鼠尾草属植物的DNA及RNA高效提取方法

鼠尾草属植物的DNA 及RNA 高效提取方法
聂洪丽,宋先强,邓科君,杨足君
*
(电子科技大学生命科学与技术学院,四川成都610054)
摘要 以鼠尾草属植物为原料,采用C T AB 法提取D NA,并在TSB 法及氯化锂沉淀法的基础上改进并建立了一种高效高质量提取RNA 的方法。

用核酸测定仪测浓度和琼脂糖凝胶电泳检测质量,均获得了高浓度和高质量的DNA 及RNA,为R T PC R 、分子克隆等分子生物学实验提供了很好的模板。

关键词 鼠尾草属;R NA 提取;DNA 提取
中图分类号 Q503 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)30-09474-01
Highly Efficient Method o f D NA and R NA Extraction in Sa lvia N IE Hong li et al (C ollege of Life Science and Technology,University of Electronic Science and Technology of Chin a,C hengdu,Sichu an 610054)
Abstract C TAB method for extractin g D NA,R NA isolation wi th high efficiency and high quality was p ut forward b ased on the TSB method an d li thi um chloride precipitation method,in which the plants of Salvia was used as material.Through n ucleic acid determin ator an d agarose gel electroph oresis detec tion,the DNA and R NA extracted from root,stem and leaf of the m aterial were with high concentration and q uality.Key w ords Salvia;RNA Extraction;D NA E xtraction
作者简介 聂洪丽(1986-),女,四川成都人,本科生,专业:生物技
术。

*通讯作者。

收稿日期 2007 06 03
我国丰富的药用植物包含了与药物形成有关的丰富基因资源,这些资源不仅对于维持物种的多样性十分重要,而且对探寻中药活性成分相关功能基因及表达规律,确定药用成分合成的调控机制,获得中药药用成分关键代谢途径和其中的关键调控因子,为实现中药可持续发展也至关重要。

因此,高质量核酸的获得是进行药用植物分子生物学研究的重要基础。

唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)植物是一类重要的药用植物,全世界有1000多种,生长于温热带地区。

该属多种植物如丹参(tio rrhi za)、红根草(S.prionitis)、云南鼠尾草(S.yunnanensis)和甘西鼠尾草(S.pr ze walskii )等都被我国民间长期用作丹参使用,这些种类除可作为丹参的新资源,还将可能成为优良丹参种质选育基因库的种质资源
[1-4]。

为了对鼠尾草属丹参近缘物种进行深入研究,笔者对已
报道的提取核酸的方法均做了尝试并在此基础上进行了改进,发现用C T AB 法提取总D N A,TSB 法提取总R NA 具有良好的效果。

产物经琼脂糖凝胶电泳检测,所得D NA 和R NA 质量较好,其纯度和浓度均可满足分子生物学的研究需要。

1 材料与方法
1.1 植物材料 丹参(tio rrhiza)采自四川中江,峨嵋鼠尾草(S.o meiana var.g randibrac te ata)采自四川峨嵋山,S.tesq uicola 来源于俄罗斯,S.sclarea 来源于南斯拉夫,S.o ff ici na lis 来源于意大利巴西利卡塔州,S.verticillata 来源于西班牙,S.a zu rea 来源于美国堪萨斯州,S.virgata 来源于土耳其。

1.2 主要试剂
1.2.1 D NA 提取试剂。

D NA 提取缓冲液:0.02g/ml CT AB,100mmol/L T ris HCl(p H 值8.0),25mmol/L ED T A(p H 值8.0),1.4mol/L Na Cl,1% merca ptoe tha nol(用前加入);c hlor ofo rm isoa myl alco hol(24 1),iso amyl a lc ohol,70%etha nol 。

1.2.2 R NA 提取试剂。

TSB Buffer(p H 值8.5):100mmol/L T ris HCl,1%SD S,2% me rca ptoe thanol;APC:satured phe nol(pH 值4.3):c hlo roform=1 1;NET Buffe r:0.1mol/L Na Cl,1mmol/L
ED T A(pH 值8.0),10mmol/L T ris HCl (p H 值8.0);3mol/L N H 4Ac,8mol/L LiCl,butoxy e thanol 。

1.3 DNA 提取方法 在1.5ml 离心管中加入500 l DN A 提取液;取新鲜植物材料0.2~0.3g,在液氮中研磨成粉并快速转移到离心管中,60 水浴1h,其间缓慢摇动几次;加入625 l 氯仿/异戊醇(24 1),小心缓慢混匀,8000r/min 离心15min;取上清液置于另一个洁净离心管中,加入等体积异丙醇,上下颠倒几次,冰上放置30min,8000r/min 离心4min;小心倒掉上清液,沉淀用70%的酒精洗2~3次,放置至挥发无味;加入100 l dd H 2O 和1 l R Na se(10mg/ml),在4 条件下溶解D NA,-20 保存备用。

1.4 RNA 提取方法 RN A 酶活性灭除:用于R NA 提取的器皿以1.1MPa(121 )高压灭菌40min,塑料器皿用DEPC 水处理后灭除RN A 酶。

!研钵用无水乙醇充分燃烧后,冷却;∀取新鲜植物材料0.5g 左右,加5%不溶性PVP(聚乙烯吡咯烷酮),置研钵中,加液氮研磨至粉末状,转入1.5ml 离心管;#加入500 l TSB Buffe r,室温放置5min,加入250 l APC,剧烈震荡混合15s,室温放置2min,13000r/min 离心2min;∃取上清液加入500 l AP C,剧烈混合,室温放置2min,13000r/min 离心2min;%取上清液加入500 l 氯仿,剧烈混合,室温放置2min,13000r/min 离心2min;&重复步骤%1次;∋取上清液加入50 l 3mol/L N H 4Ac,加入2.5倍体积的无水乙醇,混合,-80 放置30min,4 、13000r/min 离心10min,去上清液,沉淀用70%乙醇洗涤2次,室温放置至挥发至无味;(沉淀用750 l NE T 悬浮,加入300 l 乙二醇丁醚,混匀,加入0.625体积的8mol/L LiCl,80 放置1h,4 、13000r/min 离心15min;)去上清液,沉淀用70%乙醇洗涤2次,室温放置至挥发无味,加30~50 l dd H 2O 溶解即得总R NA,-80 保存备用。

1.5 质量鉴定
1.5.1 DN A 鉴定。

取5 l 样品,稀释100倍,用岛津核酸蛋白测定仪进行测定,检测A 260/A 280及样品浓度。

同时在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测提取质量。

1.5.2 RN A 鉴定。

取5 l 样品,稀释100倍,用岛津核酸蛋
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安徽农业科学,Jou rnal of Anh ui Agri.S ci.2007,35(30):9474,9479 责任编辑 孙红忠 责任校对 李洪
灌浆速度也快,使百粒重增加;结荚初期追施氮肥,虽能使单株荚数、单株粒数增加,秕荚数减少,但并不能加快灌浆速度、提高光能利用率,从而使百粒重降低。

表2不同时期追施氮肥对产量及构成因素的影响处理单株
荚数秕荚
数单株
粒数百粒
重∗g 小区产
量∗kg 折单位面积
产量∗kg/h m 2较CK
+%
!69.6 5.6124.921.6 2.38aA 3300.00 19.3∀56.914.0108.322.82.23aAB 3100.0512.1#66.55.1120.620.81.68bB
2333.40
-15.7
∃c k
65.3
13.2
114.0
22.0
1.99abAB 2766.75
注:小区产量为3次重复的平均产量;不同大、小写字母分别表示在
0.01和0.05水平上差异显著。

产量以6片复叶期追氮和盛花期前10d 追施氮肥能明显增加,以6片复叶期追氮增产最多,增幅为19.3%,盛花期前10d 追氮增产12.1%,但经方差分析表明,增产不显著,在结荚初期追氮则减产较多,减幅为15.7%,减产不显著。

3 小结与讨论
(1)不同时期追氮对神豆2号的营养生长和生殖生长都
有一定的影响。

都可降低结荚高度、增加有效分枝。

其中在6片复叶期追氮能增加株高、单株荚数、单株粒数;盛花期前10d 追氮株高降低,秕荚数增多,单株荚数、单株粒数减少,
百粒重高;结荚期追氮株高、秕荚数明显减少、单株荚数、单株粒数增多,但百粒重降低。

(2)6片复叶期、盛花期前10d 追施氮肥,可促进大豆健壮生长,增强抗倒伏能力,但在结荚期追氮易造成大豆后期营养生长与生殖生长失调,使大豆旺长,田间郁闭,抗倒伏能力减弱,灌浆速度减慢,百粒重下降,3个时期追氮对大豆外观品质均无规律影响。

(3)6片复叶期、盛花期前10d 追施氮肥,都可增加产量,但增产不显著,结荚期追氮,减产较多。

(4)该试验是在追施纯氮51.75kg/hm 2的情况下做的,至于不同地力水平,以及在该试验中51.75kg/hm 2是否为最佳追肥量,有待于进一步研究。

参考文献
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(上接第9474页)
白测定仪测定,检测A 260/A 280及样品浓度。

同时在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测提取质量。

2 结果与分析
2.1 D NA 提取结果 用岛津核酸蛋白测定仪测定提取DN A 的A 260/A 280值都在1.8以上,电泳显示条带清晰且亮。

2.2 RNA 提取结果
2.2.1 用岛津核酸蛋白测定仪测定提取R NA 的结果。

A 260/A 280值均在1.8~2.0。

2.2.2 琼脂糖电泳结果。

如图1所示,能够看到泳道上28S 、18S rR NA 条带清晰,条带整齐,无背景,该方法提取鼠尾草属植物R NA 完整性好,纯度高,
浓度高。

注:1~tio rrhiza ;3~4.S.omeiana var.grandibracte ata;5.
S.tesquicola;6.S.sclarea;7.S.o fficinalis;8.S.verticillata;9.S.azurea;10.S.virgata 。

图1 TS B 法提取鼠尾草属总RNA 电泳结果
3 讨论
由于物种之间的差异性,不同植物的D NA 及R NA 提取方法有很大的不同,特别对于富含次生代谢产物的植物,其DN A 及RN A 的提取方法必须经过实践和摸索才能建立。

(1)运用CT AB 法[5]提取鼠尾草属植物的D N A,氯仿/异戊醇(24 1)分离蛋白,结合低浓度的Na Cl 进行沉淀,有利于DN A 与多糖和其他次生代谢产物相分离。

(2)R NA 在生物体中含量少且不稳定,在植物中还有大量的次生代谢产物干扰,因此提取高质量R NA 较为困难[6]。

经过多次试验,综合多种方法的优势,建立了一种高产率、高纯度、高完整性、快速易操作的鼠尾草属植物RN A 的提取方法。

在提取R NA 的过程中,分别采用TSB 法[7]、苯酚法[8]、异
硫氰酸胍法[9]
提取鼠尾草属植物叶片RN A,结果显示只有TSB 法提取的RN A 产率较高。

由于丹参含大量的次级代谢产物,如丹参酮、酚酸类成分等,影响了R NA 的提取质量,因此对提取液中的Tris HCl 进行了考察,发现pH 值为8.5时提取效果最佳。

液氮研磨时按比例加入P VP [10],它可以与多酚、原花色素等在接下来的抽提中一起去除。

在纯化R NA 的过程中,用无水乙醇进行沉淀,并配合NET Buffer 和乙二醇丁醚[11],去除次生代谢产物的干扰,得到高质量的R NA 。

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