α-淀粉酶酶活力测定实验(碘比色法)

酶活力测定的方法
碘比色法（有相应的国家标准） 在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义 为1个酶活力单位 3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法） 在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义 为1个酶活力单位 注意：去除β-淀粉酶的干扰 医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应 测定，需要微量快速）
主要产生菌
枯草芽孢杆菌 黑曲霉 米曲霉
细菌
根霉 红曲霉 黑曲霉
产气气杆菌 产色链霉菌 酵母
α-淀粉酶酶活力测定的原理
酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物） 产物为麦芽糖、糊精等 反应式：淀粉→红色糊精 淀粉及糊精检测原理：碘检测 淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30 分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→ 葡萄糖（不显色） 测定酶促反应分解一定量淀粉（给定）的时间，以红色糊 精和碘反应的颜色作为终点指示（所给定淀粉都已转化为 糊精的时间）。 根据反应所需时间和此方法的酶活力定义（相关公式推 导），代入公式计算出酶活力单位。
pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：
0.2mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液： 称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O） 45.3g，柠檬酸（C6H8O7.H2O）7.74g，先 在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定 容至1000ml。
2%可溶淀粉溶液及标准糊精溶液配制
2%可溶淀粉溶液：称取20g可溶淀粉，放入 小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后 在搅拌下注入沸腾的700mL蒸馏水中，继续 煮沸一分钟（透明），冷却后用pH6磷酸氢 二钠-柠檬酸缓冲液定容至1000ml。 标准糊精溶液：取0.06克化学纯糊精悬于少 量水中调匀，然后倾入90毫升正在煮沸腾的 蒸馏水中，冷却后定容至100毫升，滴加数 滴甲苯（现配现用就不用加），冰箱保存。
Ｎ——为酶的稀释倍数（控制反应时间）
酶活力测定步骤
发酵液（酶液） 2%淀粉液20mL+5mLpH6.0缓冲液 预热5min（60℃） 预热5min（60℃）
1mL标准糊精液＋ 来自百度文库mL标准稀碘液
混匀 标准比色管（红棕色）
确定反应终点
吸取0.5mL
混匀、计时（保温60℃），反应开始
对照比色
在白瓷板上定时取样（1滴）比色
比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同） 代入公式计算酶活力单位 注意：发酵液或酶液可能需要稀释，使加入的酶量可以在规定时间内完成反应。
α-淀粉酶测定反应比色稀碘液检 测显色变化过程
反应终点颜色
思考题
报告测定结果？ 目视碘比色法在测定α-淀粉酶酶活力时需要注意哪 些问题？ 通过查阅资料，还有哪些关于α-淀粉酶酶活力测定 的方法？说明其基本原理及主要适用范围？
α-淀粉酶酶活力测定实验 ——目视碘比色法
酶活力单位测定的介绍
测定的目的——纯化不容易；纯化过程中容易失活——质量 （重量）不能用于定量； 酶活力和酶活性的差别 酶活力反应的实质——催化反应速度高低 酶活力单位的定义及表示——增加可比性 国际标准（25℃、1min、1umol） 实际应用的标准 酶活力的测定方法 单位时间内底物的减少量或产物的增加量 反应完一定量底物的时间长短 测定物的要求：可测性、反应的专一性、稳定性、简便性 比酶活力的定义——1mg酶蛋白的酶活力（有时用1g表示） 测定过程中的条件控制——温度、pH等
酶活力测定的定义 （碘比色法——目视）
酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊 精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。 计算公式：
60 48 N 酶活力单位 20 2% N 0.5 ( / mL) t t
ｔ——为反应达到终点需要的时间（分钟），要求反应时间在5~10内完成
目的要求
1、了解α-淀粉酶酶活力测定的原理及设置标准 2、掌握熟悉α-淀粉酶酶活力测定的方法步骤（目视碘比色 法）
酶测定中的一些问题
1、你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2、解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个 试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不 用丙酮酸？ 测定方法要求：可比、实用简便、干扰小。
β -淀粉酶
淀粉-1，4-麦芽糖 苷酶 α -1，4 非还原端 2糖单位 不能跨越 麦芽糖、极限糊精
糖化淀粉酶
淀粉-1，4-葡萄糖 苷酶、糖化酶 α -1，4 非还原端 1糖单位 跨越 葡萄糖 80%-100%
异淀粉酶
淀粉α -1，6-葡萄 糖苷酶、支链淀粉 酶 α -1，6 非还原端 分枝点 可切断分支 糊精
相关碘液的配制
碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，置于小烧 杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容 量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次， 洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至500ml。 摇均后放于棕色瓶中备用。 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g， 再用蒸馏水定容至500ml。摇均后放于棕色 瓶中备用（时间不易太长？）。 标准比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化钾 8克，用蒸馏水定容至500毫升。储藏于棕色 瓶内。
酶活力的测定方法（两类）： 单位时间内底物的减少量或产物的增加量 反应完一定量底物的时间长短
淀粉酶的基本情况介绍 ——四大类
酶名 别名
作用键类型 作用键位置 水解键长度 跨越分支 产物 水解限度
α -淀粉酶
淀粉-1，4-糊精苷 酶、液化酶 α -1，4 键内>键端 2或6糖单位 跨越 麦芽糖、糊精 30%-90%
标准终点色溶液
1、第一种标准终点色溶液 取1mL标准糊精液和3mL标准稀碘液混合。 2、第二种标准终点色溶液 A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O） 40.2493g和重铬酸钾（K2CrO7）0.4878g， 用蒸馏水定容至500ml。 B液：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容 至100ml。 同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱 中待用。混合液在15天内使用有效。