蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质样品的制备
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2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要
求为止。
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3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行
蛋白质的拷贝数都很少，因此通过样品制 备也可以起到浓缩蛋白质的作用。
3.消除各种细胞或组织混杂的影响
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二、样品制备的原则
1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理
2.尽可能的提高样品的溶解度，使所有待分析的蛋白质样品全部 处于溶解状态，且制备方法应具有可重现性。
3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白 酶抑制剂以防止蛋白的降解。
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⑵ 还原剂
还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基 之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用 的还原剂有β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或 二硫赤藓糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前 常用的是DTT。
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⑶ 去污剂（表面活性剂）
去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作 用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作 用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和 兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂 SDS，非离子去污剂NP-40和TritonX-100，两 性离子去污剂CHAPS。原则上去污剂应该是非离 子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质 的迁移位置。最初，两个相似的非离子去污剂 NP-40和TritonX-100被广泛应用。随后研究表 明：兼性离子去污剂CHAPS的效果更好。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白质提取与纯化技术
选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。蛋白质的分离纯化 一，蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取
蛋白质的提取与分离
蛋白质提取与制备具体操作方法
1、原料的选择
早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成
本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量
来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属
的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查
制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解
蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属
必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但
使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对
动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
2、前处理
a、细胞的破碎
材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷
冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先
将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难
易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即
可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法
一、原料选择和前处理
（一）原料的选择
早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理
1.细胞的破碎
材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
大豆蛋白织物的制备原理
大豆蛋白织物的制备原理
大豆蛋白织物的制备原理是通过将大豆蛋白质提取，纺丝成纤维，再经过加工、染色等工艺步骤而制得。
首先，大豆蛋白提取过程。大豆蛋白质可以从大豆中提取出来，通常使用的方法是水溶液法。将大豆浸泡在水中，使其蛋白质溶解并转化成水溶液，然后通过离心、过滤等步骤去除杂质，最终得到纯净的大豆蛋白液。
接下来，大豆蛋白纺丝过程。将大豆蛋白液通过旋转蒸发和升温的方法，使蛋白质发生凝聚，形成纤维状物质。这个过程中，大豆蛋白质分子会相互结合，形成蛋白质凝胶，这种凝胶具有一定的强度和可拉伸性。然后，通过喷射纺丝、湿法纺丝或干法纺丝等方法使凝胶纤维化。
在纺丝过程中，添加剂也被广泛用于增加纤维的稳定性和性能。例如，引入交联剂可以增强纤维的力学强度和抗拉性能，改善纤维的抗皱性能等。
随后，大豆蛋白纤维的加工处理。将纺丝后得到的大豆蛋白纤维进行加工处理，以增加其强度和耐久性。这可能包括强化纤维表面处理，例如使用化学交联剂对纤维进行交联处理，或者进行物理处理，例如增强纤维的纺丝结构，改变纤维的断面形状等。这些处理可以提高纤维的抗拉性能、抗皱性能和耐久性。
最后，大豆蛋白织物的染色和整理。染色是将纺织品染上所需颜色的过程。大豆
蛋白织物可以通过不同的染色方法进行染色，如溶液染色、湿处理染色、上浆染色等。这些方法可以根据具体需求选用适当的染料和染色工艺，使得大豆蛋白织物能获得所需的颜色。
整理是将染色后的织物进行后续处理，以提高其柔软度、抗皱性能和耐久性等。这些处理可以包括涂覆剂的使用，例如添加抗皱剂。整理工艺的选择通常取决于织物的使用要求和织物的特性。
蛋白的分离纯化详解
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各种用于抗体识别的标记
His-tag (6-8 Histidine)镍离子-6个组蛋白 T7-tag (MASMTGGQQMG)
HSV-tag (QPELAPEDPED) S-tag (KETAAKFERQHMDS) VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)
3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰
4. 收集、鉴定
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离子交换层析有两种洗脱方式
• 分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动相分
次洗脱样品蛋白的方法； • 梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。 • 目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情况下的
首选方案。
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2. 凝胶过滤层析
• 利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速 度不同来分离蛋白质的方法。
• 常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、 Superdex等。
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3. 亲和层析
• 以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的特点 是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激 素与受体，糖与凝集素……等。
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蛋白质提取与纯化技术
蛋⽩质提取与纯化技术
蛋⽩质提取与纯化技术
选择材料及预处理
以蛋⽩质和结构与功能为基础，从分⼦⽔平上认识⽣命现象，已经成为现代⽣物学发展的主要⽅向，研究蛋⽩质，⾸先要得到⾼度纯化并具有⽣物活性的⽬的物质。蛋⽩质的制备⼯作涉及物理、化学和⽣物等各⽅⾯知识，但基本原理不外乎两⽅⾯。⼀是得⽤混合物中⼏个组分分配率的差别，把它们分配到可⽤机械⽅法分离的两个或⼏个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；⼆是将混合物置于单⼀物相中，通过物理⼒场的作⽤使各组分分配于来同区域⽽达到分离⽬的，如电泳，超速离⼼，超滤等。在所有这些⽅法的应⽤中必须注意保存⽣物⼤分⼦的完整性，防⽌酸、硷、⾼温，剧烈机械作⽤⽽导致所提物质⽣物活性的丧失。蛋⽩质的制备⼀般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、⼲燥和保存。
微⽣物、植物和动物都可做为制备蛋⽩质的原材料，所选⽤的材料主要依据实验⽬的来确定。对于微⽣物，应注意它的⽣长期，在微⽣物的对数⽣长期，酶和核酸的含量较⾼，可以获得⾼产量，以微⽣物为材料时有两种情况：（1）得⽤微⽣物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利⽤菌体含有的⽣化物质，如蛋⽩质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和⽣长发育状况不同，其中所含⽣物⼤分⼦的量变化很⼤，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进⾏绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不⽴即进⾏实验，应冷冻保存，对于易分解的⽣物⼤分⼦应选⽤新鲜材料制备。
蛋白质提取的几种简单方法
蛋白质的提取方法
选择材料及预处理
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：
（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；
（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质提取方法
方法一：碱溶酸沉法
利用蛋白质可溶于稀碱，当pH接近等电点时沉淀析出的原理，先用碱性溶液来溶解蛋
白质，分离出澄清溶液，再将溶液的pH降到蛋白质的等电点使蛋白质沉淀析出，接下来分离沉淀下来的蛋白质。碱溶酸沉法是目前操作最成熟、应用最多的蛋白质提取方法，常用
的碱是氢氧化钠溶液。碱溶酸沉法具有操作简便、易于控制、成本低廉的优点，缺点是
提取操作时间长，蛋白质提取率低，易导致蛋自质变性，对某些原料提取出的蛋白质色泽
深等碱溶酸沉法提取蛋白质的影响因素包括碱液浓度、碱液用量、提取温度和提取时
间等提取时需要辅助适当的搅拌，以利于蛋白质的溶出。
方法二：盐溶酸沉法
盐溶酸沉法的原理是蛋白质可溶于低浓度的盐溶液中，调整溶液pH至蛋白质等电点
时，蛋白质则沉淀析出。浓度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解、保护蛋白质活性的作用;浓度高则会导致蛋白质发生盐析作用。常用的盐溶液是氯化钠溶液和六偏磷酸钠溶液。和传统的碱溶酸沉法相比，盐溶酸沉法的蛋白质提取率较高，蛋白质变性差，但纯度低。
方法三：水酶法
该方法适用于提取油脂含量较高的植物蛋白，在获得高品质油脂的同时得到高质量的
蛋白质。在高油植物种子中，油脂存在于细胞内，常与蛋白质或碳水化合物等大分子结合
在一起，形成脂多糖或脂蛋白等复合体，必须将油料组织的细胞结构和油脂复合体破坏，
才能提出里面的油脂和蛋白质。水酶法以机械和酶解为手段，来降解细胞壁，分离出蛋白质。操作时先借助研磨、粉碎等辅助操作将种子组织破碎，再采用对细胞壁以及对脂多糖、脂蛋白等复合体有降解作用的酶(如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等)来进行处理，使细
蛋白质制备及含量测定（凯氏定氮法）分析
蛋⽩质制备及含量测定（凯⽒定氮法）分析
实验六蛋⽩质制备及含量测定——
微量凯⽒（Mirco-Kjeldahl）定氮法
⼀、实验⽬的要求
1、了解蛋⽩质提取的⼀般⽅法和原理
2、了解蛋⽩质含量测定的常⽤⽅法
3、学习微量凯⽒定氮法的原理
4、掌握微量凯⽒定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋⽩质含量的换算等。
⼆、实验原理
1、蛋⽩质的提取与制备
蛋⽩质的提取与制备⽅法与⽣物材料的类型及蛋⽩质的存在部位有关。如果是胞内蛋⽩，⾸先必须要进⾏细胞破碎。细胞破碎的⽅法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。如果是胞外蛋⽩，可以根据相应蛋⽩质的性质进⾏提取分离纯化。
如果待提取的蛋⽩质是具有⽣物活性的蛋⽩质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防⽌蛋⽩质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋⽩质含量测定
蛋⽩质含量测定的⽅法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染⾊法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯⽒定氮法等。
3、凯⽒定氮
⽣物材料的含氮量测定在⽣物化学研究中具有⼀定的意义，如蛋⽩质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋⽩含量。⽣物材料总氮量的测定，通常采⽤微量凯⽒定氮法。凯⽒定氮法由于具有测定准确度⾼，可测定各种不同形态样品等两⼤优点，因⽽被公认为是测定⾷品、饲料、种⼦、⽣物制品、药品中蛋⽩质含量的标准分析⽅法。其原理如下：
（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为⽆机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提⾼硫酸沸点。这⼀步约需2～3h，视样品的性质⽽定。
分离纯化蛋白质的方法及原 理
（2） 利用溶解度差别
影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。
1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。
蛋白纯化相关原理及方法
蛋白纯化相关原理及方法
蛋白纯化是生物科学研究中常用的一项技术，它可以分离纯化出目标蛋白质，从而方便后续的研究和应用。本文将介绍蛋白纯化的原理和方法。
一、蛋白纯化的原理
蛋白纯化的原理是基于不同蛋白质的特性差异，通过采用不同的分离技术，将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且使其达到纯度较高的状态。
蛋白质的特性差异主要包括以下几个方面：
1. 分子质量：蛋白质的分子质量不同，可以通过分子大小的差异进行分离。常用的方法包括凝胶过滤层析和超速离心。
2. 电荷性质：蛋白质具有不同的电荷性质，可以通过离子交换层析、电泳等方法进行分离。离子交换层析是利用蛋白质与固定在固相上的离子交换基团之间的相互作用进行分离。
3. 亲和性：蛋白质与其他分子之间可能存在特异的结合，可以通过亲和层析进行分离。亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离。
4. 疏水性：蛋白质的疏水性不同，可以通过逆向相层析等方法进行
分离。逆向相层析是利用溶剂的极性进行分离，疏水性较高的蛋白质会更早洗脱。
二、蛋白纯化的方法
1. 直接纯化法：直接从生物样品中纯化目标蛋白质，可以通过分离离心、沉淀和过滤等简单的操作步骤进行。这种方法适用于目标蛋白质含量较高的样品。
2. 柱层析法：柱层析是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据目标蛋白质的特性选择不同的层析柱进行分离。常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
3. 电泳法：电泳是利用蛋白质的电荷性质进行分离的方法，常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和等电聚焦电泳（IEF）等。
提取蛋白质的方法
提取蛋白质的方法
一、背景介绍
蛋白质是生物体中最基本的组成部分之一，它们在细胞代谢、信号传
导和结构支撑等方面起着重要作用。因此，蛋白质的提取是许多生物
学研究的基础。本文将介绍几种常见的蛋白质提取方法。
二、方法一：机械破碎法
1. 原理
机械破碎法是通过物理力量将细胞壁破坏，使得蛋白质从细胞内释放
出来。这种方法适用于非常坚硬的样品，如骨头或干燥的植物材料。2. 步骤
（1）将样品加入液氮中冷冻并粉碎成粉末。
（2）向粉末中加入适量缓冲液，并使用超声波或高压均质器进行打碎。（3）离心样品以除去残留的细胞碎片和其他杂质。
（4）收集上清液进行后续处理。
三、方法二：化学提取法
1. 原理
化学提取法是利用化学试剂溶解或沉淀细胞，使蛋白质从细胞中释放
出来。这种方法适用于大多数样品，但可能会影响蛋白质的结构和功能。
（1）将样品加入适量缓冲液中，并加入化学试剂（如三氯乙酸、硫酸或氢氧化钠等）。
（2）在恒温条件下搅拌或震荡样品，使细胞完全破裂。
（3）离心样品以除去残留的细胞碎片和其他杂质。
（4）收集上清液进行后续处理。
四、方法三：凝胶层析法
1. 原理
凝胶层析法是一种基于分子大小和电荷的分离技术。通过将混合物通入凝胶柱中，不同大小和电荷的分子会在柱中被分离出来。这种方法可以用于纯化特定的蛋白质。
2. 步骤
（1）制备凝胶柱，并加入相应的缓冲液。
（2）将样品加入凝胶柱，并使用缓冲液进行洗涤。
（3）根据需要调整pH值或添加其他试剂，以促进蛋白质的分离。（4）收集不同分子大小或电荷的蛋白质进行后续处理。
五、方法四：亲和层析法
蛋白提取原理
蛋白提取原理
蛋白质是生命体中非常重要的一种大分子有机化合物，它们在
细胞代谢、组织结构和功能等方面起着至关重要的作用。因此，对
蛋白质的提取工作一直备受关注。蛋白质的提取是将蛋白质从生物
样品中分离出来的过程，通常用于生物学研究、药物制备、食品加
工等领域。蛋白提取的原理主要包括细胞破碎、蛋白质溶解、蛋白
质分离和纯化等步骤。
首先，细胞破碎是蛋白提取的第一步。生物样品通常包含细胞
壁或细胞膜，这些结构对蛋白质的提取造成了一定的阻碍。因此，
需要采用机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法来破坏细胞结构，释放蛋白质。机械破碎是通过机械力将细胞破碎，超声波破碎则是
利用超声波的作用产生的微小气泡在细胞内破裂，高压破碎则是通
过高压力将细胞破碎。
其次，蛋白质溶解是蛋白提取的关键步骤。蛋白质通常存在于
细胞的溶液中，因此需要将细胞破碎后的混合物进行溶解，使蛋白
质从细胞碎片中释放出来。溶解蛋白质的方法主要包括盐溶解、酸
碱溶解、有机溶解等。盐溶解是通过加入盐类物质改变蛋白质的溶
解性，酸碱溶解是通过改变溶液的酸碱度来溶解蛋白质，有机溶解
则是利用有机溶剂将蛋白质从细胞碎片中提取出来。
接下来，蛋白质分离是蛋白提取的重要环节。蛋白质通常与其
他生物大分子如DNA、RNA、多糖等混合存在，需要将蛋白质与这些
杂质分离开来。蛋白质分离的方法主要包括离心、过滤、凝胶电泳、液相色谱等。离心是利用离心机对混合物进行离心，通过不同分子
量的差异使蛋白质与其他杂质分离开来，过滤则是利用滤膜对混合
物进行过滤，凝胶电泳是利用凝胶的孔隙结构对蛋白质进行分离，
WesternBlot原理和操作方法
WesternBlot原理和操作方法
样品制备是Western Blot起始的步骤之一、首先，需要从生物学样
本中提取目标蛋白质。常见的提取方法包括细胞裂解、组织均质和亲和纯
化等。提取后的样品需要经过蛋白质浓度测定，以确保加载相同数量的蛋
白质。
接下来，需要将样品进行电泳分离。这通常是通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-）电泳实现的。SDS（十二烷基硫酸钠）能够破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质呈现线性构象。电泳根据蛋白质的分子量将其分离成不同的
带状条带。
接下来是转膜的步骤。将凝胶中分离的蛋白质转移到聚合物膜上。这
通常是通过湿式转膜实现的，其中聚合物膜与凝胶是紧密接触的。电场将
带有电荷的蛋白质从凝胶中转移到膜上。
然后进行免疫反应。转膜后的膜需要被阻断以避免非特异性结合。一
般会使用非特异性蛋白质溶液，如牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉。然后，在阻断溶液中加入一种特异性的抗体，抗体可以与感兴趣的蛋白质结合。
抗体结合的蛋白质可以被进一步检测。
最后是图像开发阶段。Western Blot的图像开发通常是通过酶标记
二抗的荧光或酶标记产生的化学发光。这意味着在膜上的蛋白质上有特异
性抗体结合。然后，在图像上使用相应的技术来检测抗体结合的蛋白质，
以获得目标蛋白质的图像。
总结起来，Western Blot是一种广泛应用于生物学研究的技术，用
于分析复杂的蛋白质混合物。它通过电泳和免疫反应的结合，可以检测和
分离出特定的蛋白质。虽然操作过程较为复杂，但其可靠性和准确性使其成为许多实验室中常用的技术。
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蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。
蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用
稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。
蛋白质类别和溶解性质
白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出
醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇
壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液
精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀
组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀
硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱
缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。
蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：
一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；
二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。
制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态
分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。
由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样进行创造性的分离提纯时，更需要经过各种方法比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期结果。其次在分离提纯工作前，常须建立相应的分析鉴定方法，以正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程方法的优劣，选择条件效果的好坏，均须通过分析鉴定来判明。
3楼
⑵物理方法
主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
Ⅰ反复冻融法
于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结
产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，
但脂蛋白冻结变性。
Ⅱ冷热变替法
将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
Ⅲ超声波法
暴露于9～10千周声波或10～500千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶
液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。
Ⅳ加压破碎法
加一定气压或水压也可使细胞破碎。
⑶化学及生物化学方法
Ⅰ有机溶媒法
粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破
碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。Ⅱ自溶法
将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。
Ⅲ酶法
与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g菌体加1～10mg溶菌酶， p H6.2～7.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。
表面活性剂处理
较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。
此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。
2、细胞器的分离
制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA几乎全部集中在细胞核内。RNA则大部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。
以肝细胞为例,蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况为:
细胞核: 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 RNA占总量10%左右 DNA几乎全部
粒线体: 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶
系 RNA占总量5%左右 DNA微量
内质网（微粒体）: 蛋白质合成酶系、羟化酶系 RNA占总量50%左右