归纳荧光光谱原理.ppt
合集下载
荧光光谱分析法ppt课件
荧光分子都具有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱（荧光光 谱）。
（1）荧光的激发光谱
激发光谱：表示不同激发波长
下所引起物质发射某一波长荧光的
相对效率。 绘制激发光谱：固定发射波长
(选最大发射波长),然后以不同波长的
入射光激发荧光物质，以荧光强度F对
激发波长l作图，即为激发光谱。
12
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强 度最大，称为最大激发波长 lex
16
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
（2）荧光的发射光谱（荧光光谱） 荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强
度。绘制发射光谱时， 使激发光波长固定在lex处，然后对发 射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度 F 对发射波长l作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。
发射光谱（荧光光谱）的位置？ 磷光光谱的位置？
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1 →S0跃迁)；发光速度很慢： 10-4~100s、磷光的能量比荧光小
电子由S0进入T1的过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 光照停止后，可持续一段时间
2. 荧光的激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
荧光光谱的原理及应用
荧光探针在药物筛选中的应用
荧光探针也可用于药物筛选过程中，通过标记特定的靶点或 受体，观察药物与靶点或受体之间的相互作用。这种方法有 助于加速新药研发过程，提高药物筛选的效率和准确性。
荧光光谱在环境监测中的实际应用案例
荧光光谱在水质监测中的应用
荧光光谱技术可用于检测水体中的有机污染物，如农药、石油和工业废水等。通过分析水样中的荧光光谱，可以 确定污染物的种类和浓度，为环境保护和治理提供科学依据。
计算机
处理和显示测量数据，控制光 谱仪的操作。
荧光光谱的测量步骤
准备样品
选择适当的荧光物质 样品，并进行必要的 处理和纯化。
安装样品
将样品放入样品池中， 并确保激发光能够照 射到样品上。
调整仪器
根据实验需求，调整 激发光源、单色仪和 检测器的参数。
பைடு நூலகம்
进行测量
启动光谱仪，测量荧 光物质在不同波长下 的荧光强度。
热能等形式散失。
荧光光谱的形状可以反映荧光 物质的分子结构和环境因素，
如溶剂极性、温度等。
02
荧光光谱的测量技术
荧光光谱的测量方法
发射光谱法
通过测量荧光物质发射的光谱，确定荧光物 质的结构和组成。
吸收光谱法
通过测量荧光物质吸收的光谱，研究荧光物 质的能级结构和跃迁过程。
时间分辨光谱法
通过测量荧光物质在不同时间点的光谱，研 究荧光物质的动态过程和寿命。
荧光光谱法可用于研究聚合物的 荧光性质，如荧光量子产率、荧 光寿命等，有助于聚合物的性能 研究和质量控制。
在生物学研究中的应用
生物分子的荧光标记
荧光光谱法可用于标记生物分子，如蛋白质、核酸等， 以研究其结构和功能。
细胞成像
荧光探针也可用于药物筛选过程中，通过标记特定的靶点或 受体，观察药物与靶点或受体之间的相互作用。这种方法有 助于加速新药研发过程，提高药物筛选的效率和准确性。
荧光光谱在环境监测中的实际应用案例
荧光光谱在水质监测中的应用
荧光光谱技术可用于检测水体中的有机污染物，如农药、石油和工业废水等。通过分析水样中的荧光光谱，可以 确定污染物的种类和浓度，为环境保护和治理提供科学依据。
计算机
处理和显示测量数据，控制光 谱仪的操作。
荧光光谱的测量步骤
准备样品
选择适当的荧光物质 样品，并进行必要的 处理和纯化。
安装样品
将样品放入样品池中， 并确保激发光能够照 射到样品上。
调整仪器
根据实验需求，调整 激发光源、单色仪和 检测器的参数。
பைடு நூலகம்
进行测量
启动光谱仪，测量荧 光物质在不同波长下 的荧光强度。
热能等形式散失。
荧光光谱的形状可以反映荧光 物质的分子结构和环境因素，
如溶剂极性、温度等。
02
荧光光谱的测量技术
荧光光谱的测量方法
发射光谱法
通过测量荧光物质发射的光谱，确定荧光物 质的结构和组成。
吸收光谱法
通过测量荧光物质吸收的光谱，研究荧光物 质的能级结构和跃迁过程。
时间分辨光谱法
通过测量荧光物质在不同时间点的光谱，研 究荧光物质的动态过程和寿命。
荧光光谱法可用于研究聚合物的 荧光性质，如荧光量子产率、荧 光寿命等，有助于聚合物的性能 研究和质量控制。
在生物学研究中的应用
生物分子的荧光标记
荧光光谱法可用于标记生物分子，如蛋白质、核酸等， 以研究其结构和功能。
细胞成像
荧光光谱分析法-课件
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
20
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似,故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关,各小峰的 高度与跃迁 几率有关。
电子能级的多重性 M=2S+1
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则),三重态能级比相应
单重态能级低;
大多数有机分子的基态处于单重态；
11
小结:激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋,因而具有反磁性;激发 三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁
2008年诺贝尔化学奖
2
3
澳大利亚科学家最新发现, 一种叫“螳螂虾”的海里 动物通过发出色彩鲜艳的 荧光来恐吓警告敌对者或 者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
4
green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
S0→S1、S2 允许跃迁; S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
12
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
荧光光谱原理
荧光光谱原理 The final edition was revised on December 14th, 2020.根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理，具有吸收光子能力的物质在特定波长光（如紫外光）照射下可在瞬间发射出比激发光波长长的荧光，利用物质的荧光光谱进行定性、定量分析的方法称为荧光分析法。
荧光光谱辐射峰的波长与强度包含许多有关样品物质分子结构与电子状态的信息，但外界因素对其荧光强度结果有一定的影响。
当某些物质受到紫外线照射时，会发射出各种颜色和不同强度的可见光，当紫外线停止照射时，所发射的光线会随即消失，人们将这种光线称为荧光。
荧光由一种能发荧光的物质-萤石而得名。
荧光的产生主要包括物质分子对光能的选择性吸收、激发和分子的去活化三个过程。
光在通过物质的过程中，由于某些频率的光被吸收而强度减弱，这一现象被称为物质对光的吸收。
原子、分子或者离子都具有不连续的、数目有限的量子化能级结构，且只能吸收与两能级之差相同或为整数倍的能量。
当所照射的光线和所被测物质的分子具有相同的频率时，入射光才能够该物质的分子所吸收。
根据量子学理论，分子所吸收的光线可由此来表示，即 0 1-== hc hvE E λ (2-1) 式中 E1——吸光物质的高能级（一般为激发态）； E0——吸光物质的低能级（一般为基态）； h ——普朗克（Plank）常数；v——光的频率；——光的波长； c——光在真空中的速度。
λ由于不同物质的特征能级不同，所以它们所吸收的光的波长和颜色也是有区别的，即它们所吸光能量也是不一样的，每种物质都有其特有的吸光光谱。
荧光时物质在吸收入射光之后所发射的辐射，因此，溶液的荧光强度与该溶液的吸收的入射光强度以及该物质的荧光量子产率有密切关系。
荧光强度取决于激发态的初始分布与荧光量子产率的大小。
光电探测器主要是将测量的光信号转化为电信号。
目前，荧光光度计所采用的光电探测器主要有光电倍增管（PMT）和电荷耦合器件阵列检测器。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3轨道→、和n 轨道
可能产生的吸收跃迁组合为
* * < 200 nm
* * *
* n * n *
一般情况下，n-*跃迁所需能
E
量小。但当n电子与溶剂作用，
n
如形成氢键、质子化等，使n
轨道能量降低， n-*跃迁能量
增大。
区分
轨道能量
激发态能量 H2—CH2=CH2
2*
*
1*
1
2
CH2=CH2—CH2=CH2—CH2=CH2 3*
2*
1*
1
2
3
5
电子激的势能曲线交叉，容易 发生系间窜跃（intra-system crossing )
S1
T1
hvA
hvF hvP
S0 ISC效率的高低决定于
自旋-轨道耦合程度。
增加重原子常常促进
ISC过程。
6
3.1.1 有机分子荧光与结构的关系精品强荧光物质所具有的结构特征
大的共轭 键结构
刚性的平面结构
取代基团为给电子取代基
最低的激发单重态S1为,*型，而不 是n, *型
抗磁性
7
电子离域程度对荧光的影响
0.47
28
抗磁性
R2OOC
R1D/P
NO
0.011
N OAc
0. 66
6029抗磁性精品FNO + R
F
N OR
弱荧光 猝灭机理
1）IC 加剧 2）ISC加剧 3）能量转移 4）电荷转移
强荧光
N. V. Blough and D. J. Simpson, “ Chemical mediated fluorescnece yield switching in nitroxidefluorophore adducts: optical sensors of radical / redox reactions”, J. Am. Chem. Soc, 1988, 110, 19151917
非荧光
强荧光
OH
18
O➢吸电子取代基精品硝基 引起ISC增大，荧光量子产率降低，磷光 也弱，主要是增强IC过程。
19➢取代基的位置精品要点 1） 有利于电子离域的，则荧光增强。 因此，一般 邻位、对位给电子基团导致荧光增强。
2）有利于形成环，导致分子刚性增大O，荧光增强。
COOH OH
荧光强度较强
➢n,* 1) 含有杂原子（N,O,S）的有机化合物多属于这一
类，含有n 电子，其特点是自旋禁阻 ， 小，102,
ISC速率大，荧光弱。
2) n 轨道的能量受环境的影响大，如质子化或生成 氢键等，将使n 轨道的能量降低，导致n*跃迁的 能量增大。荧光分子的最低激发态可能变成,*。
分为两类
含氮杂环有机物
含羰基杂原子有机物
25
含氮质
苯 乙醇 水
N
相对荧光 1
30
1000
可以理解为N上的孤对电子与水形成氢键，使n轨道能
量降低，从而使最低单重激发态由n,*变成,*。
例2 8-羟基喹啉在酸性介质中荧光增强
H+
N OH
N H OH
26含羰基有机物精品精品Principles of Fluorescence Spectroscopy
Chemistry Department XMU1精品Chapter Three
Flu3.1 Organic molecule fluorescence 3.2 metal –ligand compounds 3.3 Probe
max max
203.5 7400 254 204
210.5 6200 270 1450
235 9400 287 2600
17
➢吸电子取代基
O
C
C
O
羰基类
1）n* 跃迁禁阻，小，10-2
2）最低单重态为 n,* 型，易于ISC。荧光弱，磷 光强
O
OH
例6 联库
要点：
1）取代基影响分子的荧光光谱特性，其影响的方式 及程度视取代基的不同而不同，有的影响不大，有的 影响严重。
2）一般规律，取代基的电子云如果能与共轭 键发 光基团作用，降低能量，增大 电子的离域区域， 则荧光增强，发射波长红移。
15
➢给电子取代基 增强荧光 —NH2, —NHR, —NR365 nm
相对荧光强度 1.8
270-310 nm 1.0
H N
H
310-405 nm
2.0
H
O
吸收增强
HN
荧光减弱 如何理解？
H
荧光减弱
16
酚盐吸收性质
化合物HO O精品介质（ 2%Байду номын сангаас醇）
CH O H
O
COOH
COOH
HO
OH
荧光强度较弱
203）双取代基精品可以是协同作用，也可以是非协同作用，当为非协同作 用时，以作用大的为主。
H3C N
H3C
CC HH
4 – 二甲基胺 - 4‘ – 硝基苯乙烯
O N+
O-
协同作用
21➢重原子效应精品22重原子效应P
F2-Cl 萘精品精品F0.92
10
例2 笏与联苯
F4 金属配合物精品12例5 荧光衍生化
精品VB1 [O] 硫胺荧CH3
N
N
(Z)
H3C
S N NH2HCl
硫胺素，VB1， 非荧光
C2H5OH
CH3
N
H3C
N
N
(Z)
C2H5OH
N (E) S
硫胺荧，强荧光13
芳香类 S1与T1能级间隙小， ISC效率高，接近于1。
ISC
0.99 1.00 1.01 0.84 0.93 0.87 0.87
脂肪类 有微弱的荧光，ISC效率低一ramagnetic
COOR
荧光量子产率
D/P
R=
NO
0.0082
57
R=
N OAc
2-Br 萘 2- I 萘
23重原子效应精品OCH3H3C N
N
ON
N
CH3
F
0.22
P
0.14
P
1.9 s
S
CH3
H3C N
N
ON
N
CH3
10-5
0.43
0.024 s
）的有机化合物均属于这一 类，其特点是自旋允许跃迁，大，104，荧光强
例1 绸环芳烃
化合物名
化合物结构苯 萘精品FEX nmEM nm
0.11 205 278
0.29 286 321
蒽
0.46 365 400
丁省
0.60 390 480
戊省
0.52 580 640 8
例2 1,2 – 二苯乙烯
H CC
(E)
顺式， 不发光
9
刚性平面结构 例1 荧光素与酚酞
可能产生的吸收跃迁组合为
* * < 200 nm
* * *
* n * n *
一般情况下，n-*跃迁所需能
E
量小。但当n电子与溶剂作用，
n
如形成氢键、质子化等，使n
轨道能量降低， n-*跃迁能量
增大。
区分
轨道能量
激发态能量 H2—CH2=CH2
2*
*
1*
1
2
CH2=CH2—CH2=CH2—CH2=CH2 3*
2*
1*
1
2
3
5
电子激的势能曲线交叉，容易 发生系间窜跃（intra-system crossing )
S1
T1
hvA
hvF hvP
S0 ISC效率的高低决定于
自旋-轨道耦合程度。
增加重原子常常促进
ISC过程。
6
3.1.1 有机分子荧光与结构的关系精品强荧光物质所具有的结构特征
大的共轭 键结构
刚性的平面结构
取代基团为给电子取代基
最低的激发单重态S1为,*型，而不 是n, *型
抗磁性
7
电子离域程度对荧光的影响
0.47
28
抗磁性
R2OOC
R1D/P
NO
0.011
N OAc
0. 66
6029抗磁性精品FNO + R
F
N OR
弱荧光 猝灭机理
1）IC 加剧 2）ISC加剧 3）能量转移 4）电荷转移
强荧光
N. V. Blough and D. J. Simpson, “ Chemical mediated fluorescnece yield switching in nitroxidefluorophore adducts: optical sensors of radical / redox reactions”, J. Am. Chem. Soc, 1988, 110, 19151917
非荧光
强荧光
OH
18
O➢吸电子取代基精品硝基 引起ISC增大，荧光量子产率降低，磷光 也弱，主要是增强IC过程。
19➢取代基的位置精品要点 1） 有利于电子离域的，则荧光增强。 因此，一般 邻位、对位给电子基团导致荧光增强。
2）有利于形成环，导致分子刚性增大O，荧光增强。
COOH OH
荧光强度较强
➢n,* 1) 含有杂原子（N,O,S）的有机化合物多属于这一
类，含有n 电子，其特点是自旋禁阻 ， 小，102,
ISC速率大，荧光弱。
2) n 轨道的能量受环境的影响大，如质子化或生成 氢键等，将使n 轨道的能量降低，导致n*跃迁的 能量增大。荧光分子的最低激发态可能变成,*。
分为两类
含氮杂环有机物
含羰基杂原子有机物
25
含氮质
苯 乙醇 水
N
相对荧光 1
30
1000
可以理解为N上的孤对电子与水形成氢键，使n轨道能
量降低，从而使最低单重激发态由n,*变成,*。
例2 8-羟基喹啉在酸性介质中荧光增强
H+
N OH
N H OH
26含羰基有机物精品精品Principles of Fluorescence Spectroscopy
Chemistry Department XMU1精品Chapter Three
Flu3.1 Organic molecule fluorescence 3.2 metal –ligand compounds 3.3 Probe
max max
203.5 7400 254 204
210.5 6200 270 1450
235 9400 287 2600
17
➢吸电子取代基
O
C
C
O
羰基类
1）n* 跃迁禁阻，小，10-2
2）最低单重态为 n,* 型，易于ISC。荧光弱，磷 光强
O
OH
例6 联库
要点：
1）取代基影响分子的荧光光谱特性，其影响的方式 及程度视取代基的不同而不同，有的影响不大，有的 影响严重。
2）一般规律，取代基的电子云如果能与共轭 键发 光基团作用，降低能量，增大 电子的离域区域， 则荧光增强，发射波长红移。
15
➢给电子取代基 增强荧光 —NH2, —NHR, —NR365 nm
相对荧光强度 1.8
270-310 nm 1.0
H N
H
310-405 nm
2.0
H
O
吸收增强
HN
荧光减弱 如何理解？
H
荧光减弱
16
酚盐吸收性质
化合物HO O精品介质（ 2%Байду номын сангаас醇）
CH O H
O
COOH
COOH
HO
OH
荧光强度较弱
203）双取代基精品可以是协同作用，也可以是非协同作用，当为非协同作 用时，以作用大的为主。
H3C N
H3C
CC HH
4 – 二甲基胺 - 4‘ – 硝基苯乙烯
O N+
O-
协同作用
21➢重原子效应精品22重原子效应P
F2-Cl 萘精品精品F0.92
10
例2 笏与联苯
F4 金属配合物精品12例5 荧光衍生化
精品VB1 [O] 硫胺荧CH3
N
N
(Z)
H3C
S N NH2HCl
硫胺素，VB1， 非荧光
C2H5OH
CH3
N
H3C
N
N
(Z)
C2H5OH
N (E) S
硫胺荧，强荧光13
芳香类 S1与T1能级间隙小， ISC效率高，接近于1。
ISC
0.99 1.00 1.01 0.84 0.93 0.87 0.87
脂肪类 有微弱的荧光，ISC效率低一ramagnetic
COOR
荧光量子产率
D/P
R=
NO
0.0082
57
R=
N OAc
2-Br 萘 2- I 萘
23重原子效应精品OCH3H3C N
N
ON
N
CH3
F
0.22
P
0.14
P
1.9 s
S
CH3
H3C N
N
ON
N
CH3
10-5
0.43
0.024 s
）的有机化合物均属于这一 类，其特点是自旋允许跃迁，大，104，荧光强
例1 绸环芳烃
化合物名
化合物结构苯 萘精品FEX nmEM nm
0.11 205 278
0.29 286 321
蒽
0.46 365 400
丁省
0.60 390 480
戊省
0.52 580 640 8
例2 1,2 – 二苯乙烯
H CC
(E)
顺式， 不发光
9
刚性平面结构 例1 荧光素与酚酞