植物表达载体构建
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而
真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段
（4）P/E 启动子/增强子
（5）Terms 终止信号
（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目
的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选
质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：
（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载
表达载体的构建
关于表达载体的构建
1.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类
载体既有复制子，更要有强启动子；
2.大肠杆菌中的表达载体应含有
（1）强启动子
（2）在启动子下游区和A TG上游区有一个好的SD序列。
（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。
我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。
3.载体构建的步骤
（1）.设计引物
1.引物的长度用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。
2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR
反应失败。
3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)
4. 引物的GC含量引物中GC含量应占到45％一60％左右。在引物设计时应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3，端不应有互补结构。引物3，端应与目的片段完全配匹，而其5’端碱基可不与模板配匹，故在引物设计时可在其5，端加上限制酶位点或其他短的序列，这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循环中将被带到双链DNA中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因的两侧又有了新的限制酶位点，用相应
如何构建载体
如何构建载体
1 启动子的选用和改造
外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。
在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法
摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法
基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法
摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法
基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，
植物表达载体构建
（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆 载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因； 表达载体是适于在受体细胞中表达外源基 因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而 能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多 数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序 列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动 子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且 无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子， 其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合 基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组 织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基 因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用 于各种不同的转化目的。
目前采用的主要有两种载体系统：一元载体系统 和双元载体系统。
（四）植物基因转化载体系统的构建： 1．一元载体系统的构建： 这类载体是中间表达载体与改造后的受体 Ti质粒之间， 通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为共 整合载体（co-integrated vector，cis），由于该载体的TDNA 区与 Ti 质粒 Vir 区连锁，因此又称为顺式载体（ cisvector）。 一元载体的特点是：①由两个质粒（ E.Coli 质粒和 Ti 质粒）重组而成，分子量较大；②共整合体的形成频 率与两个质粒的重组频率有关，相对较低；③必须用 Southern 杂交或 PCR 对大的共整合体质粒进行检测；④ 构建时比较困难。 一元载体系统目前主要有两种：共整合载体和拼接末 端载体（split-end vector，SEV）。
表达载体构建
表达载体构建
1. 背景介绍
表达载体是在分子生物学领域中广泛使用的工具，用于将目标基因导入宿主细胞中并使其表达。构建高效的表达载体对于基因功能研究和基因工程应用具有重要意义。本文将介绍表达载体的构建方法及其在基因表达中的应用。
2. 表达载体的构建方法
构建表达载体的一般步骤包括选择合适的载体骨架、选择适当的启动子和终止子、插入目标基因序列以及进行转染或转化等操作。下面将详细介绍表达载体的构建方法。
2.1 选择合适的载体骨架
常用的载体骨架包括质粒和病毒载体。质粒是可以在细菌中复制的DNA分子，通常由起始位点、选择标记和多个限制酶切位点组成。病毒载体包括腺病毒、慢病毒等，具有高效转染特性。选择适合自己研究的载体骨架是表达载体构建的第一步。
2.2 选择适当的启动子和终止子
启动子是基因表达的起始信号，终止子是基因表达的终止
信号。启动子的选择应根据目标基因的表达需求和宿主细胞的特性进行。常用的启动子包括强启动子（如CMV启动子）、组织特异性启动子等。终止子则可以选择常规的转录终止信号。
2.3 插入目标基因序列
选择合适的酶切位点，在载体DNA上进行限制性内切酶切割，并将目标基因序列与载体连接。连接的方法可以是经典的限制性酶切连接、PCR扩增连接、Ligase连接等。连接完成后，应进行酶切鉴定和测序验证，确保目标基因序列插入准确。
2.4 进行转染或转化
将构建好的表达载体导入宿主细胞中，实现基因表达。转
染方法包括化学转染、电穿孔转染、病毒介导转染等，转化方法包括细菌的电转化、植物的农杆菌介导转化等。
3. 表达载体的应用
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
1.一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段
（4） P/E 启动子/增强子
（5）Terms 终止信号
（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
2.载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
3.选用质粒（最常用）做载体的5点要求：
（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
植物表达载体构建
（六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也与 T-DNA 的转移有关，并已经了解它们编码的蛋白质的功能。 ChrA、ChrB和ChrC均参与细菌的附着功能。还有一些 基因（ Cel 、 Att 、 ivr 、 PscA 和 ExoC 等）在 T-DNA 转移 中起重要作用，这些基因的突变将使细菌表面成分发生 变化，从而丧失与植物细胞识别和结合的的能力。此外， ChrD 位点影响 AS 对毒性区的诱导效率和农杆菌的致瘤 能力。这是因为ChrD可能编码一种细菌ATP结合蛋白， 在低 pH 值和磷酸饥饿的情况下可诱导 VirG 的表达。 ChrE位点编码一个单糖结合蛋白，与单糖影响 Vir区的 表达有关。Ros基因与Vir基因的负调节有关。可见，目 前已知农杆菌染色体上游 10个基因与T-DNA的转移有关。
第五节
植物基因工程载体
在植物基因转化研究中已建立了多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因 枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介 导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。 载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。
一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
实验十五、、表达载体的构建
04
03
实验材料与方法
实验材料
表达载体
质粒或病毒载体，用于在宿主 细胞中表达目的基因。
T4 DNA连接酶
用于连接DNA片段和载体，形 成重组DNA分子。
DNA片段
用于插入表达载体中的目的基 因。
限制性内切酶
用于切割DNA片段和载体，以 便将目的基因插入载体中。
04
实验结果与分析
实验结果
成功构建了表达载体pET-32a（+）
通过PCR和酶切鉴定，证实了目的基因已经成功连接到表达载体上。
表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）
将构建好的表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经过抗生素筛选和菌落PCR鉴定，确认转化成功。
目的蛋白的表达
在诱导剂IPTG的作用下，成功诱导了目的蛋白的表达，通过Western blot检测，证实了目的蛋白的表 达。
结果讨论
在本实验中，成功构建了表达载体pET-32a（+），并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，诱导了目的蛋白 的表达。这些结果表明实验操作正确、方法可靠、步骤合理、转化效率较高，达到了预期目标。
在实验过程中，需要注意实验操作的规范性和准确性，保证实验结果的可靠性和重复性。同时，需要 不断优化实验条件和方法，提高转化效率和蛋白表达水平，为后续的功能验证和应用奠定更加坚实的 基础。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而
真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段
（4） P/E 启动子/增强子
（5）Terms 终止信号
（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目
的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达
真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：
（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载
植物转基因技术原理及要点
6.炼苗
7.转基因苗的筛选与鉴定
培养过程中利用标记基因筛选
抗生素类选择基因 抗除草剂类选择基因
生物安全性标记类选择基因 ……
选择标记基因(Slective gene)
标记基因
报告基因(Report gene)
β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus) 荧光素酶基因(Luc) 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 绿色荧光蛋白基因(Gfp) ……
转基因方法 转化的优点
转化的缺点
DNA间接转化法
农杆菌介导基因 转移
受体种类，可以在原生质体、 转化双子叶植物为主。大
蛋细胞和细胞团、组织器官 多数单子叶植物和裸子植
或整株等多级水平上进行， 物对农杆菌的侵入不敏感，
方法成熟可靠，简便易行， 限制了该法在禾谷类作物
周期短，转化率高；
中的应用。
转化体常出现“嵌合”现 象，需在严格条件下加以 选择以淘汰未转化细胞
例 Gus检测
原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因 （Gus），催化β－葡萄糖苷酯类 物质水解。其中很多水解产物具有 发色团或形成荧光物质。 例：组织化学法测定Gus活性 作用底物为X-gluc,产物是一种不 可溶的5,5-二溴，4,4-二氯靛蓝；
转基因植物的PCR检测
外源基因整合的PCR-Southern 杂交检测 外源基因拷贝的IPCR检测 外源基因表达的RT-PCR
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特点：表达具持续性；tRNA和蛋白质表达量 相对恒定；它们不表现时空特异性；不受外界 因素的诱导；从结构上看，大多数组成型启动 子转录起始位点上游几百个核苷酸处，存在有 六聚体花纹（hexamer motifs)序列TGACTG。
Pattern of atao1 activity visualised by GUS expression following infection with either H. schachtii or M. incognita.
Left The atao1 promoter drives GUS expression at the boundary of the symcytium of H. schachtii (n). Right In a gall induced by M. incognita (n) the disrupted vasculature shows strong expression of GUS driven by atao1 (gc, giant
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
Figure 1 a) Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. b) In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activity
在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物 质。 初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物， 后经氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯 靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现 蓝色。 注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶 能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色 程度不能准确反映Gus活性，
大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位 点—克隆位点—转录终止信号
启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7 噬菌体启动子
核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始 密码子(ATG)和SD序列
转录终止序列
在植物表达载体
Ti质粒的结构：
启动子
35S, Nos, others
蛋白质定位：GFP融合蛋白， GUS 融合蛋白 基因表达：启动子-GUS（蛋白）, 启 动子-GFP（蛋白）。
启动子的种类
组成型启动子 诱导型启动子 组织特异型启动子 在某些情况下，一种类型的启动子往往兼
有其它类型启动子的特性
Constitutive promoter
---冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不 大；
----Ti质粒长约200-800kb,过于庞大； ----Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。
双元载体
不带有vir基因，但带有大肠杆菌及土 壤农杆菌的复制起始位点。所有基因 操作可以在大肠杆菌中完成，之后转 入一种经修饰后的Ti质粒农杆菌中， 该Ti质粒包含一整套vir,但缺失T-DNA 序列而无法转移，这样可提供仅vir基 因产物帮助双元载体转移。
侵染植物的土壤农杆菌中带有Ti质粒，侵染植 物后会产生冠瘿瘤。Ti质粒上有一段transferDNA,长为12-24kb，能转移并整合到植物基因 组中。
细胞分裂 素基因
左边界
生长素基因
冠瘿碱合 成基因
右边界(25bp)
Vir gene
冠瘿碱代谢基因 复制起始位点
Vir基因产物可诱导Ti质粒产生T-DNA 区域的单链线性拷贝，在其他如VIR D2,VIR D4, VIR B等蛋白的协助下，穿 越农杆菌及植物细胞的细胞壁、膜等， 最后整合到染色体中。
GUS酶的显色反应以底物不同而不同： 5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 靛蓝 5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 橘红 4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide 荧光产物
If you have the Chyou may follow the links to see GFP in action!
Last updated (c) 1997 RWZELLER
B-glucuronidase(GUS)
GUS酶的底物是无色的X-葡萄糖苷酸（Xglucuronide, X-gluc)
共整合载体
已很少用。外源基因首先克隆到一 个克隆载体上，该载体含有一段与 缺失T-DNA的Ti质粒有同源序列。 当该载体进入土壤农杆菌后，与Ti 质粒整合，然后由Ti质粒提供TDNA向植物细胞转移的vir基因产物。
病毒衍生载体
比较小，易侵染植物并大量扩 增，可大量表达蛋白，但一般 难于整合到植物基因组中。
-75处 TGACGT核苷酸的重复的花纹结构对启 动子表达能力有作用，如果其突变，将引起核 因子与其结合力下降，导致启动子表达能力减 弱。
CaMV35S启动子加上来自AMV的一段44bp的 引导序列，可使其表达强度增加5倍（44bp序 列是翻译增强序列）。
将加倍的CaMV35S启动子与AMV引导序列结 合构成一个复合串联启动子，比未修饰的启动 子表达增强20倍。
35S可以划分为两个区域： A区：-90~+8 主要负责在胚根、胚乳的根及根组织内表
达； B区：-343~-90 主要控制胚的子叶及成熟植株的叶组织
及维管组织内表达。B区内的增强子序列可以提高表达 水平，如果35S启动子中存在两个B区将能使35S启动 子的活性提高10倍， 并对异源启动子也有作用。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用 来判断外源基因是否已经成功地导入寄 主细胞（器官或组织）并检测其表达活 性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内 源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而 且还应具有快速、灵敏、定量和可重复 的检测特性。
fluorescent images of a GFP-transformed Arabidopsis root, viewed under fluorescent conditions. green box = mean green level inside the syncytium; blue box = mean green level outside the syncytium.
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@163.com
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
载体
表达载体(expressing vector)
特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序 列
这两个基因均由核基因编码，并在胞浆 内合成含有信号肽的前体蛋白，最终输 入到叶绿体发挥生物学功能。
热诱导启动子
当植物暴露在高温下（通常35以上）或称热休 克时，植物就会在1-3小时内暂时合成一些蛋白 质或增大特异蛋白质的合成量，这些诱导下合 成的蛋白质成为热休克蛋白。
热激基因的结构分析：这些基因的5 '端有一段 保守的热激共有序列，也称为热休克因子序列 （HSE）。其含有热诱导基因表达的调控序列。
番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶 基因(polygalacturnase)启动子
花粉特异表达基因启动子（lat 52）
木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)启 动子
Inducible promoter
在某些特定的物理或化学信号的刺激下， 此种类型的启动子可以大幅度地提高基 因的转录水平，因此，称为诱导型调节 序列。
Tissue specific promoter
在这些启动子调控下，基因的表达只发 生在某些特定的器官或组织部位，并通 常表现出发育调节的特性。
这种特异性通常以特定的组织细胞结构 和化学物理信号为存在基础。与诱导型 启动子有一定的共同点。
马铃薯块茎特异蛋白基因启动子
小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基 因（ADPG-lucose pyrphosphorylase)启动子
它们以重复形式出现并被6-8个核苷酸隔开，缺失 及点突变分析表明六聚体花纹的存在对维持启 动子的转录活性是必要的。
CaMV 35S启动子
来自花椰菜花叶病毒，由于启动整个CaMV基因组的一 小段重叠序列转录产物的沉降系数为35S，故将编码该 转录产物的启动子称之为35S启动子。
该启动子包括TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增 强子核心序列（GTGG/TTTG）。
报告基因
1、绿色荧光蛋白基因 （GFP green fluorescence protein ） 2、B-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因b-D-
glucuronidase ） 3、荧光素酶基因（LUC fire fly
luciferase ） 4、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因） 5、抗生素基因
Transgenic Arabidopsis stained for GUS activity showing promoter activity of
A) the constitutive promoter CaMV35S and B) B) the PsMTA promoter from pea
T-DNA的左右边界各有25bp的重复序 列，但右边界对T-DNA的整合更为重 要。有一些早期的植物转化载体并不 含有左边界。
T-DNA区域的大部分基因只有在TDNA插入到植物基因组后才表达，表 达产物与冠瘿瘤的形成有关。
Ti质粒作为转基因载体的缺陷： ---转化后会产生植物激素，阻碍转化细 胞的再生；
Jellyfish Aequorea victoria: one of the oldest species on the earth
Green Fluorescent Protein (GFP)
This is a stereo view of GFP generated from the Brookhaven Database using R
Baidu Nhomakorabea 共同特点
启动子的活化受到物理或化学信号的诱导； 启动子的分子结构都具有增强子、沉默子或类
似功能的序列结构； 感受特异性诱导的序列都有明显的专一性； 一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表
达的特点； 该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导
表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创 伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达启动子 和共生细菌诱导表达基因启动子。
三种类型
A型：可以被植物体内合成的某些产物包 括ABA、生长素、赤霉素以及创伤诱发 产生的系统素所诱导；
B型：在高温、低温、水淹以及土壤中高 浓度的盐以及重金属离子等环境因子的 作用下可被诱导；
C型：一类能够对人工合成的化学诱导物， 诸如四环素、地塞米松等作出反应。
光诱导启动子
核酮糖二磷酸羧化酶小亚基（SSrbc)基因 和光扑获复合物a/b结合蛋白（light harvesting complex protein a/b, LHCP a/b) 基因。