第11章 紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法教学课件
定义和概述
定义
紫外-可见分光光度法是一种基于 物质分子对紫外-可见光的吸收特 性来进行定量和定性分析的方法 。
概述
该方法通过测量物质在特定波长 下的吸光度，分析其光谱特征， 从而确定物质的结构和含量。
02
基础知识
光的性质
光的波动性
光是一种电磁波，具有振幅、频率和波长等特性。
光的粒子性
光同时具有粒子性质，表现为能量和动量。
数据处理和分析
01 数据导入 将实验数据导入到数据处理软件中。
02 基线校正 对光谱数据进行基线校正，消除背景干扰。
03 峰识别 识别光谱中的特征峰，确定特征波长和吸光度值。
04
浓度计算
根据标准曲线或已知浓度样品的数据，计算待测物质 的浓度或含量。
05
结果分析
对实验结果进行分析和解释，评估实验的准确性和可 靠性。
未来发展方向和挑战
发展方向
随着科技的不断进步，紫外-可见分光光度法将朝着高灵敏度、高分辨率和多元素同时测定的方向发展。新技术 和方法的应用将进一步提高该方法的检测能力和应用范围。
挑战
尽管紫外-可见分光光度法已经取得了显著的进展，但仍面临一些挑战。例如，复杂样品中干扰物质的消除、痕 量物质的准确测定以及新型光学器件的开发和应用等。为了解决这些挑战，需要不断进行研究和探索，加强跨学 科的合作与交流。
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分子结构和光谱的关系
分子结构决定了物质对光的吸 收和散射能力，从而影响其光 谱特征。
共轭双键、芳香环和生色团等 结构因素对紫外-可见光谱有显 著影响。
通过分析物质的光谱特征，可 以推断其分子结构，进而用于 物质的鉴别和结构分析。
04
最新药物分析教案——第十一章甾体激素类药物的分析
最新药物分析教案——第⼗⼀章甾体激素类药物的分析第⼗⼀章甾体激素类药物的分析⼀、定义和分类定义：甾体激素类药物是指具有甾体结构的激素类药物，主要包括肾上腺⽪质激素和性激素。
分类：甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾甾⼆、结构特征甾体激素类药物的母体结构为环戊烷多氢菲，共有A、B、C、D四个环。
10、13位有甲基，为雄甾烷，雄激素母体13位有甲基，为同化激素母体10、13位有甲基，17位有⼄基（⼆个碳原⼦），为孕甾烷，孕激素母体A环位苯环，13位有甲基，为雌甾烷，雌激素母体1、糖⽪质激素结构特征甾甾甾甾甾1、2位引⼊双键，如泼尼松，氢化泼尼松，氟轻松，地塞⽶松等；9位引⼊氟：如氟轻松，地塞⽶松，倍他⽶松等；11位引⼊羟基或羰基：如泼尼松→氢化泼尼松，可的松→氢化可的松；16位引⼊甲基或羟基：如引⼊甲基,地塞⽶松，倍他⽶松；引⼊羟基，曲安萘德；这些结构改变，引出⼀⼤类糖⽪质激素类药物。
结构特征：○1A环3位羰基，4，5位双键，形成共轭体系，Δ4－3－酮；○2C环11位上有扬原⼦，羰基或羟基（β－⽤实线表⽰）；○3D环17位上有α－羟基（⽤虚线表⽰）；○4D环17位上有α－醇酮基（O=C-CH2OH），醇有时成酯形式存在，以醋酸酯较常见。
○56，9位可以有氟原⼦。
总之，可供分析⽤的主要基团有：Δ4－3－酮，17－α－醇酮基，有机氟，酯类结构。
2、雄激素和蛋⽩同化激素结构特征：○1A环，Δ4－3－酮○217位β-OH○3雄激素：10，13位有甲基，同化激素：10位⽆甲基3、雌激素和孕激素雌激素结构特征：○1A环为苯环○23位为酚羟基○317位β－OH或有⼄炔基○410⽆甲基孕激素结构特征：○1A环，Δ4－3－酮○217位有羟基（黄体酮除外）○317位甲基酮17－CO-CH3○410位有些有甲基，有些⽆甲基。
紫外-可见分光光度法 PPT课件
若化合物在某波长处有强的吸收峰，而所含杂质在该波长处 无吸收或吸收很弱，则化合物的吸光系数将降低，若杂质在
该波长有比此化合物更强的吸收，将会使化合物的吸光系数
增大，且会使化合物的吸收光谱变形。（举一个间接的例子
吧，前一段时间快检车抽到一批吗叮啉，红外快检认定是假
药，送到所里以后，我们用薄层法做了一下，发现样品也显
百分吸收系数 377
吸收度值 277nm 0.461
0.461×0.2609×100.00×200.00
含量=-----------------------------------×100%=96.97%
377×0.0658×5.00×0.2×100
二、多组分定量测定 解线性方程组法 等吸收双波长消去法 系数倍率法 导数光谱法
面神经麻痹的病理变化早期主要为面神经水肿髓鞘和轴突有不同程度的变性以在茎乳突孔和面神经管内的部分尤为显著w五测定时除另有规定外应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照测定吸光度实际上是透光率而在测定光强弱时不只是由于被测物质的吸收所致还有溶剂和容器的吸收光的色散和界面反射等因素都可使透射光减弱用空白对照可排除这些因素的干扰
由上图可以看出吸收光谱的特征： ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称 最大吸收波长，以λmax表示。 ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，所对应的波 长，称最小吸收波长，以λmin 表示。 ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，形状像 肩的部位，称肩峰，以λsh表示。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处， 吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
利用物质的吸收光谱进行定量、定性及结构 分析的方法称为吸收光谱分析法。紫外－可 见吸收光谱是一种分子吸收光谱，它是由于 分子中原子的外层电子跃迁而产生的。
1紫外可见分光光度法精选全文
可编辑修改精选全文完整版1．紫外可见分光光度法1.1 概述物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。
紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。
即物质在一定波长的吸光度与它的吸收介质的厚度和吸光物质的浓度呈正比。
当分子中含有一个或更多的生色基团（即具有不饱和键的原子基团），辐射就会引起分子中电子能量的改变。
常见的生色团有：如果两个生色团之间只隔一个碳原子，则形成共轭基团，会使吸收带移向较长的波长处（即红移），且吸收带的强度显著增加。
当分子中含有助色基团（有未共用电子对的基团）时，也会产生红移效应。
常见的助色基团有：-OH, -NH2, -SH, -Cl, -Br, -I。
紫外可见分光光度法从问世以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全，使得光度法的应用更拓宽了范围。
目前，分光光度法已为工农业各个部门和科学研究的各个领域所广泛采用，成为人们从事生产和科研的有力测试手段。
我国在分析化学领域有着坚实的基础，在分光光度分析方法和仪器的制造方面在国际上都已达到一定的水平。
1.2 特点分光光度法对于分析人员来说，可以说是最有用的工具之一。
几乎每一个分析实验室都离不开紫外可见分光光度计。
分光光度法的主要特点为：（1）应用广泛由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。
到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素（除少数放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。
紫外可见吸收光谱法
紫外可见分光光度计的校正
当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移， 因此需要对其进行校正。 波长标度校正：
光源法校正：氘灯（486.00 nm；656.10 nm） 使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行
校正 吸光度标度校正： 采用 K2CrO4 标准液校正（在25oC时，于不同波长处测定 含0.0400g/L K2Cr2O7的0.05mol·L－1 NaOH溶液的吸光度A， 调整光度计使其A与标准值对应。
（带孤对电子的杂原子与其他π键共轭）
化合物
CH3COOH CH3CONH2 CH3N＝NCH3 CH3－NO2
CH3COCH3
饱和醛酮
max/nm
204 214 339 280 186 280 280～300
41 60 5 22 1000( n→σ*) 16 ( n→π*)
备注
在乙醇中 在H2O中 在乙醇中 在异辛烷中
第十一章 紫外可见吸收光谱法
Ultraviolet-visible Absorption Spectrometry
1
化妆品安全吗？
化妆品中含重金属并不罕见，不过加拿大近期一项对49个知 名品牌化妆品的测试结果还是足以令人大吃一惊，所有化妆品中 几乎都“潜伏”着砷、镉、铅等有毒物质。其中，倩碧的幻真控 油粉底液含有砷、铍、镉、镍、铅和铊6种有毒物质，睫毛膏 “Bare Naturale”，也被检测出含有和倩碧一样的6种有毒物。
和强度。
30
物质对光的选择性吸收
当光束照射到 物质上时，光与 物质发生相互作 用，于是产生反 射、散射、吸收 或透射，如图所 示。
31
物质对光的选择性吸收（1）
当一束光照射到物质或其溶液时，物质的分子、 原子或离子与光发生“碰撞”，光子的能量就转 移到分子、原子上，这些粒子由最低能态（基态） 跃迁到较高能态（激发态），这个作用叫物质对 光的吸收。 物质对光的吸收有选择性：
第十一章 紫外-可见分光光度法
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example
分子中价电子能级及跃迁示意图
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轨道和轨道示意图
+ –+ +++
+
– *
+
+
–
C
C
–
+
+
+
C
C
–
–
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+
–
CC
*
–
+
+
CC
–
返回
共轭双键的离域作用
４
*
３
*
最高空轨道
E>E →跃迁几率↑→↑ ； E↓→↑
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11.1.2 紫外-可见吸收光谱中的常用术语
• 吸收光谱的特征 • 生色团和助色团 • 红移与蓝(紫)移 • 增色效应和减色效应 • 强带和弱带 强带(strong band) max>104
弱带(weak band) max<102
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吸收光谱(absorption spectrum)的特征
吸收峰 末端吸收A(end abso↓rption)
谷
肩峰(shoulder peak)
↓
吸收峰
↓ 谷
↓
min max sh
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min max λ
第十一章紫外可见分光光度法第十一章紫外
第十一章紫外-可见分光光度法第十一章紫外-可见分光光度法第一节概述1．电磁辐射和电磁波谱在仪器分析中，根据物质发射的电磁辐射或物质与辐射的相互作用所建立起来分析方法，统称为光学分析法。
根据物质与辐射能间作用的性质不同，光学分析法又分为光谱法和非光谱法。
当物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁，根据能级跃迁所产生的辐射能强度随波长变化所得的图谱称为光谱(spectrum)。
利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法(spectroscopic analysis)，简称光谱法。
光谱分析法从不同的角度分为不同的类别。
如按作用物是分子或原子，可分为分子光谱法和原子谱法；物质与辐射能间的转换方向(能级跃迁方向)，可分为吸收光谱法和发射光谱法；按辐射源的波长不同，可分为红外光谱法、可见光谱法、紫外光谱法、X-射线光谱法等。
非光谱分析法是物质受辐射线照射时，改变电磁波的传播方向、速度等物理性质所建立起来的分析方法。
这种方法不涉及能量转移和物质内部的能级跃迁，如折光分析法、旋光分析法、X-射线衍射法等。
2．物质对光的选择性吸收当辐射能通过某些吸光物质时，物质的原子或分子吸收与其能级跃迁相应的能量由低能态跃迁至较高的能态，这种由物质对辐射能的选择性吸收而得到的原子或分子光谱称为吸收光谱。
几种常用的吸收光谱是：原子吸收光谱、分子吸收光谱、核磁共振光谱等。
各种色光的波长范围在可见光中，紫色光的波长最短能量最大，红色光的波长最长能量最小。
除此之外，波长小于400nm 的光称为紫外光，波长大于760nm 的光称为红外光。
如果适当选配两种颜色的光按一定的强度比例混合，也可以获得白光，则这两种色光称为互补色光。
如图11-1所示，处于直线相连的两种色光互为补色光，如绿色光与紫色光互补，蓝色光与黄色光互补等等。
第二节 基本原理1．吸收光谱光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当分子红橙黄绿青青蓝蓝紫白光的能量(hν)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(∆E)相等时才能被吸收。
紫外可见光分光光度法
紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。
当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。
因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。
物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。
因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
第十一章 荧光分析法
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
《药物分析》第11章：杂环类药物的
※一般加入过量的醋酸汞冰醋酸溶液，使氢溴酸生
成难解离的溴化汞消除干扰
19:46
2.紫外-可见分光光度法 2.紫外硫酸阿托品片的含量测定（方法略）
原理：该类药物一般无紫外吸收，必须加入显色剂（溴甲
酚绿）显色后，与阿托品结合后溶于氯仿中，在420nm处 酚绿）显色后，与阿托品结合后溶于氯仿中，在420nm处 才能测定吸收度。
使湿润的红色石蕊试纸变蓝色， 进行鉴别。 使湿润的红色石蕊试纸变蓝色，故可 进行鉴别。
19:46
三、鉴别试验
（一）酰肼基团的反应（异烟肼的鉴别） （一）酰肼基团的反应（异烟肼的鉴别）
1.氨制硝酸银的反应 1.氨制硝酸银的反应
氨制AgNO3 氨制
+ H2NNH2
H2NNH2
4AgNO3
4Ag↓ + N2 ↑+ 4HNO3 ↓
结果：供试品溶液除显一个与对照品溶液主斑点位 置相同的灰黑色斑点外，不得显其他斑点。
19:46
四、含量测定
原料药：非水滴定法 制剂：紫外-可见分光光度法
1.非水滴定法：具有弱碱性，在水溶液中直接用酸滴定没有明显突 1.非水滴定法：
紫外-可见分光光度法测定可溶微针贴片中罗丹明B的含量
[收稿日期]2020-02-21 [修回日期]2020-03-26[基金项目]国家级大学生创新创业训练计划(201810367014,201910367033)[作者单位]蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233030[作者简介]刘春艳(1998-),女,2016级本科生.[通信作者]马 涛,硕士研究生导师,教授.E⁃mail:matao1992@[文章编号]1000⁃2200(2020)11⁃1158⁃03㊃大学生科技园地㊃紫外-可见分光光度法测定可溶微针贴片中罗丹明B 的含量刘春艳,柏沫含,徐雨靓,万天妍,陈佳琪,王清清,马 涛[摘要]目的:建立可溶微针贴片中罗丹明B 的含量测定方法㊂方法:采用紫外-可见分光光度法,配制一系列浓度的罗丹明B 溶液,在554nm 处测定其相应的吸光度,采用最小二乘法绘制标准曲线㊂考察方法的专属性㊁线性㊁精密度㊁加样回收率㊁检测限㊁重复性及稳定性㊂结果:罗丹明B 浓度在1.04~10.40μg /mL 范围内,与其吸光度呈良好的线性关系(r =0.9995);该方法的专属性㊁线性㊁精密度㊁加样回收率㊁检测限㊁重复性及稳定性均符合要求㊂结论:紫外-可见分光光度法可用来测定可溶微针贴片中罗丹明B 的含量,且方法简单㊁准确㊁可靠㊂[关键词]罗丹明B;可溶微针贴片;紫外-可见分光光度法[中图法分类号]R 927.2 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2020.11.027Determination of rhodamine B in dissolving microneedle patchby ultraviolet⁃visible spectrophotometryLIU Chun⁃yan,BAI Mo⁃han,XU Yu⁃liang,WAN Tian⁃yan,CHEN Jia⁃qi,WANG Qing⁃qing,MA Tao(School of Pharmacy ,Bengbu Medical College ,Bengbu Anhui 233030,China )[Abstract ]Objective :To establish a method for the determination of rhodamine B in dissolving microneedle patch.Methods :Ultraviolet⁃visible spectrophotometry was used to determine the content of rhodamine B in dissolving microneedles.A series concentration of rhodamine B solutions were prepared,the absorbance was measured at 554nm and the least square method was used to draw the standard curve.The specificity,linearity,precision,sample recovery,limit of detection,repeatability and stability of the methodwere investigated.Results :Rodamine B solution at the concentration of 1.04-10.40μg /mL showed good linearity with its absorbance (r =0.9995).The specificity,linearity,precision,sample recovery,limit of detection,repeatability and stability of the method all met the requirement.Conclusions :The ultraviolet⁃visible spectrophotometry is simple,accurate and reliable,and can be used to determine the content of rhodamine B in dissolving microneedle patch.[Key words ]rhodamine B;dissolving microneedle patch;ultraviolet⁃visible spectrophotometry 可溶微针作为新型经皮给药制剂,可以有效突破皮肤角质层屏障,解决经皮递药系统递药效率低的瓶颈问题,实现近似于注射给药的治疗效果[1-2];同时可完全溶解的微米级的针部又使其具有无痛㊁微创㊁便于病人自主给药㊁无废弃针头二次危害等诸多优点[3]㊂因此,近年来,可溶微针成为新型递药系统研究的主要方向之一,具有极大的临床应用前景㊂但是,该种给药方式药物在体内的分布㊁代谢㊁消除情况及其与皮下注射的区别等尚缺乏相应的研究㊂本课题组以透明质酸(hyaluronic acid,HA)和聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP K90)作为制针辅料,包载可溶性药物,用两步注模干燥法制备出可溶微针贴片,进行大鼠体内给药研究㊂为了更深入地研究可溶微针经皮给药的药物体内过程,直观㊁实时㊁动态地比较皮下注射与可溶微针两种方式给药后,药物在动物体内的分布情况,具有实[16] JIN X,ZHANG ZH,SUN E,et al .A novel drug⁃phospholipidcomplex loaded micelle for baohuoside I enhanced oralabsorption:in vivo and in vivo evaluations [J].Drug Dev Ind Pharm,2013,39(9):1421.[17] KATTAMANCHI G,KALAKONDA SN,BATTU GR.Phospholipidcomplex technique for superior bioavailability of phytoconstituents[J].Adv Pharm Bull,2017,7(1):35.[18] ELNAGGAR YS,SHEHATA EM,GALAL S,et al .Self⁃emulsifying preconcentrates of daidzein⁃phospholipid complex:Design,in vitro and in vivo appraisal[J].Nanomedicine,2017,12(8):893.(本文编辑 赵素容)8551J Bengbu Med Coll ,November 2020,Vol.45,No.11时观测记录荧光染料体内分布的小动物活体成像实验是优选的方法㊂罗丹明B 是一类人工合成的以氧杂蒽作为母体的荧光染料,可溶于水,并具有良好的光学稳定性和较高的量子产率,广泛应用于信息科学㊁激光染料㊁环境化学㊁生物医药科学和分析化学等领域[4-5],符合可溶微针的载药特点,可作为本研究的模型药物进行在体给药和活体成像实验㊂为了保证实验结果的准确,需要建立一种快速㊁便捷㊁准确的检测方法,不仅能排除可溶微针辅料的干扰,还能够准确检测出可溶微针中罗丹明B 的载药量㊂本研究旨在采用紫外-可见分光光度法建立一种准确可靠的可溶微针贴片中罗丹明B 的含量分析方法㊂1 材料与方法1.1 仪器 TU⁃1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);FA2204N 型电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);Advantage A10纯水仪(Milli⁃Q 公司)㊂1.2 试药 可溶微针贴片(自制);罗丹明B(上海圻明生物科技有限公司);HA (华熙福瑞达生物医药有限公司,批号:1806151);PVP K90(德国BASF,批号:L96014768E0);水为超纯水㊂1.3 溶液的配制 1.3.1 罗丹明B 贮备液的配制 精密称取罗丹明B 固体粉末0.0052g,置于100mL 容量瓶中,用超纯水溶解并定容至刻度线,配制浓度为52μg /mL 的罗丹明B 贮备液㊂1.3.2 制针辅料溶液的配制 分别精密称取HA㊁PVP K90各0.0250g,置于50mL 容量瓶中,用超纯水溶解并定容至刻度线,配制浓度为0.5mg /mL 的制针辅料贮备液㊂1.3.3 可溶微针贴片水溶液的制备 用手术刀片对已制备好的可溶微针贴片进行针部与基层分离,取针部溶解于1mL 超纯水中即得[6]㊂1.4 检测波长与专属性试验 取1.3项下的罗丹明B㊁HA㊁PVP K90贮备液以及可溶微针贴片水溶液,以超纯水为空白试剂分别稀释成适宜浓度水溶液,并于200~800nm 波长范围内扫描,得到其紫外光谱图㊂1.5 标准曲线 取1.3.1项下罗丹明B 贮备液稀释成浓度为10.4μg /mL 的水溶液,再精密量取1.0㊁2.0㊁3.0㊁4.0㊁5.0㊁6.0㊁7.0㊁8.0㊁9.0㊁10.0mL 分别置于10mL 容量瓶中,以超纯水定容,得到浓度为1.04㊁2.08㊁3.12㊁4.16㊁5.20㊁6.24㊁7.28㊁8.32㊁9.36㊁10.4μg /mL 的罗丹明B 系列标准溶液㊂分别测量其在554nm 处的吸光度,以吸光度(Y )对罗丹明B 浓度(X )进行线性回归,绘制标准曲线㊂1.6 精密度试验 取1.3.1项下罗丹明B 贮备液稀释到浓度为5.20μg /mL 罗丹明B 溶液,在554nm 处连续测定6次,计算日内精密度,3d 内每天同法测定,计算日间精密度㊂1.7 重复性试验 取实验室自制的同一批可溶微针贴片6片,分别用手术刀片将针部与基层分离,取针部分别置于1mL 超纯水中,振摇时其完全溶解,测量其在554nm 处的吸光度,计算每片可溶微针贴片针部的罗丹明B 含量㊂1.8 加样回收率试验 精密称取0.0050g 罗丹明B 于100mL 容量瓶中得到浓度为50μg /mL 的罗丹明B 溶液,取1.3.2项下的制针辅料溶液,按照罗丹明B 与混合辅料的浓度比为1∶40㊁1∶20㊁1∶10配制药物辅料混合溶液㊂其中混合辅料浓度保持不变,总浓度为100μg /mL,各辅料均为50μg /mL㊂罗丹明B 浓度分别为2.5㊁5.0㊁10.0μg /mL㊂将混合溶液在544nm 处测量吸光度,并通过线性方程计算相应的浓度㊂1.9 稳定性试验 取可溶微针贴片溶液,分别于0㊁0.5㊁1㊁2㊁4㊁6㊁12㊁24h 进行测定㊂2 结果2.1 检测波长与专属性试验 罗丹明B 在259㊁284㊁355㊁400㊁554nm 处均有吸收,其中,在554nm 处吸收最大,且空白试剂无干扰,而各制针辅料在554nm 处没有吸收,表明制针辅料对罗丹明B 含量测定无干扰㊂选择554nm 作为罗丹明B 的检测波长,结果见图1㊂9551蚌埠医学院学报2020年11月第45卷第11期2.2 标准曲线 以吸光度(Y)对罗丹明B浓度(X)进行线性回归,线性回归方程为Y=0.0649X+ 0.0033(r=0.9995),罗丹明B浓度在1.04~ 10.40μg/mL范围内,与其吸光度呈良好的线性关系㊂2.3 精密度试验 在554nm测定5.20μg/mL罗丹明B溶液,日内精密度为1.04%(见表1),日间精密度为1.51%(见表2)㊂2.4 加样回收率试验 2.5㊁5.0㊁10.0μg/mL的罗丹明B回收率分别为95.96%㊁97.13%㊁97.87%, RSD分别为0.32%㊁0.16%㊁0.21%(见表3)㊂2.5 重复性试验 6片可溶微针贴片中罗丹明B 含量为83.8㊁81.0㊁81.3㊁83.4㊁82.2㊁83.6mg,RSD 为1.48%㊂ 表1 紫外-可见分光光度法测定罗丹明B日内精密度结果(n=3)浓度/(μg/mL)吸光度平均吸光度RSD/%0.1442.080.1430.1440.400.1440.3425.200.3350.338 1.040.68910.40.6860.6850.590.681 表2 紫外-可见分光光度法测定罗丹明B日间精密度结果(n=3)浓度/(μg/mL)吸光度平均吸光度RSD/%0.1442.080.1460.146 1.7200.1490.3385200.3340.333 1.5100.3280.68510.040.6900.6850.6580.6812.6 稳定性试验 24h内测定罗丹明B吸光度的RSD值为2.13%(n=8)㊂3 讨论 罗丹明B在水溶液中具有强烈的荧光,本研究前期采用荧光分光光度法检测罗丹明B的含量,但发现具有强烈的荧光淬灭现象,罗丹明B浓度愈高,则淬灭愈严重,这可能是因为高浓度罗丹明B 体系中存在自熄灭作用,引起淬灭的因素较多,这可能会导致微针贴片中罗丹明B的含量测定不准确㊂此外,采用荧光分光光度法测定罗丹明B系列标准溶液时,发现随着罗丹明B浓度增大,发射波长出现红移现象㊂基于以上原因,本研究最终未采用荧光分光光度法,选择紫外-可见分光光度法测量可溶微针贴片中罗丹明B的含量㊂表3 紫外-可见分光光度法测定罗丹明B加样回收率结果加入浓度/(μg/mL)实测浓度/(μg/mL)回收率/%平均回收率/%RSD/%2.3995.72.5 2.4096.095.960.32112.4196.34.8697.15.0 4.8697.397.130.15864.8597.09.7697.610.09.809.8097.870.20839.809.80 目前罗丹明B的测定方法多采用高效液相色谱法,而紫外可见分光光度法相对高效液相色谱法测定罗丹明B具有简便快捷的优势㊂罗丹明B是一种荧光物质,可以通过小动物成像系统进行实时检测,为了探讨可溶微针制剂是否具有缓释作用,我们以罗丹明B溶液作为对照组,罗丹明B可溶微针作为实验组,建立紫外-可见分光光度法对可溶微针中罗丹明B进行定量,从而保证两个组别的罗丹明B含量相等,进而进行后续的实验研究㊂[参考文献][1] ZHU Z,LUO H,LU W,et al.Rapidly dissolvable microneedle pat⁃ches for transdermal delivery of exenatide[J].Pharm Res,2014, 31(12):3348.[2] ARYA JM,DEWITT K,SCOTTGARRARD M,et al.Rabiesvaccination indogs using a dissolving microneedle patch[J].J Control Release,2016,239:19.[3] WANG Q,YAO G,DONG P,et al.Investigation on fabricationprocess of dissolving microneedle arrays to improve effective needle drugdistribution[J].Eur J Pharm Sci,2015,66:148. [4] 王丽君,朱书强,周佳.高效液相色谱法测定调味油中罗丹明B[J].安徽农业科学,2019,47(12):210.[5] JOAKIM K,ENEKO L.In vivo studies investigating biodistributionof nanoparticle⁃encapsulated rhodamine B delivered via dissolving microneedles[J].J Controlled Release,2017,265(10):57. [6] 胡霞,陈明龙,杨伟汉,等.HPLC测定可溶微针贴片中熊果苷的含量[J].山西医科大学学报,2018,49(5):498.(本文编辑 赵素容)0651J Bengbu Med Coll,November2020,Vol.45,No.11。
紫外可见分光光度法解析课件
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过含有吸光物质的
稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、 液层厚度乘积成正比，即
A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质 的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为 吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
2. 使用 仪器自检结束后（7个自检项目均出现
OK字样），按[MAIN MENU]键（主 菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校 正）；5. Data display（光度直接测量 模式）。根据需要测量的实验项目按相
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理 论基础。
A lg 1 lg I0 ECL TI
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光
和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓 度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光 系数，单位为（L·mol-1·cm-1）；当c用百分浓度 （g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称 为比吸光系数。它们的关系如下：
4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。
4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设 置是否正确（重新调整波长，并重新调 零）、测量时是否调零（如被误操作，重 新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波 段时，要用石英比色皿）、样品准备是否 有误（如有误，重新准备样品）。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同 的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。
第11章 紫外可见分光光度法(UV-VIS
带状光谱。
A
最大吸收 B 波长 max
A
物质对光的选择性吸收
max ( A) max ( B)
定性分析基础
A c
增 大
在一定实验条件下, A∝c
定量分析基础
吸收曲线的讨论：
（1）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级 间的ΔΕ所决定，反映了分子内部能级分布状况—— 定性分析基础 （2）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正 比——定量分析基础 Lambert-Beer定律 同一种物质不同浓度下，其吸收曲线形状相似λmax 不变。在λmax处吸光度A随浓度变化的幅度最大。所 以测定最灵敏。此特性可作为定量分析时选择入射光 波长的重要依据。
分光光度法：根据物质对一定波长的光的吸收程度 依据物质对不同波长范围光的吸收主要有： 真空紫外光度法：10～200 nm（远紫外光） 紫外吸光光度法：200400 nm（近紫外区）
可见吸光光度法：400750 nm
红外光度法：2.51000 m
1、光的基本性质
光 的 波 粒 二 象 性
波动性
光学分析法包括：
非光谱法：不以光的波长为特征讯号
例如折射法，浊度法，旋光法
光谱法：在光（或其它能量）的作用下，通 过测量物质产生的发射光、吸收光或散射 光的波长和强度来进行分析的方法。
分为：吸光光度法，发射光谱法
吸光光度法
基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而 建立起来的分析方法。包括：
比色法：比较有色溶液颜色深浅
二、分光光度计的类型
1. 单光束分光光度计 2. 双光束分光光度计 3. 其他类型分光光度计
多通道仪器 同时测量200～820nm范围内的整个光谱, 比单个检测器快316倍,信噪比增加3161/2 倍. 纤维光度计 将光度计放入样品中，原位测量.
【精品】紫外—可见分光光度法完整版
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第三节 紫外-可见分光光度计
二、紫外-可见分光光度计的类型
紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三 种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波 长分光光度计。
1，单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和
样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计 结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。
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第二节 化合物紫外—可见光谱的产生
（二）、常用术语
1. 生色团
从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收 光子而产生电子跃迁的原子基团。但是，人们通常将 能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色 团。
下面为某些常见生色团的吸收光谱。
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第二节 化合物紫外—可见光谱的产生
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三、溶剂对紫外、可见吸收光谱的影响
溶剂的极性的改变会引起吸收带形状的变化和最大吸 收波长的变化。当溶剂的极性由非极性改变到极性时， 精细结构消失，吸收带变向平滑。
溶剂对异亚丙基丙酮紫外吸收光谱的影响。
正己烷 CHCl3 CH3OH H2O
* max/nm
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238
237
243
分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放 电光源两类。
热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯； 气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。
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第三节 紫外-可见分光光度计
（二）单色器 主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫
外可见区域内任意可调。 主要类型：能起分光作用的色散元件主要是棱
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二、 吸收光谱
在浓度一定的条件下，以波长或波数为 在浓度一定的条件下， 横坐标， 横坐标，以吸光度或吸光系数为纵坐标 所描绘的λ~A曲线 所描绘的λ~A曲线 (一) 吸收光谱的术语
1. 吸收峰 2. 谷 3. 肩峰 4. 末端吸收 2010年11月 5. 强带和弱带
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(二) 高锰酸钾溶液的 吸收光谱曲线
光的反射、折射、偏振、干涉、 光的反射、折射、偏振、干涉、衍射 参数：波长(λ)、频率(γ)或波数 参数：波长 、频率 或波数(σ) 或波数 相互关系： 相互关系：
ν =
2010年11月
c
λ
，σ =
1
λ
4
一、 电磁辐射与电磁波谱
(二) 光的粒子性
光波是由一颗颗不连续的光子构成的光子流
光的吸收、光的发射、光电效应 光的吸收、光的发射、 参数：能量(E) 参数：能量 光子的能量与光波的频率或波数的关系： 光子的能量与光波的频率或波数的关系：
c E=h ν=h =h c σ λ 注： λ ↓ ， E ↑
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二、 光谱分析法分类
光学分析法分为光谱分析法和非光谱分 析法
当电磁辐射作用于待测物质，使待测物质 当电磁辐射作用于待测物质， 内部发生能级跃迁， 内部发生能级跃迁，而引起的能量随电磁 辐射波长变化的分析方法称光谱分析法 辐射波长变化的分析方法称光谱分析法 当电磁辐射作用于被测物质时， 当电磁辐射作用于被测物质时，利用其传 播方向、 播方向、速度等物理性质发生改变所建立 起来的分析方法称为非光谱分析法 起来的分析方法称为非光谱分析法
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透光率T和吸光度A 透光率T和吸光度A的关系
吸光度A愈大，表示透光率T愈小， 吸光度A愈大，表示透光率T愈小，溶液 对光的吸收程度愈强
A与T的互换:A=-lgT 的互换:A=T=10-A 练习1:将透光率值换算成吸光度 练习1:将透光率值换算成吸光度 75%
A=-lgT=-lg75%=0.125 A=-lgT=-
2010年11月 25
2．单色器： 单色器：
将来自光源的复合光，按波长顺序色 将来自光源的复合光， 散分离出所需波长的单色光
包括狭缝、准直镜、 包括狭缝、准直镜、色散元件 色散元件 棱镜——对不同波长的光折射率不同 棱镜 对不同波长的光折射率不同 分出光波长不等距 光栅——衍射和干涉 光栅 衍射和干涉 分出光波长等距
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三、 偏离光的吸收定律的原因
(一) 化学因素
1.吸光物质的浓度 1.吸光物质的浓度
Beer定律适用的 Beer定律适用的 前提： 前提： 稀溶液 (<0.01mol/L)
(二) 光学因素
1．非单色光的影响 2．杂散光的影响 3．反射光和散色光 的影响 4．非平行光的影响
2.吸光物质不稳定 2.吸光物质不稳定
相对误差1％～ ％ 相对误差 ％～5％ ％～
3.选择性较好 选择性较好 4.仪器不太贵重 仪器不太贵重 5.应用广泛 应用广泛
2010年11月 14
第二节 紫外-可见分光光度法的基 紫外本原理
一、 光的吸收定律 二、 吸收光谱 三、 偏离光的吸收定律的原因
2010年11月
15
一、 光的吸收定律
(一) 透光率T和吸光度A 透光率T和吸光度A
2010年11月
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第三节 紫外-可见分光光度计 紫外一、 主要部件 二、 仪器类型
2010年11月
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一、 主要部件（五个部件） 主要部件（五个部件）
光源 单色器 吸收池 检测器 显示器 （一）光源
1．光源：提供入射光的装置 ．光源：
钨灯或卤钨灯——可见光源 钨灯或卤钨灯 可见光源 350~1000nm 氢灯或氘灯——紫外光源 氢灯或氘灯 紫外光源 200~360nm
I0 I0 Ir Ir
It Ia Ia L It
透射光强度与入射光强度之比称为透光 用符号T 率，用符号T表示 透光度T 透光度T的倒数反映了物质对光的吸收 程度，应用时取它的对数为吸光度， 程度，应用时取它的对数为吸光度，用 A表示
It T = ×100% I0
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1 A = lg = − lg T T
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（三）物质的颜色与吸收光的关系
对溶液
溶液呈现不同的颜色， 溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质 点(分子或离子 选择性的吸收某种颜色的光 分子或离子)选择性的吸收某种颜色的光 分子或离子 所引起的。 所引起的。
如果各种颜色的光透过程度相同， 如果各种颜色的光透过程度相同，这种物质就 无色透明。 是无色透明。 如果只让一部分波长的光透过， 如果只让一部分波长的光透过，其他波长的光 被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色， 被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，也就 是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。 吸收的光成互补色的颜色 是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。 13 2010年11月
仅测定电磁辐射性质改变
2010年1Βιβλιοθήκη 月 8三、 物质对光的选择性吸收
（一）光的颜色
可见光：人眼能感觉到的光。 可见光：人眼能感觉到的光。 波长范围:400～760nm 波长范围 ～ 紫外光：波长小于400nm的光 紫外光：波长小于 的光 红外光：波长大于760nm的光 红外光：波长大于 的光
如果让一束白光通过三棱镜，就分解为 如果让一束白光通过三棱镜， 红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色 的光，这种现象称为光的色散 光的色散。 的光，这种现象称为光的色散。
如果物质对各种波长的光完全吸收,则呈现黑色 如果物质对各种波长的光完全吸收,则呈现黑色； 黑色； 如果完全反射，则呈现白色 如果完全反射，则呈现白色 如果对各种波长光吸收程度差不多,则呈现灰色 灰色； 如果对各种波长光吸收程度差不多,则呈现灰色； 如果物质选择性地吸收某种波长的光， 如果物质选择性地吸收某种波长的光，那么这种 物质的颜色由它透过光的颜色来决定 由它透过光的颜色来决定。 物质的颜色由它透过光的颜色来决定。
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（二）物质对光的选 择性吸收
每种颜色的光具有一定的波长范围。 每种颜色的光具有一定的波长范围。由 不同波长的光混合而成的光称为复合光 复合光。 不同波长的光混合而成的光称为复合光。
白光是复合光。 白光是复合光。
把只具有一种颜色的光，叫做单色光。 把只具有一种颜色的光，叫做单色光 单色光。
ε和E 1cm1%的互换
ε =E
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1% 1cm
M × 10
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影响吸光系数的因素及意义
影响吸光系数的因素 物质的性质不同 溶剂 入射光波长 意义 吸光系数越大， 吸光系数越大， 溶液对光的吸收 越多，测定方法 越多， 的灵敏度越高
例1 用双硫腙法测定Cd2+溶液的吸光度。当溶液的 用双硫腙法测定Cd 溶液的吸光度。 浓度为14µg/100ml，在最大吸收波长=520nm处测 浓度为14µg/100ml，在最大吸收波长=520nm处测 得吸光度为0.44，吸收池厚度为2cm， 得吸光度为0.44，吸收池厚度为2cm，求其比吸光 系数和摩尔吸光系数。
四、 紫外-可见分光光度法的特点 紫外紫外－可见分光光度法：研究物质在紫外－ 紫外－可见分光光度法：研究物质在紫外－可见光 区分子吸收光谱的分析方法 特点： 特点：
1.灵敏度高： 灵敏度高： 灵敏度高
一般可以测到每毫升溶液中含有10-7 g的物质 一般可以测到每毫升溶液中含有 的物质
2.准确度好： 准确度好： 准确度好
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光谱法与非光谱法的区别： 光谱法与非光谱法的区别：
光谱法： 光谱法：内部能级发生变化
原子吸收/发射光谱法： 原子吸收 发射光谱法：原子外层电子能 发射光谱法 级跃迁 分子吸收/发射光谱法 发射光谱法： 分子吸收 发射光谱法：分子外层电子能 级跃迁
非光谱法： 非光谱法：内部能级不发生变化
研究物质在紫外-可见光区分子吸收光谱的 研究物质在紫外 可见光区分子吸收光谱的 分析方法称为紫外-可见分光光度法 分析方法称为紫外 可见分光光度法 （ultraviolet and visible spectrophotometry，UV-vis） ， ）
紫外-可见吸收光谱属于分子光谱 紫外 可见吸收光谱属于分子光谱 紫外-可见光的波长范围 紫外 可见光的波长范围200nm～1000nm ～ 可见光的波长范围
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单色器光路示意图
2010年11月
单色光是理想的
2010年11月
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（二）物质对光的选择性吸收
适当选配两种颜色的光按一定的强度比 例混合，可以获得白光， 例混合，可以获得白光，则这两种色光称为 互补色光。 互补色光。
黄 橙 红
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绿
青
白光
青蓝
紫
蓝
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（三）物质的颜色与吸收光的关系
固体物质
白光照射到物质上时，物质对于不同波长的 白光照射到物质上时， 光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使 光线吸收、透过、反射、 物质呈现出不同的颜色。 物质呈现出不同的颜色。
必须注意： 必须注意：入射光必须是单色光 溶液必须是稀溶液. 溶液必须是稀溶液.
它是各类吸光光度法的定量依据。 它是各类吸光光度法的定量依据。
2010年11月 18
(三) 吸光系数
溶液的浓度c的单位不同，吸光系数K 溶液的浓度c的单位不同，吸光系数K的意义和表示方法 也不同
1. 摩尔吸光系数 ，溶液的浓度为1mol/L用ε表 溶液的浓度为1mol/L用 示 2. 比吸光系数 又称百分吸光系数，，溶液浓 又称百分吸光系数，， ，，溶液浓 度为1%（g/100ml）， ），用 度为1%（g/100ml），用E 1cm1%表示