应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析_邢德峰

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高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价

高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价一、本文概述随着生物技术的发展和深入，土壤微生物群落的研究逐渐受到广泛关注。

作为土壤生态系统的重要组成部分，微生物群落的结构和多样性对土壤健康、生态平衡以及农业可持续发展具有重要影响。

高通量测序技术和DGGE（变性梯度凝胶电泳）分析是近年来在微生物生态学研究中常用的两种技术手段，它们各自具有独特的优势和局限性。

本文旨在全面评价这两种技术在土壤微生物群落研究中的应用效果，以期为相关领域的研究提供有益的参考和借鉴。

本文首先将对高通量测序技术和DGGE分析的基本原理、操作流程及其在土壤微生物群落研究中的应用进行详细介绍。

随后，通过综述已有文献和案例分析，评估这两种技术在揭示土壤微生物群落结构、多样性和动态变化方面的准确性和可靠性。

本文还将探讨这两种技术在实践应用中的优缺点、适用范围及限制条件，以期为研究者在选择合适的技术手段时提供有益的指导。

本文旨在通过深入评价高通量测序和DGGE分析在土壤微生物群落研究中的应用效果，为相关领域的研究提供有价值的参考信息，推动土壤微生物生态学研究的深入发展。

二、高通量测序技术及其在土壤微生物群落分析中的应用高通量测序技术，又被称为下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS），是近年来生物学领域革命性的技术进步之一。

它允许在单次运行中同时对数百万至数十亿的DNA分子进行测序，极大地提高了测序通量和效率。

在土壤微生物群落分析中，高通量测序技术已成为不可或缺的工具。

高通量测序技术基于边合成边测序的原理，通过桥式PCR扩增生成DNA簇，并利用可逆性终止子的荧光标记核苷酸进行连续测序。

在测序过程中，每加入一种荧光标记的核苷酸，都会通过扫描记录下荧光信号，并切除荧光基团和终止基团，继续进行下一个核苷酸的添加和测序。

这一过程循环进行，直至获得完整的DNA序列信息。

土壤是一个极为复杂的生态系统，其中包含了大量的微生物种类和种群。

PCRDGGE技术解析生物制氢反应器微生物多样性

PCR -DGGE 技术解析生物制氢反应器微生物多样性邢德峰，任南琪!，宫曼丽（哈尔滨工业大学市政环境工程学院，哈尔滨150090）摘要：为了揭示发酵法生物制氢反应器厌氧活性污泥的微生物种群多样性，从运行不同时期取厌氧活性污泥，通过细胞裂解直接提取活性污泥的基因组DNA.以细菌16Sr RNA 基因通用引物F 338GC ／R534进行V 3高变异区域PCR 扩增，长约200b p 的PCR 产物经变性梯度凝胶电泳（DGGE ）分离后，获得微生物群落的特征DNA 指纹图谱.研究表明，不同时期的厌氧活性污泥中存在共同种属和各自的特异种属，群落结构和优势种群数量具有时序动态性，微生物多样性呈现出协同变化的特征.微生物多样性由强化到减弱，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替速度由快速到缓慢.优势种群经历了动态演替过程，最终形成特定种群构成的顶级群落.关键词：变性梯度凝胶电泳；生物制氢；16Sr RNA ；微生物多样性中图分类号：X 172文献标识码：A文章编号：0250-3301（2005）02-0172-05收稿日期：2004-05-11；修订日期：2004-07-04基金项目：国家高技术研究发展计划（863）项目（2003AA 515030）；国家重点基础研究发展规划（973计划）项目（G 2000026402）；国家杰出青年科学基金项目（50125823）；黑龙江省自然基金项目（G Z03C 314）作者简介：邢德峰（1977!），男，博士研究生，主要从事环境生物技术，微生物分子生态学和废水生物处理等领域的研究.!通讯联系人A pp lication of PCR -DGGE t o Reso lve m icrobial D iversit y i n b io -H y dro g en Pro-duci n g React orX I NG D e-f en g ，REN N an-C i ，GONG M an-li（S choo l o f M un ici p al and Environ m ental En g i neeri n g ，~arb i n I nstitute o f T echno lo gy ，~arb i n 150090，Ch i na ）Abstract ：T o reveal m icrob ial d ivers it y o f anaerob ic activated s lud g e i n b io -h y dro g en p roduci n g reactor ，s lud g e i n d iff erent p eriod w ere sa m p led and t he ir g enom ic DNA o f m icrob ial comm un it y w as extracted d irectl y .A fter p urification o f t he g enom ic DNA us i n g DNAg e l recover y kit ，t he 16Sr RNA g enes （V 3re g ion ）w ere a m p lified b y us i n g t he un iversal p ri m ers （F 338GC and R534）.T he result o f a g arose g e l （2%）e lectro p hores is showt hat t he PCR p roducts w ere about 200b p .T hese a m p lified DNAfra g m ents w ere se p arated b y denaturi n g g rad ient g e l e lectro p hores is （DGGE ）w it h t he denaturant （urea and f or m a m i de ）from30%to 60%.T he p ro file o f DGGEshow t hat d iff erent s lud g e had t he d iff erent bands ’p atterns.I n t he p ro files o f DGGE ，t here ex ist som e comm on bands i n all s lud g e sa m p les ，wh ich i nd icate t hat som e ki nds o f microor g an is m s ex ist i n each p eriod.O n t he o t her hand ，t he s p ecific bands i n som e s lud g e show t hat d iff erent p eriod had t he ir ow n s p ecific m icroor g an is m s.D y na m ics o f comm un it y structure and a m ount o f dom i nant p o p ula-tions w ere res p ons i b le to d iff erent p eriod.S h ift o f m icrob ial d ivers it y corres p ond to p eriod o f runn i n g reactor ，m icrob ial d ivers it y i n-creased bef ore it decreased.S i m ilarit y bet w een comm un ities g raduall y i ncreased ，s p eed o f sh ift g raduall y decreased i n success ion.F i-nall y ，m icrob ial cli m ax comm un it y m ade u p o f s p ecific p o p ulations w as f or m ed.K e y words ：denaturi n g g rad ient g e l e lectro p hores is （DGGE ）；b io -h y dro g en p roduction ；16Sri bosom al RNA ；m icrob ial d ivers it y发酵法生物制氢技术是实现生物制氢工业化生产最有前景的研究方向，由于采用的是厌氧活性污泥为菌种，因此，其反应器的运行状态和产氢效能直接取决于反应系统的微生物群落［1］.活性污泥微生物种类极其丰富，优势种群及其微生物多样性在活性污泥生态系统中发挥着重要的作用.目前在环境科学和污染防治研究领域，关于活性污泥中微生物多样性的研究越来越受到重视；而传统的纯培养分离技术研究活性污泥微生物多样性有很大的缺陷，不能获得未被培养的微生物的信息，只能分离出占活性污泥总数0.1%!1%的微生物种类［2］.而分子生物学技术如PCR -DGGE ［3］，PCR -SSCP ［4］和T -RFLP ［5］能够在分子水平上对活性污泥微生物多样性进行快速和精确的分子诊断，并可以监测未被培养的微生物种类.变性梯度凝胶电泳（DGGE ）是目前研究微生物遗传多样性和种群动态性最有力的分子生物学技术.1993年M u y Zer ［6］首次将该技术应用于微生物生态的研究.在近10年的时间里已被广泛应用于各种环境微生物生态的研究，如高温热泉［7］、湖泊［8］、海洋［9］、土壤［10］、沙丘［11］根际［12］、活性污泥［13］和生物膜［14］等.变性梯度凝胶电泳（DGGE ）主要原理是基于在含有线形浓度递增的变性剂（尿素和甲酰胺的混合物）的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，部分解链的双链DNA 分子的电泳迁移率降低；而序列不同的第26卷第2期2005年3月环境科学ENV I RONM ENTAL SC I ENCEV o l .26，N o.2M ar .，"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""2005DNA分子有着不同的解链行为，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使长度相同而序列不同的DNA 片段分离［15］.由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16S r RNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异，所以活性污泥中不同微生物的16S r RNA基因的V3区的扩增DNA片断在DGGE中能够得到分离，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以辨别出样品中微生物的种类多少，分析活性污泥中微生物的多样性.本文从生物制氢反应器中获取厌氧活性污泥，然后直接提取出活性污泥混合菌群的基因组DNA，以PCR扩增16S r RNA基因V3区域，用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术进行分离和鉴定PCR扩增产物，从而得出生物制氢反应器厌氧活性污泥微生物种群多样性的信息.l材料和方法l.l材料（1）厌氧活性污泥样品试验采用有机玻璃连续流搅拌槽式反应器（CSTR）［16］，发酵生物制氢反应器启动所使用的污泥来源于生活污水排放沟底泥.实验废水采用废糖蜜加水稀释而成，配制时投加一定比例的农用复合肥，使废水中CODI NI P保持在1000I5I1左右.初始COD容积负荷为7.0 k g／（m3・d），~RT为6h.间隔7d从反应器取厌氧活性污泥.（2）仪器及设备低温冷冻离心机（BECKM AN A e g ra21R）；紫外分光光度仪（UN I CAM ~E!I O S）；PCR扩增仪（PE9700）；凝胶成像分析系统（B io-Rad Am p G ene）；D code TM的基因突变检测系统（B io-Rad）；电泳仪（B io-Rad Pow er Pac B asic）；透射扫描仪（UM AX A stra4000U）.l.2方法l.2.l基因组DNA的提取采用改进的化学裂解法直接从厌氧活性污泥中提取基因组DNA.（1）提取缓冲液CTAB／N aC溶液（10% CTAB，0.7m o／L N aC），在80mL~2O中溶解4.1g N aC，缓慢加入CTAB（十六烷基三乙酸溴化铵），同时加热并搅拌，定容终体积至100mL.（2）活性污泥样品处理将1g活性污泥用无菌水洗3次后，用液氮将污泥沉淀研成粉末，取100m g 污泥粉末，加入567"L的TE缓冲液重悬，加30"L 质量浓度10%SD S和3"L20m g／mL的蛋白酶K，混匀，于37C温育1h.（3）基因组DNA的抽提加入100"L5m o／L N aC，充分混匀，再加入80"L CTAB／N aC溶液，混匀，于65C温育10m i n.加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀，12000r／m i n离心4#5m i n.将上清液转入一只新离心管中，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，混匀，离心5m i n，将上清液转入一只离心管中.加入0.6倍体积异丙醇，醇沉30m i n.12000r／m i n离心5m i n，弃上清，抽真空干燥后，重溶于50"L TE缓冲液.（4）DNA粗提液的测定使用紫外分光光度计对提取的DNA粗提液样品进行测定（OD260／OD280和OD260／OD230），计算所得样品DNA产量和纯度. l.2.2基因组DNA的纯化提取活性污泥DNA［13］，采用上海华舜DNA柱式胶回收试剂盒纯化DNA粗提液，将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应（PCR）的模板.l.2.3基因组DNA的PCR扩增使用A pp ied B ios y ste m的G eneAm p PCR s y s-te m9700型基因扩增仪.（1）以大多数细菌和古细菌的16S r RNA基因V3区通用引物扩增引物BSF338（5/-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3/）和BSR534（5/-ATT ACC GCG GCT GCT GGC-3/）（GC夹序列为：5/-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3/）.（2）PCR反应体系100"L的PCR反应体系组成如下：100n g模板、40p m o正反引物、200"m o／L d NTP s（每种10mm o／L）、10"L的10X PCR buff er（M g C2）、2.5U的!"#DNA聚合酶，无菌纯水补齐到100"L.（3）PCR反应条件采用降落PCR策略扩增，95C预变性5m i n，94C变性1m i n，65C退火1m i n，72C延伸30s，每个循环退火温度降低0.5C直至55C，30个循环，72C最终延伸8m i n.PCR反应的产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测.l.2.4变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析采用B io-Rad公司D code TM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离.（1）变性梯度胶的制备使用梯度混合装置，制备8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从30%到60%（100%的变性剂为7m o／L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），其中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增.（2）PCR样品的加样待变性梯度胶完全凝固3712期环境科学后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品5!L和10倍加样缓冲液混合后加入上样孔.（3）电泳及染色在150V的电压下，60C电泳4h.电泳结束后，将凝胶进行银染.（4）胶图扫描将染色后的凝胶用UM AX透射扫描仪扫描后获取胶图，在凝胶两面覆上干胶膜（P rom e g a），用干胶夹定型，自然干燥后长期保存. 1.2.5DGGE的指纹图谱分析利用G el D ocu m ent3000分析软件（B io-Rad）分析DGGE的指纹图谱，通过分析样品电泳条带的数目和亮度来评估微生物多样性和种群相对数量.2结果与分析2.1厌氧活性污泥的基因组DNA提取采用冻融法和化学裂解法相结合提取厌氧活性污泥的基因组DNA.通过无菌水洗厌氧活性污泥沉淀，可以降低样品中的腐殖质等杂质的含量.通过液氮冷冻和温浴，以及溶菌酶和表面活性剂等手段尽可能使全部菌体破胞，使DNA最大限度地释放出来，从而保证获得全部细菌基因组DNA，并增加DNA提取收率.提取厌氧活性污泥基因组DNA后，经过RN ase去除RNA，然后测定其含量和纯度.提取的DNA用1%的琼脂糖，在100V电压下进行电泳.由图1所示，各时期厌氧活性污泥的细菌基因组DNA大于15kb，从不同厌氧活性污泥样品提取出的基因组DNA含量不同.由表1可知，从反应器不同运行时期获取的厌氧活性污泥，提取的DNA产量不同，从1d到29d，产量逐渐递增.1d的DNA产量最低为4.51!g／g污泥，29d最高为15.55!g／g污泥，这是由于反应器运行后生物量的增长所导致的结果.另外，从不同时期厌氧活性污泥提取的DNA 的纯度也不同，从A260／A280（核酸与蛋白质之比）和A260／A230（核酸与腐殖质等物质之比）的比值来看，22d和29d活性污泥的A260／A280的比值相对较小，这是由于微生物代谢旺盛产生了大量胞外聚合物，使DNA抽提过程不彻底所引起的.虽然DNA含量提高但是A260／A230的比值相对1d变化不大，这是由于微生物物质代谢过程中产生大量的腐殖质等物质导致.综上可见，1d的产量低纯度高，而29d虽然产量高但是纯度降低.所以，要解决产量高而带来的纯度低的问题，仍然需要改进厌氧活性污泥的DNA提取方案，在提高污泥DNA产量的同时还要达到高纯度提取.M aker：DL15000图1厌氧活性污泥基因组D N A琼脂糖凝胶电泳图谱F i g.1A g aro se g e l e lectro p ho res is o f g enom ic DNAo f d ifferen t sam p les表1污泥样品D N A的产量和纯度比较T ab le1C om p arison o f t he y ie ld and p urit y o f DNA o fd iff erent s lud ge sa m p les污泥样品／d污泥的DNA含量／!g・g-1A260／A280A260／A23014.511.3040.53487.901.3210.4831510.831.1890.6202214.631.2080.5262915.551.1120.501 2.2厌氧活性污泥的基因组DNA纯化产氢产酸的厌氧活性污泥中含有大量的腐殖质等杂质，并且在DNA提取过程中还有一些试剂是PCR扩增反应的抑制剂，直接进行PCR反应往往不能获得扩增产物.因此，在PCR反应之前，必须对厌氧活性污泥的基因组DNA粗提液进行纯化.本实验采用上海华舜DNA柱式胶回收试剂盒对厌氧活性污泥的基因组DNA粗提液进行了纯化，虽然纯化后每种厌氧活性污泥的基因组DNA产量有所损失，但纯化后的基因组DNA样品中PCR反应抑制剂的含量大大降低，从而为后续的PCR反应提供了纯度较高的DNA模板.2.3基因组DNA的PCR扩增以等量的污泥基因组DNA为模板，采用对大多数细菌和古细菌的16s r RNA基因V3区通用引物（F338GC／R534）对每个厌氧活性污泥样品的基因组DNA进行扩增，在引物F338的5 端添加GC 夹以提高扩增片断的分离效果.反应器运行不同时期的厌氧活性污泥PCR扩增结果如图2所示，经PCR反应后获得了各个时期污泥微生物的16s r RNA基因V3区的目的片断，琼脂糖凝胶电泳显示片断大小约200b p左右.采用降落PCR扩增，提高了样品的扩增特异性，降低了DGGE分析的误差.各个样品的扩增产物可以作为DGGE的样品，能够471环境科学26卷达到分离和鉴别各个厌氧活性污泥样品中微生物种类的目的.M aker：DL2000图2厌氧活性污泥样品的l6s r RNA基因V3区PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱F i g.2A g arose g e l e lectro p hores is of PCRa m p lified16s r RNA（V3）g ene o f d iff erent sa m p les2.4变性梯度凝胶电泳不同厌氧活性污泥样品的DGGE图谱如图3所示，不同厌氧活性污泥样品经过变性梯度凝胶电泳（DGGE）都可以分离出数目不等的电泳条带，且各个条带的信号强度和迁移位置不同.根据变性梯度凝胶电泳（DGGE）对具有相同大小而不同DNA 序列的片断分离原理，可以得知5个时期厌氧活性污泥的PCR产物中含有十几种不同序列的DNA片断，它们是一些特异微生物种类的16s r RNA基因V3区的DNA片断，每个独立分离的DNA片断原理上可以代表一个微生物种属.电泳条带越多说明生物多样性丰富，条带信号越强，表示该种属的数量越多，从而确定不同活性污泥中所含有的微生物的种类和数量关系，得出其中微生物多样性的信息.反应器运行初期1d时，微生物多样性较低，随着时间的推移，8d时生物多样性达到最大，15d后生物多样性开始降低，到29d时生物多样性基本保持不变.在反应器运行过程中，厌氧活性污泥微生物群落结构和种群数量存在明显的演替过程，优势种群的功能地位处于动态变化中，直到形成了顶级优势群落.“!”和“"”标记位置的条带分别为不同时期微生物群落中的优势种群，这些种群在群落演替过程中发挥着重要的作用.其中“"”标记条带为某一群落的特征带，其代表的优势种群是特定生态条件下微生物群落的特征种属.在微生物群落结构的演替过程中，DGGE指纹图谱显示存在许多共同的种属，如图中“#”标记条带为共同带，在反应器运行过程中一直存在.这些现象可以说明反应器从接种污泥到稳定运行过程中，一些种属的微生物一直存在，并且在微生物群落的物质和能量代谢中发挥着作用，是一些生态幅比较广泛的种属.不同时期的厌氧活性污泥中既存在着共同的微生物种属，同时也存在着各自独特的微生物种属，微生物种属之间通过协同和竞争作用，形成了特定生态位的群落结构.#标记条带为共同带；!和"标记条带为特征带图3不同厌氧活性污泥样品的DGGE分离图谱F i g.3DGGE p ro file o f d iff erent sa m p les2.5DNA指纹图谱分析由于影响DGGE分辨率的因素很多，所以实际上每个条带也可能是多个微生物的DNA片断.可见通过指纹分析可能由于分辨率的问题降低了群落多样性，但是仍然能够很好的分析群落多样性.通过软件对DGGE指纹图谱进行UPGM A聚类分析，图4结果显示，1d的微生物群落优势种属为14种，其群落结构与其它时期群落结构的相似性最低，由此可见反应器在运行时初期群落演替迅速.8d时微生物群落多样性达到最大，优势种群比较多，微生物优势种属达到20种.22d和29d时微生物群落结构相似程度较高为88.2%，群落演替进程缓慢，结构组成逐渐趋于稳定.厌氧活性污泥经过驯化过程，微生物数量和优势种群增加，29d时微生物多样性显著要高于1d，微生物优势种属达到17种，既存在原有种属消亡，也有新种属的增长.在演替过程中，微生5712期环境科学物多样性增加后又逐渐降低，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替过程由迅速到缓慢，形成了稳定的群落类型.3结论（1）在生物制氢反应器运行中，厌氧活性污泥微生物群落经历了明显的演替过程，群落结构和优势种群数量具有时序动态性，微生物多样性呈现出协同变化的特征.（2）DGGE的DNA指纹图谱显示，在微生物群落结构的演替过程中，各个群落都存在特征带，其代表的优势种群是特定生态条件下微生物群落的特征图4DGGE图谱UPGM A聚类分析F i g.4C luster anal y s is of DGGE b y UPGM A种属.同时，从接种污泥到反应器稳定运行过程中，也存在共同带，一些种属的微生物一直存在，并且在微生物群落的物质和能量代谢中发挥着作用，是一些生态幅比较广泛的种属.不同时期的厌氧活性污泥中既存在着共同的微生物种属，同时也存在着各自独特的微生物种属，微生物种属之间通过协同和竞争作用，形成了特定生态位的群落结构.（3）在演替过程中，微生物多样性增加后又逐渐降低，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替速度加快后减慢，直到形成稳定的群落类型.参考文献：［1］D ebabrata D，V eZiro lu T N.~y dro g en p roduction b y b io lo g ical p rocesses：a surve y o f literature［J］.int.J.~y dro g en Ener gy，2001，26：13!28.［2］Am ann R i，LudW i g W，S ch le if er K~.Ph y lo g enetic i dentifica-tion and i n s itu detection of i nd ivi dual m 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变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用

变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用李德斌;杨洪一;卢磊【摘要】变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是目前在微生物生态学上应用比较广泛的技术之一,具有简便、准确可靠和重复性好等优点.对DGGE的原理、流程、各项技术要点和在微生物生态学上的应用等方面进行了详细地论述,同时归纳和总结了DGGE的优缺点和局限性.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)012【总页数】5页(P88-92)【关键词】DGGE;微生物生态学;PCR【作者】李德斌;杨洪一;卢磊【作者单位】东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040【正文语种】中文微生物生态学 (microbial ecology)是研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。

微生物作为自然环境的重要组成部分之一,发挥着重要的作用,是微生物微生态研究的主体。

但人们对环境中的微生物了解却很少,主要是因为传统的方法是利用微生物形态、培养特性、生理生化特性、生态特性和遗传特性等作为依据对微生物进行鉴定和分类。

其工作繁复、分析速度慢,制约因素多。

然而,在自然环境中能够纯培养的微生物菌株的数量还不到自然界微生物总数的 1%-15%[1] ,这极大地限制了微生物微生态学的发展。

近年来,一些分子生物学方法逐渐被应用在微生物学的各个领域中,其中变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)[2] 由于其可靠性强、重现性好和方便简洁等优点而逐渐显露出来。

DGGE技术是 DNA指纹技术,是多态性分析技术的一种,该技术是 1979年由 Fischer等[3] 最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。

1993年Muyzer[2] 等首次将 DGGE用于微生物生态学研究,更加完整和准确地描述了微生物种群多样性、数量比例和系统进化等。

应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析

［;9］
。应用 “ G1 夹板” 技术可使检出率
应用 !""# 研究微生物群落时的常见问题分析
邢德峰，任南琪"
（哈尔滨工业大学市政环境工程学院哈尔滨 &($$.$）
摘
要：变性梯度凝胶电泳（G008）是通过核酸片段对微生物群落进行研究，可以监测未培养细菌及其功能基因，
被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析，并成为微生物分子生态学研究中的重要手段之一。文中论述了并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和 HIJ 扩增效果对 G008 操作过程中遇到的常见问题，探讨了 G008 图谱的优化过程和图谱分析方法，并对 G008 的应用前景进行了综述。 G008 分析的影响，关键词：G008；微生物群落；微生物分子生态学；图谱分析；排序中图分类号：K.%1L& 文献标识码： ) 文章编号： $$$&4"#$.（#$$"）$#4$%%&4$( 的操作过程，对一些常见问题进行了整理和分析，并提出了相关的解决办法。
" 通讯作者。 23-： 1"4!(&41"#1#&&$； 567： 1"4!(&41"#1#$$1； 8496,-：+:;< =,> ? 3@A ? B:，,7@C< D6=EE? BE9? B:
作者简介：邢德峰（&.// F ），男，黑龙江人，博士研究生，研究方向为环境生物技术。 8496,-：,7@C< D6=EE? BE9? B: 收稿日期：接受日期：修回日期： #$$(4&$4#(； #$$(4&#4$(； #$$(4&#4&%

PCR-DGGE技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施

PCR-DGGE技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施马俊孝;季明杰;孔健【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2008(029)005【摘要】变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术目前已经成为研究微生物物种多样性和动态变化的分子检测工具之一.该技术不依赖于微生物的分离培养,便能快速、准确地获取复杂样品中微生物的菌群组成及其遗传信息,因此被广泛应用于微生物生态学、食品微生物学等领域.但DGGE技术存在一定的局限性,有时会造成分析结果的偏差.本文简单概述了DGGE技术的基本原理及其在微生物群落分析中的应用,重点对造成DGGE结果偏差的因素,如DNA 提取、PCR扩增、DGGE条件以及DGGE图谱分析等进行讨论,并提出相应的解决措施,旨在对DGGE检测结果的分析提供参考.【总页数】5页(P493-497)【作者】马俊孝;季明杰;孔健【作者单位】山东大学,微生物技术国家重点实验室,山东,济南,250100;山东大学,微生物技术国家重点实验室,山东,济南,250100;山东大学,微生物技术国家重点实验室,山东,济南,250100【正文语种】中文【中图分类】Q939.97【相关文献】1.PCR-DGGE技术在智能化沼气池微生物多样性研究中的应用 [J], 徐庆贤;官雪芳;林碧芬;林斌;钱蕾2.PCR-DGGE与Biolog技术在土壤微生物多样性研究中的比较 [J], 邢华铭;杜海涛;张黎黎;程景3.PCR-DGGE 技术在哺乳动物胃肠道微生物多样性及菌群结构研究中的应用 [J], 葛铮;赵晗旭;高云航;马红霞;张福君4.PCR-DGGE技术在生殖道内微生物研究中的应用 [J], 刘勋;王军;贺明;易金云;刘畅;吕文发5.PCR-DGGE技术在城镇供排水系统微生物多样性研究中的应用 [J], 贾淑宇;张克峰;逯南南;王明泉;赵清华;孙韶华;贾瑞宝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用

・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第12期DGGE 技术在环境微生物多样性研究中的应用张珍妮1,2　吴晓芙1　陈永华1,2　石卉1(1中南林业科技大学环境科学与工程研究所,长沙410004;2中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙410004) 摘　要:　微生物是污水净化的主要作用者之一。

采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electr ophresis,DGGE )方法培育和鉴定土壤微生物具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境科学和污染防治研究领域。

综述了基于PCR 2DGGE 技术的基本原理、关键环节及其在微生物多样性研究中的应用,同时就其自身存在的不足进行了评价并提出了解决方案。

关键词:　PCR 2DGGE 微生物　多样性Appli cati on i n Research on M i crobi a l D i versityof Envi ronment by DGGE Techn i queZhang Zhenni 1,2　W u Xiaofu 1　Chen Yonghua 1,2　Shi Hui1(1Institute of Environm ent Science and Engineering,Central South U niversity of Forestry and Technology,Changsha 410004;2Institute ofB iology Environm ent Science and Technology,Central South U niversity of Forestry and Technology,Changsha 410004) Abs trac t:　M icr oorganis m p lays an i m portant r ole in waste water treat m ent 1Accounted f or by its high levels of reliability and rep r o 2ducibility as well as its convenience in operati on,the denaturing gradient gel electr ophoresis (DGGE )has been widely used f or cultiva 2ti on and identificati on of m icr obial communities in the fields of envir on mental sciences with focus on polluti on contr ol 1The p rinci p le of the DGGE technique and the concerned key fact ors in its app licati on f or analysis of m icr obial communities were described in this pa 2per 1I n comparis on,the potential app licati on areas of the DGGE technique and its li m itati ons were als o discussed 1Key wo rd s:　PCR 2DGGE M icr oorganis m D iversity收稿日期:2009207220基金项目:国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX072122001),国家科技部国际合作项目(20072DF A91420),湖南省博士后基金(2008RS4027),中南林业科技大学校青年基金重点项目(2008001A ),中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所开放基金,湖南省环境科学学科建设项目(2006180)作者简介:张珍妮(19852),女,在读硕士,研究方向:环境生物学;E 2mail:zhangzhenni_2003@1631com 通讯作者:吴晓芙(19532),男,教授,研究方向:水土污染控制;E 2mail:wuxiaofu530911@vi p 11631com环境中微生物的种类和数量是及其丰富的,微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量,它们在污染物的吸附和降解起着核心作用[1,2]。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用

:i 7 8 8 9 e r s s ! i p g h i c ec "f j e g h d v i e uu v g f i j e h u j ! j ! j p h v c s w c v j # i #6 ki p v c $ i g ! j p c ! c u x
; 3 ! ! ! ! [ m% y4 D z Q I 3& < = 0 1 <>0 1 ?@ A = B ? 3C D = D ?EFD G G3A < H H < IJK D 1 1 D G D = 5
<, .h 7 ,v * m v h g m p k t f g k t o xz q p l p g h m p k tk l u f t f jf t g k o p t um n f6 ,v | ~!.6 | ~! k vl i t g m p k t h q t i g q f p gh g p of
V ~ 由于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移 } _X .% 解链行为的不同导致一个凝
该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓 _ 胶带图案 3 X + + ( 使用所有生物中保守的基因片段如细菌中的; L # -= n .% 基因片段和真菌中的 ; -= n .% 基因片段 _ 然而同其他分子生物学方法一样3 其中之一是只能分离较小的片段3 使用于系统发 X + + (也有缺陷 3 育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制 _在某些情况下 3 由于所用基因的多拷贝导致一个种类多于一条带 3 因此不易鉴定群落结构到种的水平 _ 此外 3 该技术具有内在的如单一细菌种类 ; L -= X .% 拷贝可导致自然群落中微生物数量的过多估计 _ 之间的异质性问题 3 不过为了减少 X 建议研究者结 X + + (是分析微生物群落的一种有力的工具 _ + + (和其它技术的缺陷 3 合X + + (和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微生物的群落结构和功能 _ 关键词 W M微生物生态学 MY M= X + + ( & n n .%

PCR_DGGE技术及其在微生物生态学中的应用

PCR -DGGE 技术及其在微生物生态学中的应用张宝涛1,王立群13,伍宁丰2,石鹏君3(1.东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030;2.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;3.中国农业科学院饲料研究所,北京100081)摘要:现代分子生物学技术PCR -DGGE 是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究生态系统中微生物多样性和群落动态性。

本文简要介绍了PCR -DGGE 技术原理及其在微生物生态学领域的应用,并对该技术的局限性进行了评价。

关键词:PCR -DGGE ,微生物生态学,现代分子生物学技术,微生物多样性,微生物群落动态性中图分类号:Q93811 文献标识码:A 文章编号:1672-5565(2006)-03-132-04收稿日期:2005-10-24;修回日期:2005-10-29作者简介:张宝涛(1980-),男,山东人,硕士研究生,主要从事环境微生物和应用微生物的研究.E -mail :jonbob @ 3通讯作者:王立群,男,黑龙江省人,教授,主要从事应用微生物学研究。

E -mail :W angliqun2@Application of PCR -D GGE in microbial ecologyZH ANG Bao -tao 1,W ANGLi -qun13,W U Ning -feng 2,SHI Peng -jun3(1.College o f life science ,Northeast Agricultural univer sity ,Harbin 150030China ;2.Biotechnology Research Institute Chinese Academy o f agricultural Sciences.Beijing 100081China ;3.Feed Research Institute ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China )Abstract :As a m odern m olecular technology ,PCR -DGGE is a power ful tool for the analysis of microbial communities ,which can be used to study the diversity and dynamics of microbial communities.The principle and the application of PCR -DGGE in microbial ecology is briefly in 2troduced ,while the limitations of this technique are evaluated in this paper.K ey Words :PCR -DGGE ;microbial ecology ;m odern m olecular technology 在微生物生态研究中,准确地分析测定微生物群体的类型和数量是非常重要的,因为微生物个体微小,结构简单,缺乏明显的外部特征,且难以依据生理生化特征进行分类鉴定。

PCR-DGGE技术在环境微生物研究中的应用

PCR-DGGE技术在环境微生物研究中的应用摘要：PCR-DGGE技术目前已被广泛应用于环境微生物领域。

介绍了PCR-DGGE技术的原理及其优点，概述了PCR-DGGE技术在环境工程废水微生物处理中的应用，分析了PCR-DGGE技术用于生物处理系统中微生物群落多样性和动态性研究的现状，并展望了其应用前景。

关键词：PCR-DGGE技术；微生物；应用变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是目前研究微生物群落结构主要分子生物学方法之一[1]。

该技术系由Fischer和Lerman于1979年最先提出一种用于检测DNA突变电泳技术，该技术使传统琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分辨精确度提高至一个核苷酸残基差异水平。

Muyzer等在1993年首次将DGGE电泳检测技术应用于微生物群落结构研究，并指出该技术在揭示自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显优势。

DGGE技术能快速、准确鉴定自然环境或人工环境中微生物种群，并能揭示复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位和表达调控的评价分析，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域。

1 PCR-DGGE技术原理DGGE技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对DNA进行电泳，该凝胶电泳时能够有区别地解链PCR扩增产物。

在进行变性梯度凝胶电泳时，长度相同而在碱基序列上存在差异的DNA双链的解链需要不同的变性剂浓度。

序列不同的DNA片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。

起初双链DNA以现状向正极移动，随着变性剂浓度的增加，DNA中具有低G+C含量的序列的部分被打开，而高G+C含量的部分仍保持双链。

DNA双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环节（即DNA部分熔化）。

其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降，以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。

PCR―DGGE法在水体微生物多样性研究中的应用

PCR―DGGE法在水体微生物多样性研究中的应用PCR-DGGE法（Polymerase Chain Reaction-Denaturing GradientGel Electrophoresis）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于微生物多样性研究中。

该方法结合了PCR和DGGE两种技术，能够高效地研究水体中微生物的多样性。

在水体环境中，微生物多样性的研究对于了解水体生态系统的结构、功能和风险评估具有重要意义。

传统的经营学方法主要依靠培养方法，存在着无法培养、无法鉴定、样本处理繁琐等问题。

而PCR-DGGE法能够通过直接分析环境中的微生物DNA来研究微生物多样性，具有不依赖培养方法、快速高效、准确性强等优点，成为研究水体微生物多样性的重要工具。

PCR-DGGE法的基本思路是通过PCR扩增目标基因片段，然后将扩增产物在含有梯度浓度的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。

梯度浓度可以是通过改变聚丙烯酰胺中脱氧核糖核酸（DNA）链脱离温度（解聚形成的PCR产物）或通过改变变性剂（封闭螺旋形成缺失DNA链）而形成的。

由于序列不同的DNA分子在不同的电泳条件下迁移速度不同，所以可以通过分析DGGE图谱来了解样品中微生物群落的组成和多样性。

PCR-DGGE法广泛应用于水体微生物多样性研究中。

一方面，该方法能够直接检测水体中的微生物DNA，避免了无法培养的问题，使研究更加准确和全面。

另一方面，PCR-DGGE法具有高通量分析能力，可以同时研究多个样品，提高研究效率。

此外，PCR-DGGE法还可以通过改变PCR反应中的引物和扩增条件，选择不同的目标基因片段，从而研究不同层次的微生物多样性，如细菌、真菌等。

在具体应用中，PCR-DGGE法可以用于研究水体中微生物群落的空间和时间分布。

通过采集不同地点或不同时期的水样，提取DNA并进行PCR-DGGE分析，可以了解不同环境条件下微生物多样性的差异。

例如，可以研究不同水深、不同温度、不同盐度等因素对微生物群落结构的影响。

DGGE_TGGE技术在微生物生态学中的应用

D GGE TGGE技术在微生物生态学中的应用陈静,马松成,毛华明(云南农业大学动物营养与饲料科学重点实验室,昆明　650201)摘要:变性梯度凝胶电泳(deaturing gradient gel electropho resis,D GGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electropho resis,T GGE)可以直接分离PCR扩增片段,作为一种分子指纹技术而逐渐被人们应用于微生态研究中。

通过D GGE T GGE对微生物组成的遗传特性进行表征,不但省去了菌种分离耗时耗力的工作量,更可鉴定出根据传统方法无法分离出来的菌种。

作者重点描述了D GGE T GGE的基本原理以及在胃肠道微生态研究中的应用。

关键词:变性梯度凝胶电泳;温度梯度凝胶电泳;胃肠道微生态;多样性中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:167127236(2006)1120047203 在分子生物学技术出现之前,人们对微生物的认识大多数是靠纯培养,或靠直接形态观察来获得部分信息。

动物胃肠道是一个复杂的生态环境,特别是反刍动物的瘤胃需要严格的厌氧环境,过去对瘤胃微生物的研究主要是一些经典的方法如亨氏滚管法(H ungate,1969)和最大可能计数法(D eho rity 等,1989)。

因为微生物形态简单,缺乏明显的外部特征,所以胃肠道中的大多数微生物由于难于模拟其生长繁殖的真实条件而不能获得纯培养。

能培养的微生物只是天然微生物中的一小部分,因此胃肠道中微生物的多样性被严重低估。

为了更好的了解胃肠道微生物多样性及其在调控发酵中的作用,需要其他的补充技术,应用分子生物技术为研究肠道微生态提供了简便而快捷的方法。

1　D GGE TGGE的基本原理变性梯度凝胶电泳(deatu ring gradien t gel electrop ho resis,D GGE)技术是由F ischer和L er m an 于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。

DGGE技术及其在微生物研究中的应用

变性梯度凝胶电泳--DGGE摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术具有精确、快速、易操作等特点, 能克服传统微生物研究方法的不足，作为一种分析微生物群落的有效工具被广泛的应用于现代微生物研究。

本文介绍了DGGE技术的原理、操作步骤及应用情况，并讨论了其缺点及应用前景。

关键词：DGGE 分子生物学微生物群落菌群分析1 引言变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是由Fischer 和Lerman[1]于1979 年首先提出了, 并将其用于医学上基因点突变的检测。

与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比, 这项技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。

1985年, Myers RM[2]等人首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术, 使该技术日臻完善。

1993年，Muyzers[3]等人首先将PCR技术与DGGE结合，在微生物生态学领域首次采用PCR-DGGE方法分析检验rRNA的基因,证实了该技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性。

此后的十几年内DGGE技术在研究微生物多样性和种群差异上已成为一种重要工具, 并被广泛用于活性污泥、池塘底泥、污染土壤、海洋、冰川等环境样品以及食品、动物肠道中的微生物多样性检测和种群演替的研究。

2 基本原理PCR-DGGE技术主要是先利用特定的引物合成一定长度的rRNA的基因序列，然后利用梯度变性胶来分离DNA片段。

梯度变性胶是在一定的浓度聚丙烯酰胺凝胶中添加不同浓度的变性剂，使变性剂形成由低到高的线性梯度。

电泳时，DNA在胶中的迁移速率仅与其分子大小有关，当DNA到达具有一定浓度变性剂时，DNA双链开始解链，迁移速率开始降低。

当DNA双链完全分开时，其电泳速率急速下降。

由于不同的DNA片段碱基组成存在差异，其变性条件也有所不同，在凝胶上会停留在不同的位置，经染色后形成不同条带。

DGGE技术在土壤微生物群落研究中的应用

黑龙江农业科学2010(7):5~8Heilong jiang Ag ricultural Sciences生物技术DGGE 技术在土壤微生物群落研究中的应用宋洋,李柱刚(黑龙江省农业科学院生物技术研究所/黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室,黑龙江哈尔滨150086)摘要:现代分子生物学的变性梯度凝胶电泳(Denatur ing G radient Gel Electr qphoresis,DGG E)技术是土壤微生物群落研究的有效工具,它直接分离土壤微生物的DN A 片段,比传统的培养方法更具明显的优势,已成为研究土壤微生物的重要手段之一。

对DG GE 技术的原理及其在土壤微生物群落研究中的应用情况、优点和局限性进行了介绍。

关键词:DG GE;土壤微生物;群落结构中图分类号:Q 938 1+5 文献标识码:A 文章编号:1002 2767(2010)07 0005 04收稿日期:2010 03 22基金项目:黑龙江省科技厅国际合作重点资助项目(WB 07A10)第一作者简介:宋洋(1981 ),女,黑龙江省哈尔滨市人,硕士,研究实习员,主要从事微生物菌群分析和分子育种研究。

E mail:achievement81@yahoo com cn 。

通讯作者:李柱刚(1972 ),男,黑龙江省庆安县人,博士,研究员,从事植物分子育种研究。

E mai l:lizhugang@163 com 。

土壤中微生物群落结构对农业的健康、持续发展具有重要作用。

它们积极参与土壤物质转化过程,在土壤形成、肥力演变、植物养分有效化和土壤结构形成与改良、有毒物质纯化及净化方面起着重要作用[1]。

由于土壤微生物的重要性,有关土壤微生物的群落结构及多样性研究受到广泛重视[2]。

但研究结果表明,土壤微生物中可用常规方法分离培养的微生物只占0 1%~1 0%[3]。

因此,传统的微生物培养及鉴定方法不足以反映土壤环境中微生物的真实情况,需要现代分子生物学技术进行补充,如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、单链构象多态性分析(SSCP)等技术,这些技术可以根据微生物的DNA 序列遗传多态性,揭示出其群落结构及其多态性。

利用PCR_DGGE技术对自然堆肥微生物群落多样性的分析

收稿日期：2009-03-11 基金项目：中国科学院知识创新工程重大项目（KSCX1-YW-09-09-03）；黑龙江省博士后基金（LBH-Z07226）；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目（2008RFQXN022）；哈尔滨市科技攻关计划项目（2007AA6CN105）；东北农业大学创新团队发展计划项目（CXT003-2-1）；东北农业大学科学研究基金作者简介：刘佳（1983-），女，黑龙江人，硕士，研究方向为农业微生物。 * 通讯作者：许修宏，教授，博士生导师，研究方向为食用菌、微生物肥料、微生物除草剂。E-mail: howard2857@hotmail. com
堆肥时间（d） Composting time
图 1 堆肥温度的变化
Fig. 1 Change of compost temperature
有拖尾现象，说明片段中还有大量的杂质，例如腐殖酸类物质。为了不影响后续的 PCR 反应，需要对粗提 DNA 进行纯化。本试验采用 OMEGA 凝胶回收试剂盒对基因组 DNA 进行纯化。纯化后的基因组 DNA 杂质明显减少，可以用于后续的 PCR 扩增的模板。以纯化后基因组 DNA 作为模板进行 PCR 扩增，获得长度约为 240 bp 的特异性片段。 2.3.2 堆肥细菌基因组 DNA 16S rDNA V3 区 DGGE 分析
PCR 反应体系： 2.5 μL 10 ×PCR buffer， 2.5 μL dNTP，引物各 0.5 μL，模板 0.5 μL， 1 μL DNA 聚合酶，补灭菌水至 25 μL。
PCR 反应条件：94 ℃预变性 3 min，然后 94 ℃ 变性 1 min，55 ℃退火 1min，72 ℃延伸 45 s，最后 72 ℃保温 10 min，35 个循环。

DGGE和T—RFLP在堆肥微生物群落结构研究中的应用

２１ＤＧ．ＧＥ的原理和应用
２１１原理方法．．
ｔｏｕＡ．ｔｉ，１ｆｒｄｓＣ．ｌｅｔｕ和．ｉｒｍ，ｏｔＣ．ｅｉ，１ｆｉｎｓｍｖｉｓｖｕｉｍｏ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ＤＧ（ＧＥ变性梯度凝胶电泳法）是在普通凝胶电，泳基础上发展起来的ＤＡ分离技术：ＮＮＤＡ分子在解链温度下发生变性，双螺旋结构部分融解，双链变为单链，碱基暴露出来，们与变性剂（素）４种它尿产生不同的相互作用。凝胶中变性剂呈梯度分布，则变性ＤＡ分子在凝胶中由于变性剂的存在，Ｎ移动速度发生变化，最终停止在特定的位置，成分形
ｏｉｒｂｎｃｍｐｓｉｇｐｏｅｓｆｍｃｏｅｉｏｏｔｒｃｓｎ
于改善环境、效利用生物资源具有重要意义。堆有
１１细菌．
在好氧堆肥过程中，细菌凭借强大的比
肥就是利用自然界中广泛存在的微生物，在人工控制的条件下，将可生物降解的有机物转化为肥料的
＊通讯作者：王立群（９６一）男，１５，教授，主要研究方向：应用微生物学，Ｅ—ｍｉｗｎｌｕｄ＠１３ｃｉ。ａ：ａｇｉｒ６．ｏｌｑｎ
维普资讯
３２
生物信息学
第５卷
２堆肥微生物群落结构分析
收稿日：０ —１ — ３修回日：０ — ６２期２５２２；０期２６０—４０

利用PCR-DGGE技术对自然堆肥微生物群落多样性的分析

利用PCR-DGGE技术对自然堆肥微生物群落多样性的分析刘佳;许修宏;李洪涛
【期刊名称】《东北农业大学学报》
【年(卷),期】2009(040)009
【摘要】以牛粪和稻草为堆肥原料,对自然堆肥过程进行传统培养法和PCR-DGGE 技术的分析,研究了自然堆肥微生物菌群在堆肥不同时期的多态性变化.结果表明,自然堆肥微生物数量呈升高-降低-升高-降低的趋势变化,在堆肥的升温期微生物数量明显增多、高温期有所下降、降温期再次增加.通过DGGE分子生态学手段研究表明,在堆肥的升温期种群的多样性指数也大大的增加、高温期减少、降温期再次增加,与传统培养法成相似的变化规律.
【总页数】4页(P35-38)
【作者】刘佳;许修宏;李洪涛
【作者单位】东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨,150030;东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨,150030;东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨,150030
【正文语种】中文
【中图分类】S141.4;S154.3
【相关文献】
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严莲荷;周申范;张建法
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PCR_DGGE技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施

３造成ＤＧＧＥ结果偏差的因素及其解决措施
理论上，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等适当，ＤＧＧＥ技术便可区分一个碱基差异的ＤＮＡ片段［１５］。但是在ＤＧＧＥ实际操作中通常包括：样品的预处理、样品总ＤＮＡ的提取、样品靶基因（如１６ＳｒＤＮＡ基因片段）的ＰＣＲ扩增、扩增产物的ＤＧＧＥ分析等步骤，每一环节的操作均有可能造成分析结果的偏差，以致最终导致分析结果的不准确。造成结果偏差的因素可以归纳为以下几个方面。３．１环境样品中总ＤＮＡ提取
ＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆＬｉｍｉｔａｔｉｏｎａｎｄＩｍｐｒｏｖｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰＣＲ－ＤＧＧＥｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌＤｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｕｄｙ
ＭＡＪｕｎ－ｘｉａｏ，ＪＩＭｉｎｇ－ｊｉｅ，ＫＯＮＧＪｉａｎ＊（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒｏｔｏｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ２５０１００，Ｃｈｉｎａ）
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术是建立在环境样品的总遗传信息分析的基础上，因此ＤＮＡ提取质量的好坏，直接影响着后续分子实验操作。然而对于复杂环境样品ＤＮＡ提取通常需要经过样品预处理、细胞裂解、ＤＮＡ沉淀等环节，以上过程易造成菌种数量的改变和ＤＮＡ含量的变化，由此引起分析偏差［１６］。
变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术已经发展成为研究微生物群落组成及亲缘关系的主要分子工具之一［３－４］，它不依赖于培养过程，大大缩短了样品的分析时间，而且还能显示环境样品中不可培养的微生物的遗传信息，因此，ＤＧＧＥ技术在微生物多样性研究中发挥了重要作用。但是ＤＧＧＥ技术的应用存在一定的局限性，有时造成检测结果的偏差。本文简述ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术的原理及其在微生物生态学中的应用，重点对ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在复杂样品的微生物群落分析中造成结果偏差的原因进行归纳和讨论，并提出相应的解决方法，以便对以后的ＤＧＧＥ结