause an underestimate of the true concentration.Try to obtain readings using solutions at≤2.5µg/µL.For samples that give higher readings(>2.5µg/µL),it is a good idea to dilute1:10and read the dilution to get the most accurate reading.Fluorescent Dye Binding for RNA and DNA QuantitationAs an alternative to spectrophotometry,RNA can be quantitated using fluorescent dye binding. This is a sensitive assay for detecting and determining the quantity of RNA(and contaminating DNA)present in a purified RNA sample or in crude extracts or chromatographic fractions.It is ~1000times more sensitive than using UV absorbance and can detect RNA at1ng/mL.In addition,this method can be used for quantitation of in vitro-transcribed RNA samples or for determining RNA concentrations before Northern blotting,RNase protection,reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR),or cDNA library preparation.It is similar in concept to fluorescent dye binding to DNA(e.g.,SYBR Green)used in quantitative PCR(qPCR). The RiboGreen RNA reagent,a proprietary fluorescent dye,preferentially binds to RNA,but it can also detect DNA(see the following"Tips and Troubleshooting"section).This method is useful when making RNA from nuclear fractions that might be contaminated with DNA and for assaying very small quantities of RNA prepared from limited quantities of starting material.Step-by-step instructions for using this reagent are supplied in the manufacturer’s user manual.Tips and Troubleshooting1.If you suspect that the RNA sample of interest is contaminated with DNA(perhaps cellular genomic DNA in a total RNA preparation),you can treat the sample with DNase I(Removal of DNA from RNA[Rio et al.2010c])or use PicoGreen,which detects double-stranded DNA only.2.The assay remains linear in the presence of several compounds that commonly contaminate nucleic acid preparations,although the signal intensity may be affected.Thus,to serve as an effective control,treat the RNA solution used to prepare the standard curve the same way as the experimental samples;it should contain similar levels of such compounds.3.There can be some interference with the fluorescence assay by salts,organic solvents, detergents,proteins,or other compounds.If these are present in the sample,control for this by placing them in the standard curve RNA dilutions.DETERMINING YIELD BY GEL ELECTROPHORESISFor samples of total or cytoplasmic RNA(with ribosomal RNA[rRNA]),a simple and straightforward way to determine yield is to separate a small aliquot of the RNA on an agarose gel and stain with ethidium bromide or SYBR Gold(see Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA[Rio et al.2010e]).Bands of rRNA(28S and18S)are visualized,and their intensity is compared with that of a preparation of known quantity.In our laboratories,we keep a "stock"of high-quality cytoplasmic RNA prepared from tissue culture cells as a reference.This stock can be diluted as appropriate to obtain the equivalent amount of RNA that you expect from the sample.Because SYBR Gold is10-fold more sensitive than ethidium bromide,it should be used for small amounts of RNA.An advantage of this technique is that it measures both the quantity and the quality of RNA;i.e., sharp and distinct rRNA bands without a pronounced haze below them is a good sign that the preparation is not significantly degraded.The only disadvantage of this approach is sensitivity;at least500ng of RNA must be available to sacrifice for this assessment.To assess quality,sufficient quantity must be loaded to detect degraded material.Use of Rapid Capillary Electrophoresis on an Agilent Bioanalyzer for RNA Sample Quality Control A bioanalyzer provides a convenient and more sensitive way to assess RNA quality.The Agilent2100Bioanalyzer basically performs small-volume electrophoresis,similar to capillary DNA sequencing but in a"chip"format that allows analysis of12samples at once.The bioanalyzer can be used for analysis of the quality of total RNA preparations by visualizing the rRNA bands and intact mRNA,and to detect and quantify RT-PCR products(using DNA chips;see Klinck et al. 2008;Venables et al.2008,2009).Agilent RNA kits,which are designed for use with the Agilent 2100Bioanalyzer only,contain chips and reagents designed for analysis of RNAs.Each RNA chip contains an interconnected set of microchannels(capillaries)that is used for separation of nucleic acid fragments based on their size as they are driven through the microchannels electrophoretically.The following discussion provides practical information about the use of this equipment and interpretation of results obtained running RNA samples on a bioanalyzer. Step-by-step instructions for operation of this equipment are supplied in the manufacturer’s user manuals.A computer runs the machine,analyzes the traces,and presents the data.Of interest is the trace that estimates the amount of each rRNA that is present and their ratios.Because the larger rRNA is more susceptible to degradation due to its greater length,the ratio of28S to18S rRNA is a convenient measure of the integrity of the sample.This information is displayed by the software. The amount of RNA in the sample is determined by comparison to a fixed known amount of the RNA ladder RNAs.Thus,it is possible to obtain both concentration and integrity of the sample. Because the data are simple to archive and compare,many laboratories that handle and compare many samples believe that this approach is superior to gel analysis,primarily because of its data archiving and comparison ability.Expected Results of Bioanalyzer Analysis of RNA QualityThe quality of purified total RNA can be analyzed using a bioanalyzer,such as the Agilent2100.In Figure2,this bioanalyzer was used to show the presence of18S and28S rRNA(mammalian),18S and25S/26S rRNA(yeast),16S and23S rRNA(bacteria),and small RNA species in total RNA. Typically,for total RNA samples,two major rRNA peaks are observed,because these account for >90%of the total RNA in cells.For eukaryotic total RNA,the two rRNA peaks correspond to the 18S and28S rRNAs;for yeast total RNA,the two large rRNA peaks correspond to the18S and 25S/26S rRNAs;for bacterial total RNA,the two large rRNA peaks correspond to the16S and23S rRNAs(see Fig.2).Tips and Troubleshooting1.Sample preparation for the RNA Nano Chip:i.Ideally,sample concentrations should be100-200ng/µL;RNA concentrations as low as50 ng/µL can be used.ii.Each sample well must contain a total of6µL(1µL for the RNA Pico Chip).iii.The nano marker must be placed in every sample well and the ladder well.iv.Add water or nano marker to unused wells to bring the volume up to6µL.e the chip within5min of preparation to prevent evaporation.Cover the chip with plastic wrap or Parafilm if it will be left standing for any length of time.vi.RNA samples may be denatured to remove secondary structure.Denature for2min at 70°C before placing the samples in the wells of the chip.vii.Genomic DNA can produce stray bands or clog the capillaries in the chip.To check for genomic DNA contamination,treat the samples with DNase I.Run a DNase-I-treated sample next to an untreated sample.2.It is important not to leave the used chip in the bioanalyzer after the run is complete,because this will dry out the electrodes and make them difficult to clean.3.A critical part of the assay is preparing the chip.This involves loading the capillaries with the "gel"matrix material and the dyes that will stain the RNA so that the detector in the machine can measure it.The chip is loaded with a syringe system that is fairly easy to use.Fill each well(make sure that there are no bubbles!),add the sample,vortex,and load into the machine according to the instructions.4.Because this protocol uses small-volume electrophoresis,the samples must be in a low-ionic-strength solution(preferably in RNase-free water or10mM TE buffer).5.Accurate pipetting is very important for reproducible results.Make sure to use properly calibrated pipettes and to place the tip into the center and bottom of each well in the chip when dispensing.To avoid bubbles,do not push past the first resistance point on the pipette.You may pipette up and down gently to mix samples in the wells of the chip.6.Protect the gel-dye mix from light by covering the tube with foil.Return the reagents to the cold room when you are finished.7.When using the priming station,press down slowly and steadily on the plunger when priming.After releasing,the plunger should come up to at least0.7mL in1-2sec.If this does not occur,check that the gasket is clean and retry.If it still does not prime well,change the gasket (see Agilent2100instrument manual).DETERMINING YIELD BY QUANTITATIVE OR SEMIQUANTITATIVE PCRWhen it is not possible to quantitate the amount of RNA in a preparation by any of the methods previously described(e.g.,when the amount of expected RNA is very small),reverse transcription followed by qPCR or semi-qPCR is recommended.These techniques are extremely sensitive and provide information with regard to both the quantity and quality of RNA.In addition,these approaches allow a determination of whether the sample is significantly contaminated with DNA. We recommend assaying a housekeeping mRNA(e.g.,actin,glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase[GAPDH],tubulin,etc.).Again,as with gel electrophoresis,we recommend using a"stock"RNA preparation(diluted as appropriate)as a reference.Parallel assessment with and without reverse transcription will show any DNA contamination(i.e.,amplification without reverse transcription indicates the presence of DNA,unless the PCR primer pairs are in different exons separated by a large intron;in this case,the genomic DNA contamination product will be too large to show up).For RNA preparations in which large RNAs have been removed,it is necessary to assay a small RNA(e.g.,a constitutively expressed micro RNA[miRNA])by RT-PCR. All of the techniques described above are useful methods for assessing the quantity of RNA that has been prepared;gel electrophoresis and qPCR or semi-qPCR also provide information regarding mon sense indicates that if the yield is far below(≥30%)that expected, something has gone wrong with the preparation and the RNA is suspect.Rather than proceeding with a suspect preparation,start over from the beginning.NORTHERN BLOTTING TO ASSESS THE QUALITY OF RNA PREPARATIONSAs discussed previously,gel electrophoresis,visualization of RNA bands,and qPCR or semi-qPCR (in all cases compared with a reference)are valuable methods for assessing quantity as well as quality of RNA.Nevertheless,each of these methods can be potentially misleading.PCR will amplify fragments of RNA,and rRNA visualization is a somewhat crude method for assessingintegrity of an RNA preparation.Moreover,spectrophotometry tells nothing about the integrity of the RNA preparation.By far,the best method for assessing the quality of an RNA preparation is Northern blotting(for an example,see Northern Hybridization[Sambrook and Russell2006]). Because this technique visualizes the entire RNA,it is diagnostic for any degradation.Therefore,if you are working with specific RNAs,we recommend assaying each preparation by Northern blotting.Again,this is best done by comparing the quality(i.e.,sharp band)and quantity of the signal obtained to those obtained from a reference Northern blot performed on RNA of known quantity and quality.WEB RESOURCESNanospectrophotometry/(GE Healthcare NanoVue User Manual28944299AA)/Support.aspx?Type=User%20Guides&Cat=NanoDrop%201000 (NanoDrop User Bulletin T042,Nucleic Acid Purity Ratios)/(Thermo Fisher Scientific,Inc.NanoDrop User Manual[nd-1000-v3.7 User’s Manual])Fluorescent Dye Binding/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/Nucl eic-Acid-Detection-and-Genomics-Technology/Nucleic-Acid-Detection-and-Quantitation-in-Soluti on.html/(Quant-iT RiboGreenRNA Reagent and Kit:mp11490)Bioanalyzer/(Agilent2100Bioanalyzer User Guide;Agilent RNA6000Nano Kit Guide G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook;Quantitation comparison of total RNA using the Agilent2100bioanalyzer,RiboGreen analysis and UV spectrometry;Agilent2100Bioanalyzer User Guide)REFERENCES1.Applied Biosystems.2010.RNA yields from tissues and cells.Appplied Biosystems,Austin, TX,/techlib/append/rna_yields.html.[Abstract/Free Full Text]2.Klinck R,Bramard A,Inke L,Dufresne-Martin G,Gervais-Bird J,Madden R,Paquet ER,Koh C, Venables JP,Prinos P,et al.2008.Multiple alternative splicing markers for ovarian cancer.Cancer Res68:657–663.[Abstract/Free Full Text]3.Lightfoot S.2002.Quantitation comparison of total RNA using the Agilent2100bioanalyzer, ribogreen analysis and UV spectrometry.Agilent Technologies,Palo Alto,CA, /en-US/Search/Library/_layouts/Agilent/PublicationSummary.aspx ?whid=30152&liid=780.[Abstract/Free Full Text]4.Qiagen.2006.RNeasy mini handbook.Qiagen,Germantown,MD, /literature/render.aspx?id=352.[Abstract/Free Full Text]5.Rio DC,Ares M Jr,Hannon GJ,Nilsen TW.2010a.Purification of RNA by SDS solubilization and phenol extraction.Cold Spring Harb Protoc(this issue).doi: 10.1101/pdb.prot5438.[Abstract/Free Full Text]6.Rio DC,Ares M Jr,Hannon GJ,Nilsen TW.2010b.Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers.Cold Spring Harb Protoc(this issue).doi:10.1101/pdb.prot5440.[Abstract/Free Full Text]7.Rio DC,Ares M Jr,Hannon GJ,Nilsen TW.2010c.Removal of DNA from RNA.Cold Spring Harb Protoc(this issue).doi:10.1101/pdb.prot5443.[Abstract/Free Full Text]8.Rio DC,Ares M Jr,Hannon GJ,Nilsen TW.2010d.Polyacrylamide gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc(this issue).doi:10.1101/pdb.prot5444.[Abstract/Free Full Text]9.Rio DC,Ares M Jr,Hannon GJ,Nilsen TW.2010e.Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.Cold Spring Harb Protoc(this issue).doi:10.1101/pdb.prot5445.[Abstract/Free Full Text]10.Sambrook J,Russell DW.2006.Northern hybridization.Cold Spring Harb Protoc doi:10.1101/pdb.prot3723.[Free Full Text]11.Venables JP,Koh CS,Froehlich U,Lapointe E,Couture S,Inkel L,Bramard A,Paquet ER, Watier V,Durand M,et al.2008.Multiple and specific mRNA processing targets for the major human hnRNP proteins.Mol Cell Biol28:6033–6043.[Abstract/Free Full Text]12.Venables JP,Klinck R,Koh C,Gervais-Bird J,Bramard A,Inkel L,Durand M,Couture S, Froehlich U,Lapointe E,et al.2009.Cancer-associated regulation of alternative splicing.Nat Struct Mol Biol16:717–724.[Medline]。

一种快速鉴定RNA 质量的方法

一种快速鉴定RNA 质量的方法（A simple method for identifying the guality of total RNA）随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及,以RNA 为研究对象的实验与日俱增。

RNA 质量的好坏直接关系到后续实验的成败。

Northern印迹杂交分析、寡聚(Oligdt) 纤维素选择分离mRNA、cDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于RNA 的质量。

关键词：RNA质量identifyinggualitytotalRNANorthern印迹mRNAcDNA合成曹廷兵,叶治家,巩燕,彭家和(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室, 400038 重庆)提要:目的建立一种快速鉴定RNA 完整性的方法。

方法在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上,结合甲醛变性琼脂糖凝胶电泳加以改进而成。

结果提取的总RNA 用此方法电泳后可得到28S、18S、5. 8S(5S) 三条清晰的rRNA 条带。

结论此方法可以达到对RNA 完整性进行快速鉴定的目的。

随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及,以RNA 为研究对象的实验与日俱增。

RNA 质量的好坏直接关系到后续实验的成败。

Northern 印迹杂交分析、寡聚(Oligd t) 纤维素选择分离mRNA、cDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于RNA 的质量。

因此在进行这些实验之前对RNA 的质量进行快速可靠的鉴定就十分必要。

目前RNA 的质量采用变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定[1 ] ,这些方法步骤繁琐、费时、费力。

我室在长期进行RNA 的研究中,摸索出了一套稳定、快速和可靠的鉴定RNA 质量的方法,现报道如下。

1 材料与方法1. 1 主要试剂提取RNA 的TriPure Isolation Reagent 试剂盒、DEPC 等购自B.M公司,常规试剂如琼脂糖等为进口或国产AR 级以上。

rna提取注意事项

rna提取注意事项
x
RNA提取注意事项
1. 样品的收集要快：样品到达实验室后，应尽快进行处理，及时提取RNA，减少样品的RNA失活。

2. 避免RNA的降解：RNA的降解是最大的害处，所以要尽快把RNA提取出来，并尽量避免样品暴露在高温高水分的环境下，同时也要避免样品中RNA受到酶活性物质的污染，以免影响RNA的破坏，一般采用8％聚丙烯（PAGE）来保护RNA。

3. 提取RNA时要严格控制实验条件：RNA的提取一般要求室温下进行操作，如果操作温度过高，会使RNA降解；RNA的提取中，要求操作中保持干净无污染，且不能有RNA外源物质的入侵；实验后存放的液体也要物理和化学上尽量保持稳定，以保证RNA提取后的完整性。

4. 选择合适的提取方法：不同的提取方法有不同的优缺点，在选择提取方法时，应考虑样品材料的种类、RNA特性（类型、分子量）、细胞类型和细胞性质等，以确保提取到最优质的RNA。

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如何确认RNA提取后的质量

一般通过总量，纯度与完整性三大项检测来确认RNA质量：
1总量：微量分光光度计测260nm吸收值计算。

2纯度：微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。

3完整性：以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。

RNA质检参数中260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。

其中：
A230: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等。

A260：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。

A280：蛋白质的吸收峰。

一般的，我们只看OD260/OD280(Ratio，R)在1.8~2.1范围内时，我们认为RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。

当R < 1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。

当R > 2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了，而纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。

rna质控标准

RNA质控标准
RNA质控是分子生物学实验中的重要环节，其目的是确保RNA样品的质量和纯度，以获得准确可靠的实验结果。

以下是一些RNA质控标准的示例：
1. 提取RNA的标准：提取RNA的过程需要严格控制各种因素，包括RNA的提取时间、提取试剂的种类和浓度等。

因此，在提取RNA时，需要使用标准化的提取试剂和操作流程，并对提取的RNA进行定量和质量分析。

2. RNA纯度的标准：纯度是评估RNA样品质量的重要指标。

在实验中，可以使用琼脂糖凝胶电泳、密度梯度离心等方法对RNA样品进行纯度分析。

同时，还可以使用生物素标记、荧光标记等方法对RNA进行标记和检测。

3. RNA浓度的标准：RNA浓度是评估RNA样品质量的另一个重要指标。

在实验中，可以使用紫外吸收法、荧光法等方法对RNA进行浓度测定。

同时，还可以使用标准化的RNA标准品，对RNA样品进行浓度比较和质控。

4. RNA完整性的标准：RNA的完整性是保证实验结果准确性的关键因素之一。

在实验中，可以使用RNase消化法、DNase I消化法等方法对RNA进行完整性检测。

同时，还可以使用限制性内切酶分析、PCR分析等方法对RNA进行完整性检测。

综上所述，RNA质控的标准主要包括提取、纯度、浓度和完整性等方面。

在实验中，需要根据具体的实验需求和目的，选择相应的RNA质控标准，并对RNA样品进行全面的质量控制和检测。

RNA提取常见问题分析

RNA提取常见问题分析1 RNA抽提中自备有机溶液的配制及保存问题2总RNA 的非变性电泳检测3 RNA质量检测与鉴定4 关于RNA样品中基因组DNA污染的问题1 RNA抽提中自备有机溶液的配制及保存问题RNA 抽提中涉及的有机试剂包括苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇等。

苯酚的使用和保存：苯酚基本已经商品化，选择和保存都不应该有什么问题，4℃避光保存即可；只强调一点：尽管Tris 饱和的苯酚也可以用于RNA 的抽提，但使用水饱和苯酚会更好一些，因为RNA 在pH 7 以上的溶液中，发生降解的机率大大提高。

下面是关于氯仿、异丙醇、乙醇的有关建议。

选择：国内大的化学试剂公司生产或者监制的分析纯级别试剂（AR）就完全可以满足要求。

如国药集团，西陇化工等。

预处理：不需要进行任何的预处理。

绝对不可以高温高压灭菌，这三种试剂的沸点都低于100℃，高温高压可能导致危险。

75% 乙醇的配制一份无菌无酶的水（DEPC水）与 3 份(体积)无水乙醇混匀即成。

不要使用量筒等过渡容器。

事实上，70% - 80% 的乙醇都具有较好的洗涤能力，使用都不会导致片段比较大的核酸的丢失，所以，配制时就不要为了准确而左勾右兑。

75% 乙醇也不可以高温高压灭菌，原因同无水乙醇。

保存：第一，要使用新的未开封的试剂，用后做好标记。

其次，分成相对小一点的包装(50ml –100ml)；500ml 的瓶子取液是非常不方便的，移液器的杆子往往都进入了瓶口里，非常容易造成污染。

第三，塑料瓶子密闭性好，装醇类试剂是非常好的选择；但氯仿绝对不要使用塑料瓶子。

第四，盖紧瓶盖，作好标记。

第五，保存于室温。

将有机试剂保存于冰箱的人不在少数，但这么做却是令人奇怪的。

首先，任何挥发性的东西都不保存在冰箱(除非万不得已，如DEPC)。

其次，与外面相比，冰箱除了灰尘少一点外，什么都会比外面多。

第三，在室温打开低温的瓶子，将导致空气大量进入瓶子，增加了污染的风险。

使用：非常幸运的是，有机试剂对菌污染和酶污染似乎有我们想象不到的抑制和灭活作用，所以，使用这些试剂没有特殊的要求，按正常抽提RNA 的要求就完全可以了。

rna的鉴定实验报告

rna的鉴定实验报告RNA的鉴定实验报告引言：RNA（核糖核酸）是一种重要的生物分子，它在细胞内起着传递遗传信息和蛋白质合成的关键作用。

为了深入了解RNA的结构和功能，本实验旨在通过一系列鉴定实验，对RNA进行详细的分析和研究。

实验一：RNA的提取与纯化首先，我们从细菌或植物细胞中提取RNA。

这一步骤的关键是使用合适的缓冲液和酶来破坏细胞膜和核膜，释放出RNA。

随后，通过离心等手段，将RNA从其他细胞组分中分离出来。

最后，通过酒精沉淀法将RNA纯化，去除杂质。

实验二：RNA的电泳分析为了确定提取到的RNA的纯度和完整性，我们进行了RNA的电泳分析。

首先，将RNA样品与一定浓度的缓冲液混合，然后将混合物加载到琼脂糖凝胶上。

随后，通过电场作用，RNA在琼脂糖凝胶中移动，根据RNA分子量的不同，形成不同的条带。

最后，通过紫外光照射，观察和记录RNA的分离情况。

实验三：RNA的逆转录与扩增为了进一步研究RNA的表达情况，我们进行了RNA的逆转录与扩增实验。

逆转录是将RNA转化为DNA的过程，通过引入逆转录酶和适当的引物，将RNA的信息转录成相应的DNA序列。

随后，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增DNA，使其数量增加，以便进行下一步的分析和研究。

实验四：RNA的序列测定为了确定RNA的具体序列，我们进行了RNA的序列测定实验。

通过使用高通量测序技术，我们能够快速、准确地测定RNA的碱基序列。

这一步骤的关键是将RNA转化为cDNA，并引入特定的DNA引物，然后通过测序仪对DNA进行测序。

最终，我们可以得到RNA的详细序列信息。

实验五：RNA的功能研究在了解RNA的序列后，我们进行了RNA的功能研究。

通过生物信息学分析和实验验证，我们可以确定RNA的功能和作用机制。

例如，我们可以通过敲除实验来验证某个RNA在细胞中的功能，或者通过RNA干扰技术来研究RNA对基因表达的调控作用。

结论：通过一系列的实验，我们对RNA进行了全面的鉴定和研究。

RNA质量评价

RNA纯度及浓度检测完整性： RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：1.2%胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟）检测完整性。

由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。

动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA 大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。

RNA样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。

出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度： OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。

高质量的RNA 样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。

OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。

同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40分光光度法检测RNA浓度的步骤⑴取1μl RNA原液，放在0.5ml EP管中，加入999μl dd H2O（DEPC处理的水），用移液枪反复混匀。

⑵用dd H2O为空白对照，调节A260零点。

⑶倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A260值。

倒掉比色杯中的RNA样液，用dd H2O冲洗比色杯，再调节A280零点。

⑷倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A280值。

鉴定rna质量的方法

鉴定rna质量的方法鉴定RNA质量RNA质量的鉴定对于许多实验室的分子生物学研究非常重要。

一个准确可靠的RNA质量评估方法可以确保实验结果可靠且具有可重复性。

本文将介绍几种常用的鉴定RNA质量的方法。

1. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常见的RNA质量检测方法。

通过将RNA样品加入琼脂糖凝胶中，然后进行电泳，可根据RNA的大小，形态和完整性来评估其质量。

琼脂糖凝胶电泳可以区分出rRNA，mRNA和tRNA 等不同类型的RNA。

此外，还可以检测到降解或者污染的RNA，如DNA 或蛋白质。

2. 紫外线吸收光谱紫外线吸收光谱是一种快速检测RNA质量的方法。

通过测量RNA 在紫外线区域的吸收能力，可以判断RNA的纯度和完整性。

正常情况下，RNA在260nm的波长处吸收最强，而在280nm处吸收相对较弱。

如果RNA的260nm/280nm比值接近2，表明RNA的纯度较高。

此外，通过测量260nm/230nm比值，可以评估RNA中是否有污染物。

3. 瑞利比（RQI）瑞利比（RQI）是一种普遍被应用于高通量RNA序列鉴定的方法。

它通过评估RNA的完整性来定量鉴定RNA质量。

RQI值介于0和10之间，数值越接近10表示RNA完整性越好。

RQI值可以通过使用一种商业化的仪器进行自动化测量，也可以通过分析电泳图像来手动计算。

4. 聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PCR）可以用于评估RNA的质量。

通过特定的引物，可以选择性地扩增RNA样品中的特定片段。

如果PCR结果呈现出预期产物的带状条带，表明RNA质量良好。

然而，PCR也有一定局限性，如无法检测rRNA和tRNA等非多聚腺苷酸链RNA。

5. 生物分析仪器现代生物分析仪器可以通过电泳和光谱等技术来准确评估RNA质量。

这些仪器具有高灵敏度和高分辨率，可以检测微量的RNA，并同时提供多种参数来全面评估RNA的质量，如RNA浓度、纯度、完整性等。

6. RNA质量相关的细胞生物学实验除了上述常见的方法外，RNA质量的好坏也可以通过一些细胞生物学实验来评估。

RNA的质量检测以及RNA酶的确定

【经验】如何确认RNA的质量各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！以下两种方法，相信大家都知道的：1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。

一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。

1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。

当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。

当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。

如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。

纯RNA的A260/A280的比值为2.0。

A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。

2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。

电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。

一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S 的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。

以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。

一种快速鉴定RNA质量的方法

理，活Ｒａｅ如Ｅ灭Ｎｓ，Ｐ管、ｉ等；外，一个良好Ｔｐ头另有的操作环境也是非常的重要。ＲＡ质量如何、否被降解通常采用甲醛变性琼Ｎ是脂糖凝胶电泳方法来鉴定。此电泳的主要目的之一是为了Ｎｒｅｌ之用。但在ＲＡ的其他用途中，ｏｔｒｂｏｈｎｔＮ如ｃＮＤＡ合成和寡聚（ｌｄ纤维素选择分离ｍＲＡ等ＯｉＴ）ｇＮ实验中要对ＲＡ进行质量鉴定，方法就现得繁琐、Ｎ此费时、力，费而用常规琼脂糖凝胶电泳ＲＡ会水解而Ｎ达不到鉴定的目的，果用本研究改进的１２琼脂如．％
曹廷兵，治家，叶巩燕，家和彭（第一军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，０３重庆）４０８０
提要：目的建立一种快速鉴定ＲＡ完整性的方法。方法在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上，合甲醛变性琼脂糖凝胶电Ｎ结泳加以改进而成。结果提取的总ＲＡ用此方法电泳后可得到２Ｓ１Ｓ５８（ｓ三条清晰的ｒＮＮ８、８、．ｓｓ）ＲＡ条带。结论此方法可以达到对ＲＡ完整性进行快速鉴定的目的。Ｎ
２结果
取人胎盘组织ＲＡ３和６ｇ按本方法以１２的琼脂糖Ｎｔ，ｘ．％凝胶进行电泳，见２ＳｌＳ５８（Ｓ三条清晰的ｒＮ条带。可８、８、．Ｓ５）ＲＡ

小谈RNA质量鉴定

小谈RNA质量鉴定之前我们提到过：分离完整的RNA对于基因表达分析研究非常重要。

那么具体如何进行RNA的质量鉴定呢？今天，小翊师妹就和大家详细聊一聊。

众所周知，RNA质量包括完整度和纯度两个方面。

大家知道，低纯度的RNA会严重影响下游的RT-qPCR反应。

•若RNA中含有一些酚类等小分子化合物则会抑制下游的RT-qPCR反应；•若RNA受到DNA等基因组的污染，则会影响qPCR实验数据。

通常我们会通过电泳和OD值的测定来对RNA完整度和纯度进行鉴定。

RNA电泳该方法是评估RNA完整性最常用、最简单快速的方法。

完整RNA电泳图1）完整的RNA通常会有三条带，有的也会两条带（有些试剂盒提取的时候会过滤掉5S条带）2）最亮的条带为28S条带，其次为18S条带，最淡条带为5S条带；28S条带亮度应为18S条带亮度的2倍左右。

通常在我们得到的电泳结果也会出现多种异常现象，如下：•RNA条带降解RNA降解降解可能出现在提取过程或电泳过程。

建议：1）在RNA提取过程中，应严格操作，全程避免RNA酶的污染，同时保证组织材料的新鲜。

2）在电泳时，应换用新鲜的电泳液，新制备的凝胶，同时应较高电压短时间电泳（20 min）。

•RNA条带弥散条带弥散出现条带弥散的原因：RNA被核酸酶降解；电压或电流过大；上样量过高或过低等。

建议：1）应避免上述RNA降解出现的问题。

2）控制电压勿过高或过低，一般5—8 V/cm即可；避免电泳时间过长。

在电泳开始的前几分钟建议使用低电压。

•点样孔发亮点样孔发亮a：RNA样品的污染（含有杂质，如蛋白的残留，可能的原因为RNA提取过程中的操作问题：如氯仿加入量过少，不能充分变性蛋白；氯仿加入量过多，使DNA和蛋白进入水相，影响RNA的提取质量）。

b：胶的问题：如未能凝固好，RNA样品无法很好的往前涌动，同时上样量可能过大。

•电泳结果多条带电泳结果多条带1）RNA降解（解析见上文）。

2）上样量过大（RNA种类较多，过大上样量会出现除rRNA之外的条带）。

[宝典]琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量作者：未知来源：生物秀时间：2006-9-3一．原理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。

其中，凝胶电泳由于其操作简便、快速、灵敏等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。

与蛋白质分子类似，核酸分子也是两性解离分子。

在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0-8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。

不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。

所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使不同分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。

1）影响泳动的四大因素：① 影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。

一般来说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物的摩擦力越大，泳动速率越小。

即泳动率与颗粒的分子大小、介质粘度成反比；与颗粒所带电荷成正比。

② 支持物介质：DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。

通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片断。

琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断；聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。

③ 电场强度：电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。

电场强度愈大，带电颗粒的泳动率愈快，但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。

在低电压时，线性DNA分子的泳动率与电压成正比。

一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm。

④ 缓冲液离子强度：缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。

Tris·Cl缓冲体系中，由于Cl-的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常用TAE、TBE、TPE三种缓冲体系。

mrna质量标准

mrna质量标准
一、纯度
1.mRNA的纯度应达到95%以上，不应含有其他杂质，如DNA、蛋白质等。

2.通过高效液相色谱（HPLC）等方法对mRNA进行纯度检测，确保其纯度
符合标准。

二、完整性
1.通过凝胶电泳等方法对mRNA进行完整性检测，确保其长度完整且无断裂。

2.完整性好的mRNA应具有清晰的条带，且条带无拖尾或模糊现象。

三、浓度与分子量
1.通过紫外分光光度计等方法对mRNA的浓度进行准确测量，确保其浓度符
合标准。

2.通过分子量标准品等方法对mRNA的分子量进行检测，确保其分子量符合
预期。

四、功能性
1.通过荧光定量PCR等方法对mRNA的功能性进行检测，确保其能够被细胞
有效转录和翻译。

2.功能性好的mRNA应能够产生预期的蛋白质产物。

五、均一性
1.对同一批次的mRNA样品进行检测，确保其在各个指标上的均一性，如纯
度、完整性、浓度等。

2.均一性好的mRNA样品应具有一致的生物活性和稳定性，适用于大规模生
产和应用。

以上是mRNA质量标准的主要内容，这些标准对于保证mRNA产品的质量和稳定性具有重要意义。

在生产和使用过程中，应严格遵守这些标准，确保mRNA产品的安全性和有效性。

dsrna 质量标准

dsrna 质量标准根据您的要求，以下是关于"dsrna质量标准"的文章：DSRNA 质量标准DSRNA（Double-stranded RNA）是指由两条互补链组成的RNA分子，具有许多重要的应用潜力，包括基因沉默、药物研发和农业改良等。

然而，在利用DSRNA进行研究和应用之前，确保其质量非常关键。

本文将介绍DSRNA的质量标准以及评估DSRNA质量的常见方法。

一、DSRNA 质量标准1. 纯度DSRNA的纯度是一个关键的质量标准。

纯度可以通过凝胶电泳或高效液相色谱（HPLC）分析来确定。

在凝胶电泳中，纯净的DSRNA会显示出一个单一的、清晰的带状，而杂质则会表现为额外的带状。

HPLC分析则可以提供更准确的纯度信息，可以检测到更小的杂质。

2. 分子量DSRNA的分子量也是其质量标准之一。

分子量可以通过凝胶电泳、质谱或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析来确定。

其中，PAGE分析常用于精确测定DSRNA的分子量，并可根据结果进行纠偏修正。

3. 双链完整性DSRNA的双链结构和完整性对于其功能至关重要。

使用RNA酶的小片段检测或DNase酶的降解实验可以评估DSRNA的双链完整性。

在这些实验中，双链完整的DSRNA将不易被降解，而不完整的DSRNA则容易受到酶的作用而被切割。

4. 终止物DSRNA的合成过程中可能产生未去除的合成终止物或副产物，这些终止物会影响DSRNA的质量和应用效果。

通过质谱或HPLC分析可以检测和鉴定DSRNA中的终止物，并在合适的情况下进行去除或纠正。

二、DSRNA质量评估方法1. 凝胶电泳凝胶电泳是一种常见的DSRNA质量评估方法。

将DSRNA样品加载到凝胶中，并在电场下进行电泳，可以根据DSRNA的大小和电荷分布来区分纯净的DSRNA和杂质。

2. 高效液相色谱（HPLC）HPLC是一种高分辨率的分析技术，可用于评估DSRNA的纯度和分子量。

通过将DSRNA样品溶解后注入HPLC系统，利用分离柱和特定流动相条件，可以实现对DSRNA的准确分离和分析。

大家好，给大家介绍一下，这是RNA质检结果解读指南

大家好，给大家介绍一下，这是RNA质检结果解读指南师姐，上次你给我讲的RNA提取小诀窍太有用了，之后提取RNA 一直很顺利，走咱俩看电影去呗~不用谢，应该的嘛~，看电影没问题。

师姐实验很顺利，有的是时间~师姐你怎么这么神？说到实验我又遇到了新问题，RNA检测报告我看不明白，求教师姐~没问题，不过电影是不是还得再看一次啊~好啊，没问题~继上次小编帮助学弟解答RNA提取相关问题后，（感兴趣的小伙伴可戳RNA提取又不合格？那你一定需要了解这些~），又要为小师弟解答RNA检测相关的问题~你若是也存在同样的疑惑，请认真听小编的讲解~检测方法1）1％的琼脂糖电泳检测RNA样品是否有降解以及杂质。

2）NanoPhotometer® 分光光度计检测样品纯度。

3）Qubit® 3.0 Flurometer检测RNA样品浓度。

4）安捷伦2100 RNA Nano 6000 Assay Kit检测RNA样品的完整性。

涉及指标RNA样本总量及完整性是评判样品质量的关键点，其中RNA完整性评估依靠RIN值、28S/18S（或者23S/16S）以及Agilent 2100 检测峰图基线是否平整来综合评判。

对于降解样本难以获取完整的转录本信息，影响数据质量及完整性。

当RNA总量较低时，会导致建库成功率低，或数据dup率高等问题。

下面小编就来详细介绍每个指标代表的意义。

RNA电泳胶图RNA 电泳胶图主要需查看以下几方面：1）看目的条带是否明亮清晰2）看泳道内是否有降解弥散区3）看胶孔处有无蛋白污染4）看有无DNA污染5）看有无外源物种核酸污染目的条带明亮清晰，泳道无弥散区，无蛋白和DNA污染的样品质量较好。

动物样品胶图上可见目的条带为28S、18S、5S，植物样品为25S、18S、5S，昆虫或者软体动物18S、5S，原核样品23S、16S、5S。

下面是两组不同质量的RNA电泳图示例。

RNA质量较好的示例外源污染和降解示例RIN值RNA Integrity Number（RIN）数值大小即反应样品完整性情况，数值越接近10表明样品完整性越高，反之RIN值越小完整性越差。

实验四 RNA的提取及其纯度检测

实验四RNA的提取及其纯度检测实验目的：了解Trizol提取总RNA的原理，掌握高质量完整总RNA提取的技术以及电泳变性胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。

实验原理Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。

在加入氯仿离心后，RNA保留在水相中，与DNA和蛋白质分离开来（保留在有机相中）。

吸取水相，加入异丙醇成淀RNA，从而得到完整纯度高的总RNA。

实验内容材料小鼠新鲜肝试剂总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，无水乙醇，已丙醇；电泳试剂：TAE，上样缓冲液（50%甘油，10 mM EDTA，0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯青），琼脂糖。

操作步骤总RNA的提取1小鼠肝组织的匀浆裂解断颈处死小鼠，立即解剖取出肝脏，取50-100mg到玻璃匀浆器中，假如1mlTrizol反复匀浆膜碎组织，使细胞完全裂解。

按1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，震荡15秒，室温放置3分钟，12000×g，4℃离心15分钟。

2 RNA的沉淀将离心的上清转移到新的离心管中，按1 ml Trizol加入0.5ml异丙醇，震荡15秒，室温放置10分钟，12000×g，4℃离心10分钟。

3 RNA的洗涤与溶解吸掉上清，加入1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀，4℃，7500×g离心5分钟。

吸掉上清，空气干燥RNA沉淀10分钟，加入适量的DEPC处理水（50μl）溶解RNA，立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定，剩余-70℃保存备用。

结果在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S和5S，其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮度的2背左右，说明RNA保持完整。

紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀释，利用紫外分光光度计测定A260和A280值，根据1OD=40ug定量,并计算A260/A280比值，每一样品重复3次。

RNA抽提之应知应会

RNA抽提之应知应会第一篇：RNA 抽提之应知应会RNA 抽提之应知应会背景介绍对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组DNA 抽提要困难得多。

事实上，现有的RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA 更方便，成功率也更高。

那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。

关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。

现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。

在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。

细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。

也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。

因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。

但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。

这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。

匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase 降解 RNA 的速度快。

电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。

因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100% 能获得解决。

影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。

总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。

用OD值评判DNA和RNA质量

用OD值评判DNA和RNA质量1、根据OD值计算核酸浓度因为核酸分子里含有嘌呤和嘧啶，它们具有共轭双键，在波长260 nm处有最大吸收峰，所以核酸的最大吸收波长是260 nm。

蛋白质的最大吸收波长是280 nm。

在波长260 nm处测定的OD值记为OD 260 。

如果样本是纯净的，OD 260值可以用于计算核酸样品的浓度。

1 OD 260相当于50 μg/mL双链DNA，或者30 μg/mL(40 μg/mL)单链DNA(RNA)，或者20 μg/mL寡核苷酸。

2、根据OD值评估核酸纯度在波长260 nm和280 nm 处测定的OD值的比值记为OD 260/280 。

它可以用于评估核酸样品的纯度。

纯DNA的OD 260/280比值为1.8;纯RNA的OD 260/280比值为2.0。

通常情况下，提取之后经过适当纯化、纯度较高的DNA样品，OD 260/280在1.6-1.8之间，能够满足大多数分子生物学实验的要求;经过纯化、纯度较高的RNA样品，OD 260/280在1.9-2.0之间，也能够满足大多数分子生物学实验的要求。

如果DNA样品的OD 260/280比值高于1.8，表明该DNA样品中有RNA残留;低于1.6，表明有蛋白质和/或苯酚残留(也称为污染)。

如果RNA样品的OD 260/280比值高于2.0，表明有异硫氰酸胍残留;低于1.9，表明有蛋白质和/或苯酚残留。

另外，OD 230用于评估样品中是否存在碳水化合物、多肽、苯酚等污染物。

较纯净的核酸样品，OD 260 /230比值大于2.0。

3、影响OD值的因素当一束光通过一种吸光物质(通常为溶液)时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。

吸光度(absorbance，A)就是用来衡量光被吸收程度的物理量。

吸光度是指光线通过溶液(或某一物质)前的入射光强度与通过溶液(或某一物质)后的透射光强度的比值的对数。

吸光度也称为光密度(optical density，OD)，二者是同义词。