抗体纯化的方法有哪些

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抗体纯化的方法有哪些

抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的

抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDa

IgG 150 50，25

IgM 900 65，25

IgM单体180 65，25

硫酸铵沉淀法：

基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。

适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA

基本操作：

1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；

2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白；

3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐；

4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含%叠氮钠）缓冲液洗脱；

5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度；

6.抗体保存浓度在mg/mL适宜，-20 ℃保存不超过一个月，避免反复冻融。

亲和层析法

基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。

成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。

抗体纯化工艺

一、概述

抗体纯化工艺是制备高纯度、高活性抗体的关键步骤之一。该工艺包括多个步骤，如细胞培养、抗体捕获、杂质去除和抗体纯化等，旨在获得纯度高、活性好的抗体产品。本文将详细介绍抗体纯化工艺的各个步骤及相关技术方法。

二、细胞培养

1.细胞株选择

–选择适合抗体生产的细胞株，如CHO细胞、HEK293细胞等。

–考虑细胞株的稳定性、表达水平和生长特性等因素。

2.培养基配方优化

–根据细胞株要求，优化培养基的成分，如碳源、氮源、生长因子等。

–添加适量的抗生素保持培养的无菌状态。

3.培养条件控制

–控制培养室的温度、湿度和二氧化碳浓度等参数。

–定期检测培养液的pH值和溶氧含量，并进行适当调整。

三、抗体捕获

1.细胞收获

–选择最佳的细胞收获时间点，通常在细胞进入衰老期前进行。

–使用适当的方法（如离心、超滤等）将培养液中的细胞分离出来。

2.细胞破碎

–使用机械方法或化学方法将细胞破碎，释放抗体和细胞内组分。

–注意选择合适的破碎条件，以保持抗体的完整性和活性。

四、杂质去除

1.固体杂质的去除

–使用离心、滤膜等方法去除细胞碎片、沉淀和残留的细胞碎片等固体杂质。

–选择合适的离心速度和滤膜孔径，以避免抗体的损失。

2.溶液杂质的去除

–使用离子交换、凝胶过滤、亲和层析等方法去除溶液中的蛋白质、DNA、RNA等杂质。

–根据目标抗体的特性选择合适的去除方法。

五、抗体纯化

1.亲和层析

–使用亲和介质（如蛋白A、蛋白G、蛋白L等）将目标抗体从其他成分中分离出来。

–根据目标抗体的种类选择合适的亲和介质。

2.离子交换层析

–利用抗体与离子交换介质之间的电荷相互作用进行分离。

抗体纯化方法

1. 引言

抗体是一类免疫蛋白，具有识别和结合特定抗原的能力。在生物医学研究和临床应用中，纯化高质量的抗体是非常重要的。抗体纯化方法可以去除杂质，提高抗体的纯度和活性，从而提高其应用效果。本文将介绍几种常见的抗体纯化方法。

2. 凝胶过滤层析法

凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的纯化方法。该方法利用不同孔径的凝胶过滤介质，将目标分子（如抗体）与较大分子（如蛋白质杂质）分离开来。

具体操作步骤如下：

1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。

2.使用缓冲液进行洗脱，使较大分子无法通过凝胶柱而流出。

3.目标抗体由于分子大小适中，能够通过凝胶柱被保留下来。

4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。

凝胶过滤层析法的优点是简单易行，不需要特殊设备，且适用于各种规模的实验室。但其缺点是分离效率较低，只能实现较为粗略的纯化。

3. 亲和层析法

亲和层析法是一种基于生物分子之间特异性相互作用的纯化方法。该方法利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。

具体操作步骤如下：

1.将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体（如蛋白A、蛋白

G等）的亲和层析柱中。

2.目标抗体与配体之间发生特异性结合。

3.使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。

4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。

亲和层析法具有高选择性和高效率的优点，能够得到高纯度的抗体。但其缺点是需要特定的亲和剂和配体，成本较高。

4. 离子交换层析法

离子交换层析法是一种基于生物分子表面电荷的纯化方法。该方法利用目标抗体与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。

抗体纯化技术

抗体纯化技术是生物技术领域中应用最广泛的技术之一。它是利用分子特异性相互作用，将杂质分离排除，从而获得纯度高、活性好、病原体清除率高的抗体制备过程的一种技术。抗体纯化技术广泛应用于药物研发、分子诊断、分子生物学实验、生物检测等领域。本文将从抗体的制备、分离、纯化三个角度，分别介绍抗体纯化技术的原理及其常用的纯化方法。

一、抗体的制备

抗体的制备可以通过两种方式：1、动物免疫法；2、体外合成法。动物免疫法是指通过注射一定量的抗原，在动物身上诱导其产生抗体，并从动物的血清中提取抗体。体外合成法是利用原位合成策略，在细胞话表达体系或酵母菌上表达人工合成的抗体，再通过对产物的纯化和反应性测定，获得抗体制备。

二、抗体的分离

抗体的分离需要依托一些特异性官能团与抗体的结合作用，如离子交换、亲和层流、凝胶过滤、凝胶电泳、超滤等。其中，离子交换和亲和层流是目前用的最广泛的方法之一，可快速、高效地达到抗体分离的目的。

1、离子交换：离子交换是指利用固定在某种阵列上的一种或多种离子交换基团，以官能基团与抗体的分子手性的作用进行分离。该方法分为阳离子交换和阴离子交换，它利用离子交换层的低份子量来固定和选择性地分离抗体及其杂质。

2、亲和层流：层流法是根据不同抗体的特异性分离的一种方法，抗体与特定抗原结合后，可采用层流法对其进行分离。该方法分为亲和层流和亲合层流两种类型，前者是指利用抗体与其特定抗原之间的特异性，通过抗原固定在材料上，进行互补反应，以分离有治疗功效或有用的抗体；后者则是指利用抗体与其一些非特定抗原结合的作用，来对所有的抗体进行纯化，比如利用蛋白A的亲和性提取IgG。

常用抗体纯化方法

抗体经制备后需要进一步纯化，纯的抗体有利于保存以及排除杂蛋白对结果的影响。抗体纯化方法的选择一般取决于抗体的来源、时间的需求、成本的预算以及抗体的最终用途等。

根据纯化方式可分为以下几类：

1、亲和层析法

亲和层析主要适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。如图所示，琼脂糖首先与介质偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质，再加入成分复杂的混合物即样品后，配体选择性吸附生物活性物质（高亲和力抗体），加入平衡液，洗脱去除杂质，最终获得目标物。

protein A/protein G亲和层析

通过基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。

● protein A：分子量为42kDa，由spa基因编码，具有5个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由3个α螺旋构成。

Protein A的各个结构域

● protein G：分子量为65kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点，仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。

Protein G的各个结构域

● protein A/protein G：是一种基因工程结合蛋白。它由4个protein A和2个protein G免疫球蛋白结合域组成，比单独的protein A或protein G结合范围更加广泛，并将其优点融为一体，几乎可以应用于所有种属的IgG纯化。

抗体纯化推荐使用的方法

纯化抗体通常用于直接检测抗原。此时抗体标记有一个易于鉴定的标记物，用于结合和检测所研究的抗原。在间接检测抗原方法中，一抗不被标记，而是用标记的二抗(一种抗免疫球蛋白抗体)来检测。一般而言，建议使用间接法。因为许多商家能够提供可靠的标记二抗，用间接法不仅省力，结果同样可靠。

尽管如此，有几种方法需要标记的一级抗体。例如，在免疫染色试验中，需要研究2个或2个以上抗原的相对位置时，常需要纯化抗体并用不同标记物标记，这样能比较它们的相对位置。此时使用间接法不合适。因为间接法是用标记二抗来给未标记的一抗定位。又如，有时一抗需要标记，而该样本中又有大量无关抗体，它们能干扰对一抗的检测，此时用间接法也不合适。用鼠源性单抗对鼠组织抗原进行定位时，也会出现这种情况。此时需要纯化一抗，并直接按下述方法进行标记。

免疫亲和纯化是另一种可能需要纯化抗体的技术。在这一技术中，抗体共价交联到一固相基质上，如交连的琼脂糖或聚丙烯酰胺微球。常用的方法是，先将抗体纯化，然后连接到通过化学方法激活而具有结合位点的微球上。此时，抗体的纯化对实验的成功至关重要。

还有一种需要纯化抗体的试验，是从多克隆抗血清中分离抗原特异性抗体。多克隆血清中含有复杂多样的抗体，它不仅含有针对免疫原产生的抗体，还有血清的全部抗体。出于特定目的的需要，必须将抗原的特异性抗体分离出来。例如使用抗肽抗体时，需要分离出特异性识别肽段的抗体。通过纯化能获得特异性很高的抗体。纯化抗体的另一用途是降低本底。几乎在所有技术中，使用纯化抗体都能降低非特异性本底。产生这种效果主要是因为一方面能去除引起实验误差的污染蛋白，另一方面能精确控制实验中产生阳性信号的抗体量。使用纯化抗体不会使本底增加，因此纯化抗体可以作为所有免疫化学实验中降低本底的基本手段。

(抗体的纯化)硫酸铵沉淀法

抗体的纯化( 硫酸铵沉淀法）

一，基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二，试剂及仪器

1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等

2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 4

3. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）

4. 蒸馏水

5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)

6. 透析袋

7. 超速离心机

8. pH 计

9. 磁力搅拌器

三，操作步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）

1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.

2.其它不同饱和度铵溶液的配制

（二）沉淀

1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；

2.保留上清液并测量体积；

3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1

4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化是一种将杂质和其他成分从混合物中分离出抗体的过程。采用不同的方法可以实现抗体的纯化，具体方法取决于纯化过程中抗体与其他成分之间的特定相互作用。

以下是常见的抗体纯化方法：

1. 亲和层析（Affinity chromatography）：基于抗体与目标抗原之间的高特异性结合作用。可以使用结合在固定支持介质上的目标抗原来精确地捕获抗体。

2.蛋白A、蛋白G和蛋白L亲和层析：这些层析方法基于蛋白质和抗体之间的亲和性。蛋白A、蛋白G和蛋白L是一类结合在细菌细胞壁上的蛋白质，它们与抗体Fc区域的不同部位结合，因此可以用于从混合物中富集抗体。

3. 离子交换层析（Ion exchange chromatography）：基于抗体与离子交换基质之间的相互作用来实现分离纯化。通过调节溶液的pH值，可以控制离子交换基质上的电荷，从而实现对抗体的选择性捕获。

4. 尺寸排阻层析（Size exclusion chromatography）：通过根据抗体与其他分子的大小差异来实现分离纯化。大分子如抗体会快速通过填充在柱内的孔隙，而较小分子则会被孔隙所限制，因此可以通过尺寸选择性地捕获和纯化抗体。

5. 亲和吸附（Affinity adsorption）：用于捕获抗体的固定介质上表面共价或非共价地固定目标抗原，然后将混合物通过固定介质，使抗体与目标抗原相互作用，并通过洗涤和再生步骤来清除杂质。

6.电泳分离：电泳是基于分子在电场中迁移速率的差异来实现纯化的方法。通过电泳可以将抗体与其他成分分离开来。

抗体的纯化与检测详细版

根据实验目的选择检测方法：如定量检测、定性检测等
实验数据的分析和解读
数据的完整性：确保实验数据的完整性避免遗漏和缺失
数据的时效性：确保实验数据的时效性避免过时和失效
实验数据的准确性：确保实验数据的准确性避免误差和偏差
数据的解读：根据实验数据进行合理的分析和解读得出
结论和结论
感谢您的耐心观看
凝胶过滤法
原理：利用凝胶的孔径大小对蛋白质进行分离步骤：样品制备、凝胶装填、样品上样、洗脱、收集和检测优点：操作简单、分离效果好、分辨率高应用：抗体纯化、蛋白质分离、药物研发等领域
离子交换法
原理：利用离子交换树脂与抗体之间的静电相互作用进行纯化步骤：样品预处理、离子交换、洗脱、收集和浓缩优点：操作简单、成本低、纯度高缺点：需要选择合适的离子交换树脂可能会导致抗体活性降低
生物科学研究
抗体纯化与检测在生物科学研究中的重要性
抗体纯化与检测在生物科学研究中的应用实例
抗体纯化与检测在生物科学研究中的发展趋势
抗体纯化与检测在生物科学研究中的挑战与机遇
疫苗开发
抗体纯化：分离出高纯度的抗体用于疫苗生产抗体检测：检测抗体的活性和特异性确保疫苗的安全性和有效性疫苗生产：将纯化的抗体与佐剂混合制成疫苗疫苗质量控制：对疫苗进行质量检测确保疫苗的质量和安全性
抗体纯化与检测的注意事项

单克隆抗体纯化方法

以下是几种常见的单克隆抗体纯化方法：

1. 亲和层析：利用抗体与特定配体的亲和力进行纯化，例如使用Protein A 或 Protein G 亲和层析来捕获抗体。

2. 凝胶过滤层析：根据抗体分子大小进行分离，可以去除较小的杂质。

3. 离子交换层析：基于抗体的电荷性质进行分离，适用于去除带电荷的杂质。

4. 疏水相互作用层析：利用抗体的疏水性进行纯化，可有效去除亲水性杂质。

5. 亲和洗脱层析：通过改变洗脱条件，如离子强度或 pH 值，从亲和层析柱上洗脱目标抗体。

6. 盐析和透析：通过在高盐浓度下沉淀杂质，然后通过透析去除盐分，实现抗体的纯化。

7. 超速离心：利用离心力将抗体与其他杂质分离开来，适用于大规模制备。

这些方法可以单独或联合使用，以获得高纯度的单克隆抗体。选择合适的纯化方法取决于抗体的特性和所需的纯度水平。

需要注意的是，在进行单克隆抗体纯化时，应严格遵循实验操作规程，并在适当的条件下进行质量控制和检测，以确保获得高质量的抗体产品。

proteing纯化抗体原理

蛋白质纯化与抗体

1. 引言

在生物学研究中，蛋白质的纯化是非常重要的步骤之一。蛋白质

纯化的目的是分离目标蛋白质，以便进一步研究其结构和功能。而对

于抗体的纯化，则是为了获得高纯度的抗体样品，用于生物医学研究

和临床应用。

2. 蛋白质纯化的基本原理

蛋白质纯化的基本原理是利用蛋白质的物理性质或者特异结构来

分离目标蛋白质。常见的蛋白质纯化方法包括离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。其中，亲和层析是一种常用的方法，特别适用

于抗体的纯化。

离子交换层析

离子交换层析是根据蛋白质与离子交换层之间的电荷作用力差异

来分离蛋白质的一种方法。该方法利用具有特定电荷的离子交换基质，通过调节溶液pH或盐浓度来控制蛋白质的吸附和解吸。

亲和层析

亲和层析是利用蛋白质与特定配体（如亲和树脂中的某种化合物）之间的特异结合来分离蛋白质的方法。该方法常用于纯化特异性结合

目标蛋白质的抗体。亲和树脂可选择某种结合抗体的蛋白质抗原或其他亲和配体。

凝胶过滤层析

凝胶过滤层析是根据蛋白质分子的大小和形状差异来分离蛋白质的一种方法。在这种方法中，样品通过孔径合适的凝胶层析柱，大分子蛋白质通道较小，被滞留在柱内，而小分子的溶质则顺利通过。

3. 抗体纯化的方法

抗体的纯化是研究和应用抗体的关键步骤，其目标是获得高纯度的抗体样品。常用的抗体纯化方法包括亲和层析、蛋白A/G层析、离子交换层析等。

亲和层析

亲和层析是按照抗体与抗原之间的特异性结合来分离纯化抗体的方法。通常，将抗原固定在某种亲和树脂上，然后将原始抗体溶液通过亲和树脂柱，利用抗原与抗体的特异性结合，将目标抗体与其他杂质分离。

抗体纯化方式

抗体纯化是从混合物中分离出单一抗体的过程。该过程包括多个

步骤，其中一些步骤是特定于某种抗体的，而其他步骤是适用于各种

不同的抗体。下面将介绍几种常用的抗体纯化方式。

1.亲和层析：亲和层析是最常用的抗体纯化技术之一。该技术涉

及使用特定的亲和剂来吸附目标抗体。通常使用亲和剂与目标抗体分

子之间的相互作用来实现吸附。最常用的亲和剂是具有与抗体结合特

异性的抗原。在亲和层析中，杂质成分会快速流过树脂，而目标抗体

会与聚合物中的相应亲和剂结合并保留在材料中。接下来，可以使用

洗脱剂从树脂上洗出目标抗体。

2.离子交换层析：离子交换层析可用于强制目标抗体通过含有逆

离子的树脂以进行附着。该技术将目标抗体与树脂上的离子交换树脂

相互作用，从而实现抗体的分离和纯化。离子交换层析可分为阳离子

交换和阴离子交换两种类型。在该过程中，目标抗体在树脂上强附着，而非目标抗体则流经树脂，因为它们与树脂的亲和力较低。

3.凝胶过滤：凝胶过滤是一种基于分子量的方法，可用于将目标抗体与其他高分子化合物分离。在这种方法中，最初的混合物通过一种聚合物凝胶柱，分子量较大的组分无法通过凝胶，因此被分离并保留在柱中。目标抗体分子量较小，因此可以通过凝胶流出。

4.透析：透析是一种渐进性的纯化技术，可以用于除去小分子化合物和无用的杂质，包括离子、杂质蛋白质和难溶杂质。该过程包括使用透析袋和具有特定分子截止率的孔径尺寸的膜，并将混合物与缓冲溶液混合。由于混合物中小分子量的组分比大分子量分子经透析膜逃逸的速度快，因此它们会在膜表面生成梯度，并被移除。目标抗体粘附在透析袋内仍然存在。

单克隆抗体纯化的方法

单克隆抗体是一种高度特异性、高度灵敏度的抗体,在分子生物学、医学诊断等领域有广泛的应用。然而,单克隆抗体的纯化是保证其质量和可靠性的关键步骤。本文将介绍单克隆抗体纯化的方法,包括常用的单克隆抗体纯化技术、纯化过程中需要考虑的因素以及如何优化纯化条件以提高单克隆抗体的质量。

一、单克隆抗体纯化的方法

1. 溶剂提取

溶剂提取是常用的单克隆抗体纯化方法之一。这种方法利用单克隆抗体与提取液之间的特异性溶解度,通过溶剂将单克隆抗体从细胞或组织中提取出来。溶剂提取通常使用多种溶剂,如酒精、丙酮、氯仿等,以溶解单克隆抗体和细胞或组织中的其他成分。需要注意的是,溶剂的选择会影响单克隆抗体的质量,因此需要根据具体情况进行选择。

2. 细胞培养

细胞培养是另一种常用的单克隆抗体纯化方法。这种方法利用单克隆抗体与细胞之间的特异性结合,通过培养细胞来提取单克隆抗体。细胞培养通常使用哺乳动物细胞,如大肠杆菌、鼠疫酵母等,这些细胞通常能够产生高度特异性的单克隆抗体。在细胞培养过程中,需要注意控制细胞数量和培养条件,以提高单克隆抗体的纯度和灵敏度。

3. 抗体分离

抗体分离是另一种常用的单克隆抗体纯化方法。这种方法利用抗体与目标物质之间的特异性结合,通过分离抗体来提取单克隆抗体。抗体分离通常使用抗体分离剂,如变性银、橙皮提取液等,将抗体与目标物质分离开来。需要注意的是,

抗体分离剂的选择会影响单克隆抗体的质量,因此需要根据具体情况进行选择。

二、单克隆抗体纯化中需要考虑的因素

在单克隆抗体纯化过程中,需要考虑以下因素:

单克隆抗体纯化方法比较论述

单克隆抗体是一种通过免疫细胞融合技术产生的高亲和力、高特异性

的抗体，广泛应用于科研、临床诊断和治疗等领域。然而，在获得单克隆

抗体之后，需要对其进行纯化处理，以去除其他污染物，提高抗体纯度和

活性。目前常用的单克隆抗体纯化方法主要包括亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析和亲和膜技术等。本文将对这些方法进行比较论述。

首先，亲和层析是一种常用的单克隆抗体纯化方法。它通过利用抗体

与其靶标的高亲和力结合来实现纯化。这种方法常用的柱子材料包括蛋白A、蛋白G和蛋白L等，它们可以与抗体的Fc区域结合。亲和层析的优点

是选择性好、简单易行，并且不需要特殊设备，适用于大规模纯化。然而，亲和层析的缺点是容易因非特异性结合导致纯化效果下降，从而影响纯化

效率和纯化产率。

其次，离子交换层析是另一种常用的单克隆抗体纯化方法。它基于离

子的电荷性质，将混合物中的离子根据电荷大小和性质进行分离。这种方

法可以根据单克隆抗体的等电点进行选择性纯化。离子交换层析的优点是

选择性好、适用于大规模纯化，而且可以在较宽的pH范围内进行操作。

然而，离子交换层析的缺点是操作方法复杂，需要进行多步操作，并且可

能造成蛋白质的失活和聚集。

第三种方法是尺寸排阻层析，它是一种基于蛋白质的分子大小异性进

行纯化的方法。尺寸排阻层析通常使用凝胶柱作为固定相，大分子在凝胶

中排除，小分子则通过凝胶流出。这种方法适用于高分子量的单克隆抗体，可以有效去除小分子的杂质。尺寸排阻层析的优点是简单易行、操作方便，并且可以在常温下进行操作。然而，尺寸排阻层析的缺点是不适用于纯化

抗体纯化的步骤

抗体纯化的步骤通常包括以下几个主要步骤：

1. 细胞培养和抗体收集：首先，在体外培养细胞系，产生含有目标抗体的培养上清液。在细胞培养周期结束后，通过离心等方式收集上清液。

2. 预处理和去除杂质：上清液中可能存在各种杂质，如细胞碎片、核酸、蛋白质杂质等。这些杂质可能影响纯化后的抗体的纯度和活性。因此，通常需要进行预处理步骤，如酸性沉淀、超滤或胶体沉淀等，以去除这些杂质。

3. 亲和层析或离子交换层析：亲和层析是一种通过抗体与特定亲和基质之间的非共价相互作用来分离目标抗体的方法。通常，可以使用具有特定亲和性的树脂或基质，如蛋白A、蛋白G

或蛋白L等，来捕获目标抗体。离子交换层析则是利用目标

抗体与固定在离子交换树脂上的离子进行交换，以实现分离纯化目的。

4. 尺寸排阻层析：尺寸排阻层析是一种根据分子大小进行分离的方法。在这一步骤中，将目标抗体溶液通过精细孔径的树脂或基质，大分子如聚合物或蛋白质会被孔径所限，而小分子如抗体则能够通过孔径并被收集。

5. 进一步纯化和浓缩：经过尺寸排阻层析之后，抗体溶液可能还有一些未纯化的杂质存在。为了进一步提高纯度，可以使用离子交换、亲和性或亲水性树脂、凝胶过滤、逆流层析等技术

来进行后续的纯化和浓缩。

6. 再溶和储存：最后，将纯化的抗体溶液进行最终的调整、再溶和储存，使其达到理想的浓度和稳定性，以备后续实验或应用使用。

需要注意的是，实际的抗体纯化步骤可能因为目标抗体的性质、所用的纯化技术的选择和实验室的具体流程而有所不同。上述步骤只是一般的抗体纯化常见方法的大致流程。

27抗体的纯化——沉淀法

抗体的纯化方法很多,最为常用的为以下四种方法，基于工业化生产工艺开发的规模化生产方法要比这些复杂得多，甚至多个纯化策略联合使用，有兴趣的科研工作者可以查阅相关的文献。

1）沉淀法：利用抗体蛋白疏水性不同，提高盐离子浓度蛋白沉淀，常用的沉淀方法有硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法和聚乙二醇沉淀法；这类纯化各有各的优缺点，往往对某些亚型抗体有偏爱性。

2）广谱亲和纯化：这类纯化主要是利用金黄色葡萄球菌ProteinA /G蛋白可以特异性与抗体的Fc结合的原理进行的。

3）抗原特异性纯化：将特异性的抗原偶联到琼脂糖凝胶等固相载体上，纯化方法与ProteinA /G纯化方法相同。

4）离子交换法：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH 将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。

因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。

1. (NH4)2SO4沉淀法纯化抗体

1.1 饱和硫酸铵配制：无菌去离子水加入足量硫酸铵之后，加热到65℃以上，在磁力搅拌器上搅拌溶解至

底部仍有未溶解的硫酸铵，待冷却后，取上清滤纸过滤。

1.2 样品（血清或腹水），12,000rpm离心30min（4℃），除去细胞碎片，保留上清液并测量体积。