细胞生物学实验三 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数(山东大学)
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
【实验目的】
1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；
2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；
3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；
4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；
【实验原理】
1.细胞培养
细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
实验背景：
一、细胞培养的基本条件：
1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素
2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清
3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器
4.细胞保存条件：液氮罐
1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱：
CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液
蒸发。
三、细胞培养用液的配制：
1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水
2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS：NaCl 8.0 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4.H2O 1.56 g
KH2PO4 0.20
加水至1000 ml
3.消化液：
①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是
观察小鼠脾脏实验报告
观察小鼠脾脏实验报告
观察小鼠脾脏的形态和组织结构，了解其基本组织构成和功能。
实验步骤：
1. 实验前准备：
a. 所需实验器材：手套、手术刀、显微镜片等。
b. 所需实验物品：小鼠尸体、解剖盘、理化盐水等。
2. 实验过程：
a. 将小鼠尸体放在解剖盘上，进行外部解剖。观察小鼠的腹部，用手术刀轻轻切开腹部皮肤。
b. 将小鼠的内脏器官暴露出来，找到脾脏。
c. 将脾脏取出，放在显微镜片上，用理化盐水清洗，以去除血液和杂质。
d. 用显微镜观察脾脏的形态和组织结构，并进行描述。
实验结果：
小鼠脾脏是一个椭圆形的器官，位于腹腔的左上前部，与胃相邻。观察到脾脏表面光滑，颜色暗红，呈现出类似叶片的形态。通过显微镜观察，可以看到脾脏由纤维结缔组织包膜包裹，包膜内有纵横交织的网状纤维和平滑肌纤维。
进一步观察脾脏切片，可以发现脾脏内部由红髓和白浆组成。红髓部分是由红色血球聚集而成，呈现出深红色，主要负责产生和贮存红血球。白浆部分呈现出浅
红色，主要负责产生、贮存和分化白血球。
除了红髓和白浆，还可以观察到脾小体。脾小体是脾脏的功能单位，由中央的细动脉和围绕其排列的淋巴组织组成。细动脉在脾小体内分支，形成富集淋巴细胞的血窦，血窦内的小窦构成了纤维结缔组织和巨噬细胞，这些巨噬细胞负责清除衰老或异常的红血球和其他细胞碎片。
实验分析与结论：
通过观察小鼠脾脏的形态和组织结构，可以得出以下结论：
1. 小鼠脾脏是一个椭圆形的器官，位于腹腔的左上前部，与胃相邻。
2. 脾脏具有纤维结缔组织包膜，包膜内有纵横交织的网状纤维和平滑肌纤维。
细胞生物学实验报告 染色体的观察 山东大学汇总
细胞生物学实验报告染色体的观察山东大学汇总实验目的：
通过显微镜观察有丝分裂和减数分裂过程中染色体的形态和数量，加深对细胞学基本
概念和原理的理解。
实验方法：
1.取甲状腺初代培养细胞，按涂片法制作细胞条片，并进行预处理。
2.制备染色质体液和缓冲液，分别将细胞条片进行染色质体染色和酸性酒精差染，形
成酒精-酸性洗涤法。
3.在显微镜下观察细胞的染色体形态：线状、条形、上臂和下臂长度比例等。
4.计数观察初代培养细胞有丝分裂和减数分裂中染色体的数量和变化。
实验结果：
染色体的形态
细胞条片经过染色后，可以清晰地看到线状、条形、上臂和下臂长度比例等染色体的
形态。有的染色体比较短粗，有的比较长细。不同质态的染色体呈不同的形态。
线状染色体：在染色体的间期、早期有丝分裂时，染色质看起来像是一条条的纤维，
这时候我们称之为染色体。尽管我们仅仅看到一个大肥皂泡一样的核，在其里面的染色质
分子却足有数万至数千万个之多。另外一个细胞周期的阶段中，长条状的染色体会从线状
染色体中逐渐分离出来。
条形染色体：当有丝分裂的近中期，染色体开始凝聚成为条形，此时图像中的某些染
色体呈现为条状。染色体的形状是由属于染色体上的遗传物质凝聚在一起的蛋白质所决定的。当染色体在染色质组装过程中被靠拢在一起时，遗传物质之间的相对定位在逐渐调整，同时蛋白质也在调整中不断塑造染色体的形状。
上臂和下臂长度比例：同一个染色体的上臂和下臂在不同细胞种类之间的长度是不尽
相同的。在同一物种中，染色体的上臂和下臂的比例相对稳定。在人类的体细胞中，不同
染色体（不包括两性染色体）的上臂与下臂长度比例均落在1:2.5-2.7之间。另外，在卵
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
【实验目的】
1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；
2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；
3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；
4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；
【实验原理】
1.细胞培养
细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
实验背景：
一、细胞培养的基本条件：
1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素
2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清
3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器
4.细胞保存条件：液氮罐
1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱：
CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液
蒸发。
三、细胞培养用液的配制：
1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水
2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS：NaCl 8.0 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4.H2O 1.56 g
KH2PO4 0.20
加水至1000 ml
3.消化液：
①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是
小鼠脾细胞培养实验
小鼠脾细胞培养实验
Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
山东大学实验报告2011年3月30日姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华
科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号 105
一、实验目的
了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理
(一)细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
(二)细胞死活鉴定
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：
死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
细胞生物学实验课
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细胞生物学实验课
加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打 计数板计数 分瓶培养
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细胞生物学实验课
细胞的消化传代方法
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细胞生物学实验课
生长细胞形态
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细胞生物学实验课
四、作业与思考
1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。 2．细胞培养获得成功的关键要素是什么? 3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。 4．绘制细胞生长曲线图。 5．绘制细胞分裂指数图。
M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无 种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基 础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。 即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I 期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染 色 体 称 提 前 凝 集 的 染 色 体 (Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。
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细胞生物学实验课
植物细胞全能性
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细胞生物学实验课
三、实验材料与器具
高压灭菌锅、普通及精密天平、玻 璃器皿（烧杯、1000、500mL容量 瓶、移液管、试剂瓶、1000、500、 100 mL 三角瓶）、化学试剂。
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细胞生物学实验课
四、实验步骤
1、配制几种母液
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
广州大学
综合设计性实验报告
学院生命科学学院
课程细胞生物学实验
实验项目细胞培养
实验题目小鼠肝细胞的原代培养
专业生物技术
年级、班别生技142 姓名徐嘉宽
学号 30
任课教师陈鲲
细胞培养
——小鼠细胞的原代培养
摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。
关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法
1前言
初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。
2实验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告
引言
原代培养是一种将从组织或器官中分离得到的细胞进行体外培养的方法。它具有重要的科研和临床应用价值。本实验报告将详细介绍细胞原代培养的步骤、影响因素以及常见问题的解决办法，以及对细胞培养实验的观察结果和分析。
材料与方法
1. 实验所用细胞系
我们选择了小鼠胚胎纤维细胞（MEF）作为实验所用细胞系。MEF细胞具有较强的增殖能力和较长的寿命，非常适合原代培养实验。
2. 原代细胞培养基的配制与消毒
配制原代细胞培养基的主要成分有： - DMEM培养基 - 胎牛血清（FBS） - 青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）
配制原始培养基时要进行严格的消毒操作，以防止细菌和真菌的污染。
3. 细胞分离与传代
分离过程
1.取出小鼠胚胎。
2.将小鼠胚胎置于无菌PBS中，去除头部和内脏。
3.将净化后的胚胎置于细胞培养基中。
4.用无菌耐热胶管切成碎片，使其均匀分散。
5.加入细胞培养基中的胞外消化液。
6.重复离心和去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
7.加入预暖的细胞培养基，充分悬浮细胞。
8.继续离心、去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
传代过程
1.收集上述分离得到的细胞悬液。
2.用血细胞计数板计数细胞数目。
3.计算倍增比例，将细胞悬液按比例加入新鲜的细胞培养基中。
4.转移至新的细胞培养瓶中，继续培养。
4. 影响细胞培养的因素
4.1 培养基的质量
培养基中的成分质量直接影响到细胞的生长和增殖能力。优质的培养基会提供细胞所需的营养物质和生长因子。
4.2 培养条件的控制
小鼠脾细胞的分离原理
小鼠脾细胞的分离原理
小鼠脾细胞的分离原理基本上可分为以下几个步骤：
1. 选择性切除脾脏：将小鼠固定在手术台上，进行全麻手术，使用消毒的手术刀仔细切开腹部皮肤，暴露脾脏。根据需要，将脾脏切除并置于冷盐水或试管中。
2. 细胞解聚：将脾脏置于含有细胞解聚酶（例如胰蛋白酶）的消化液中，用温和的消化条件进行消化。消化时间和消化液浓度可根据需要进行调整。
3. 细胞过滤：将消化后的细胞悬液通过细胞过滤器进行过滤，以去除大块组织碎片和残留的不可消化物质。过滤器的孔径大小可根据实验需求选择。
4. 细胞沉降：通过离心将细胞悬液离心沉淀，移除上清液并保留沉淀。沉淀中的细胞主要是小鼠脾脏中的淋巴细胞和其他免疫细胞。
5. 细胞分离：使用细胞分离液（例如离心梯度离心液）对细胞沉降物进行离心梯度离心。离心梯度离心液可使不同细胞类型在不同密度层次上分布。根据需要，可使用手动或自动离心设备进行离心。
6. 细胞收集：从离心管中收集位于所需密度梯度上层的细胞组分，并将其洗涤与培养基中以去除离心梯度离心液的残余物质。
7. 细胞计数与培养：使用显微镜和细胞计数板来计数和评估分离的细胞的数目和纯度。接下来，将细胞移植至培养皿或试管中进行后续细胞培养或实验。
提取小鼠体内脾细胞实训过程记录
提取小鼠体内脾细胞实训过程记录
实验目的：通过体内脾细胞提取，研究免疫细胞的增殖、分化和功能等方面的生理生化特性。
实验原理：小鼠脾脏是免疫细胞的主要器官，其中包含了大量的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。提取小鼠脾细胞，可用于免疫细胞的培养、表型分析、功能研究等。
实验步骤：
1.小鼠剖腹取脾：先在实验动物按照规范的动物操作技术下施行人道安乐死，随后对小鼠进行无菌外科手术，在消毒的手术台上固定小鼠，并用无菌剪刀切开腹部，显露腹腔。定位到脾脏后，用消毒的剪刀和镊子轻轻牵引脾脏，将脾脏完整地取出。
2.清洗脾脏：将取出的脾脏置于无菌PBS缓冲液中，用无菌镊子和剪刀把脾脏上的脂肪和血管组织清除干净，并将脾脏放入含无菌PBS的培养皿中。
3.细胞提取：用无菌注射器灌注0.5mL无菌PBS缓冲液，将其注入脾脏中，用剪刀剪碎脾脏组织，使细胞充分分散。接着，将脾脏组织转移到一个50mL离心管中，并加入5mL无菌PBS缓冲液。用离心机将脾脏组织沉淀离心，将上清液倒掉，沉淀的细胞被称为脾单细胞悬液。
4.细胞计数：将脾单细胞悬液重新悬浮在含PBS的15mL离心管中，用显微镜和细胞计数板计数细胞。根据计数结果，计算细胞的浓度。
5. 离心沉淀：将细胞悬液倒入离心管中，并进行离心，离心速度约为1500 rpm，离心时间为5分钟。离心后，将上清液丢掉，离心管中的细胞沉淀称为脾细胞。
6.细胞培养：将脾细胞再次悬浮在含有适当培养基的培养皿中，加入足够的细胞密度，放入恒温培养箱中培养。培养条件根据不同实验的要求进行设置，一般情况下，培养基中含有的细胞因子、血清和其他添加剂都是必要的。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
1. 引言
小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。
2. 材料与方法
2.1 实验材料
•小鼠脾脏样品
•细胞培养基
•消化酶
•离心管
•细胞计数板
•显微镜
2.2 实验方法
2.2.1 小鼠脾脏样品的获取
1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。
2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。
3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。
2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离
1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。
2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。
3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。
4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。
2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数
1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。
2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。
3. 实验结果
3.1 小鼠脾脏样品的获取
从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。
3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离
经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数
通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
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细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
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广州大学
综合设计性实验报告
学院生命科学学院
课程细胞生物学实验
实验项目细胞培养
实验题目小鼠肝细胞的原代培养
专业生物技术
年级、班别生技142
姓名徐嘉宽
学号 1414300030
任课教师陈鲲
细胞培养
——小鼠细胞的原代培养
摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。
关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法
1前言
初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当
前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。
小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数
细胞生物学实验报告
题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数
姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科三班
时间：2011/5/26
一、【实验目的】
1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。
2、学习细胞计数的方法。
3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
二、【实验材料】
1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记笔、超净工作台、CO2培养箱等
2．实验试剂：PBS液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水
3．材料：小白鼠
三、【实验原理】
1．细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长和繁殖。
细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。
2．细胞死活鉴定。
常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。而活细胞能阻止染料进入细胞内，呈无色。故可以鉴别死细胞与活细胞。本次实验即采用此方法。伊红Y 法：细胞悬液与3倍量的0.15%伊红染液混合，2min后制片镜检，死细胞被染成红色而活细胞呈无色。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。本
实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果
分析。
实验步骤：
1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。然后
将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。最后通过过滤器筛选，获
取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和
抗生素。将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。使用显
微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培
养皿上剥离下来。将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按
照相同的条件进行培养。
实验结果：
在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。细胞体
积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。细胞密度逐渐增加，
细胞聚落的大小也逐渐增大。同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起
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实验三小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-06
同组者：吕赞洪俊蔡正琦
一、实验目的
1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养。
2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用。
3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法。
4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数。
二、实验原理
1.细胞培养
细胞培养指的是在无菌条件下，把动植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
2.细胞死活鉴定
细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存以下差异：
①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作
用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触
时不产生质壁分离。
②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能
力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。
3.血球计数板的使用
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。
每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。
图1 血球计数板的构造(a、平面图；b、侧面图)
图2血球计数板网格的分区和分格
三、实验材料和用品
1.材料
小鼠脾脏；
2.试剂
PBS缓冲溶液、1640培养液、台盼蓝；
3.器材
解剖剪、解剖镊、培养皿、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、EP管(上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好)、倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。
四、实验步骤
1.原代脾细胞培养
1) 取材：
取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。
2) 分离脾细胞：
用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射器在皿内吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入EP 管，以3000转/分离心1-2min。
3) 培养脾细胞：
从超净工作台中区塑料培养皿一个，用移液器加入细胞培养液2ml，并在皿上做记号，待用。取上述离心后的EP管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“移液器吸取塑料皿中的培养液400ul，加入弃去上清液的EP管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃二氧化碳培养箱中培养。