纳米金标记分析

第13卷第3期2007年9月分析测试技术与仪器ANAL YSIS AND TESTIN G TECHNOLO GY AND INSTRUM EN TSVolume13Number3 Sep.2007综述(163～168)纳米金标记分析梁月园1,蒋治良1,2,江　波1(1.广西师范大学环境与资源学院,广西桂林　541004;　2.桂林工学院材料与化学工程系,广西桂林　541004)摘　要:金纳米粒子是一种性能优异的标记物,在光分析和电分析中应用广泛.综述了它在核酸、蛋白质和生物分子检测中的应用及发展趋势.关键词:纳米金;金标记;标记分析中图分类号:O657文献标识码:A文章编号:100623757(2007)0320163206 由于金纳米粒子可以和多种生物分子(核酸、蛋白质和生物分子等)结合,易于标记,对人体无害,而且具有标记后被标记物活性基本不发生改变、不同直径的金纳米可以用于多重标记、在检测中样品用量极少、实验结果可以长期保存等特点被应用于生物标记检测.金纳米粒子作为特殊标记物进行生化分析的研究开始于20世纪60年代.1962年Feldherr[1]等开始用金纳米标记细胞进行电子显微镜研究,1971年Taylor[2]又将金纳米粒子引入电镜免疫技术中,开始将金纳米粒子用于免疫标记技术.目前,随着纳米技术的发展,金纳米粒子因其具有制备简单、粒径均匀可控、性质稳定等特点已成为纳米分析化学研究的热点[3～6],并已经发展成为第四大免疫标记新技术.1　金纳米粒子在核酸检测中的应用1.1　光学检测表面等离子体共振(SPR)是一种发生在金属与电介质分界面上的物理光学现象.胶体金在可见区有等离子体共振吸收的特点[7],并且其吸收峰的等离子共振常随着尺寸的变化而发生频移,其溶液的颜色从橘红色到紫红色发生相应的变化,可用肉眼观察.据此,Mirkin[8]等利用DNA的互补识别作用把表面修饰有寡聚核苷酸的金纳米粒子作为2种探针,当被修饰的纳米探针混合后不发生团聚,引起离子共振吸收在520nm呈红色,加入靶标核苷酸,若靶标物同时与纳米探针的核苷酸杂交,则金纳米粒子通过双链DNA形成二维、三维的网状团聚结构,且共振频移至700nm,颜色从红色变成紫色;若杂交后点滴到反相硅胶板上,颜色从红色变成蓝色,通过目测观察就可以快速识别靶标物.基于此建立了DNA的分析检测法,具有简便、快速、灵敏等特点[9].同时,利用金纳米粒子对荧光的猝灭作用,把一端连有荧光基团另一端连有巯基的特定序列的寡聚核苷酸偶合到金纳米晶体上,制成核苷酸均相分析探针,这种探针产生的信号比传统标记方法强,灵敏度可提高100倍[10].Natan[11]研究组利用金纳米粒子放大SPR超灵敏检测DNA杂交,检测限可达到10nmol/m3,比未经放大相比提高了1000倍以上.表面等离子体共振成像(SPRI)是在SPR的基础上发展起来的一种新的检测方法.Li[12,13]和Mirkin[14]利用这种检测方法分别建立了检测DNA 基因组中单链核苷酸多形态和家庭检测DNA的新方法.此外,Marta[15]等还利用硅可以增强红外信号的特点与金纳米标记DNA技术结合使方法检出限降低了一个数量级.共振散射光(RL S)是指当入射光波长接近于微粒吸收带时,即散射光频率接近或等于散射微粒电子吸收频率时,瑞利散射将偏离瑞利定律且某些波长的强度将急剧提高的现象.金纳米溶液存在共振收稿日期:2007205223;　修订日期:2007207217.基金项目:国家自然科学基金(No.20667001、20365001)、广西自然科学基金(No.0728213)和广西新世纪十百千人才工程计划资助项目.作者简介:梁月园,女,在读硕士研究生,研究方向为生化分析.散射效应[3].Paul[16]等用共振散射光检测DNA杂交.方法是先将标记有补体(Cy3)和生物素的人体肺细胞DNA与互补的DNA链杂交后用荧光扫描以检测DNA的杂交情况,之后将杂交体与用80nm 金纳米粒子标记的抗生素结合,然后再用共振散射光检测DNA的杂交情况.结果表明在探针浓度比较底(83.3p g/μL)的情况下,用金纳米标记以后的共振散射光检测比用补体标记后直接用荧光检测灵敏度高.金标银染色技术是将金纳米粒子在标记中的优势与银的光学性质相结合通过将检测信号放大的一种新的标记技术[17,18].赵立凡[19]等报导了金标银染色技术可以将信号即可放大105倍,并可以通过肉眼直接观察.该方法检测单链核酸的灵敏度为0.1f mol/L,双链为10f mol/L.1.2　电学检测金纳米标记分析过程中出现的金纳米大量聚集使体系的电导增强,使金纳米应用于电化学标记成为可能[20～23].Aut hier[24]等利用金纳米标记的寡核苷酸探针与互补DNA杂交后,在酸性条件下溶出金离子,利用阳极溶出伏安法检测金离子产生的信号,并且金离子和DNA之间存在一定的信号2浓度关系,从而可间接检测DNA的含量,该方法的检测限可达5×10-12mol/L.运用同样的检测方法,以金纳米为载体可以建立多标记电化学发光DNA杂交检测的新方法[25].例如,王辉[26]等用于检测囊肿纤维DNA片段的线性范围为1.0×10-12～10×10-9 mol/L,检出限为5.0×10-13mol/L.李金花[27]等将功能化的金纳米用于DNA的电化学检测和序列分析.实验显示172mer的DNA在浓度范围为0.001～10nmol/L存在线性关系,检出限为0175×10-12 mol/L.金标银染色技术在电学检测上也有广泛的应用.例如,王美佳[28]等利用银包金的核壳结构间接检测目标DNA,线性范围为100～1000p mol/L,检测限为10p mol/L.1.3　芯片检测芯片是将生物化学领域所涉及的基本操作单元集成或基本集成在一块几平方厘米的芯片上,以快速、简便的方法完成检测.Nie[29]等将金纳米标记的DNA“表面2侵入2分离”反应和扫描电子显微镜成像技术相结合应用于DNA的芯片检测中,实现了对DNA的定量检测.DNA的浓度和扫描电子显微镜从芯片上所检测到的信号在浓度为10-18～10-15mol的范围内呈线形关系.Part[30]等将寡核苷酸功能化的金纳米粒子与靶DNA和捕获探针杂交结合后,利用金纳米探针和DNA杂交结合与盐浓度之间的关系来提高方法选择性.该方法能检测到浓度为500f M靶DNA,具有大约100000:1选择因子.金纳米粒子和银粒子具有表面增强拉曼光谱的性质,在利用寡核苷酸和具有拉曼活性的染料标记的金纳米探针进行多元寡核苷酸靶(其中包括6个不同的DNA靶和2个具有核苷酸多态性的RNA)的检测中[31],进一步确立了金纳米粒子探针-银复合物作为芯片微阵列窄带光谱指纹的设计.2　金纳米粒子在蛋白质检测中的应用金纳米粒子标记蛋白质的原理,是由于金纳米表面带有较多的电荷,当蛋白质在p H值等于或稍大于蛋白质等电点时,蛋白质呈电中性,此时蛋白质与金纳米相互之间的静电作用较小,但蛋白质分子的表面张力却很大,处于微弱的水化状态,较易吸附于金纳米颗粒的表面,从而获得金纳米标记的蛋白质[32].例如,Y ou[33]等用凝胶电泳、电动电位差、圆二色谱和荧光光谱研究了用金纳米标记修饰有不同基团的L2氨基酸与α2胰凝乳蛋白酶结合时的静电作用和疏水作用.Li[34]成功的利用发光金纳米标记羊抗人Ig G.2.1　光学检测金纳米粒子具有强荧光猝灭作用,能使荧光染料猝灭.基于此原理,Limei[35]等建立了一种基于金纳米粒子荧光猝灭测定抗原的方法.方法是先将多克隆抗2α2甲胎蛋白固定在具有磁性的纳米粒子上,与相应的α2甲胎蛋白发生免疫结合反应后,再与金纳米标记的单克隆α2甲胎蛋白抗体反应形成具有“三明治”结构的复合物.随后,通过磁场将复合物与未反应的金纳米探针分离.上清液中含有未反应的金纳米探针,加入荧光染料异硫氰酸酯后,金纳米探针可使异硫氰酸酯荧光猝灭,且猝灭的强度与α2甲胎蛋白的浓度在15～400ng/mL范围内呈线性关系,方法检出限为12ng/mL(0.17nmol/L).用于检测病人的血清并与传统的放射免疫分析法做对比实验用.结果表明,2种方法检测的结果基本吻合. Jiang[36,37]等利用金纳米的共振散射效应,检测载脂蛋白A I和载脂蛋白B,2个体系的线性范围分别为8.33～333.33ng/mL、1.97～197.17ng/mL,检出限分别为2.04ng/mL和0.96ng/mL.此外,金纳461分析测试技术与仪器第13卷米标记蛋白质所具有其他光学优点也引起了关注.例如,翟羽[38]等对金纳米标记的合成的核糖核酸酶与野生的核糖核酸酶进行光谱对比分析.2.2　电学检测阳极溶出伏安法是电化学免疫分析中常用的分析方法.楚霞[39]等通过物理吸附将兔抗人免疫球蛋白G(Ig G)抗体固定于微板上,与相应抗原Ig G发生免疫反应后,再通过夹心模式捕获相应的金纳米标记的羊抗人Ig G,然后再与金纳米标记的羊抗人Ig G抗体和金纳米标记的兔抗羊二抗形成的免疫复合物反应,在微孔板上引入大量金纳米,用适当溶液溶解后可释放出大量的金离子,用阳极溶出伏安法检测.该方法的线性范围为1.0～1143ng/mL,检出限为1ng/mL.将该方法应用于人血清中Ig G浓度的检测并与传统的酶联免疫吸附分析法作对比结果基本一致.该研究小组还利用银染色提高检测信号强度并采用三明治的模式检测C3,方法的线性范围为7.2ng/mL～7.3μg/mL,检测限为7ng/ mL[40].同理,Chu[41]等将该方法应用于人体Ig G 的检测,方法线性范围为1.66ng/mL～27.25μg/ mL,检出限为1ng/mL.Wang[42]等用示差脉冲伏安法检测手性氨基酸,线性范围为1.33×10-12～1×10-9mol/L,检出限为5×10-13mol/L.Liao[43]等用方波溶出伏安法检测兔免疫球蛋白G,线性范围为1～500pg/mL,检出限为0.25pg/mL.丁艳君[44]等以金纳米为载体标记蛋白A(PA)将补体C19抗体定向固定于石英晶体共振表面,用于压电免疫传感测定C19抗原.此方法克服了传统PA固定方法需要活化的缺点,具有固定抗体免疫活性高的优点,其线性范围为0.14～0.56μg/mL,检出限为0.11μg/mL.Walter[45]等用石英晶体微量天平传感器检测连有叶酸的蛋白质,该方法的检出限为50p mol/L.2.3　芯片检测用于蛋白质功能及其相互作用研究的生物芯片,即蛋白质芯片[46].郭希山[47]等采用自组装膜的方法[48]将金纳米组装在双螺旋线微电极表面,并且在组装过程中利用金纳米对蛋白质大分子有良好的吸附能力实现抗体的固定化,然后进行特异免疫反应构成“三明治”结构的金纳米2抗原2抗体复合体,并与双螺旋微电极匹配形成三维纳米网络结构聚集体形成一种近似于“半导体”效应的“生物放大”机制,从而提高检测的灵敏度,该方法可以检测到10-10g/mL的抗原,为蛋白质芯片直接检测提供了一种可行的方法.Savka[49]等先用对甲苯磺酰基修饰的磁性粒子探针分别与前列腺抗原、人体绒毛促性腺激素、α2甲胎蛋白结合后,再与金纳米标记的抗体结合生成“三明治”复合物.通过颜色变化判断复合物中的成分.3种抗原的检出限都达到了170f mol/L.3　金纳米粒子应用于其它生物小分子的检测 金纳米除了可用于标记核酸和蛋白质这些大分子外,还可以应用于其它生物分子的检测中.3.1　光学检测研究表明,纳米微粒的形貌、尺寸、界面性质以及纳米微粒的化学修饰及它与某些生物分子的反应产物均对RRS和RNL S的光谱特征和强度产生显著的影响.何佑秋[50]等利用纳米微粒的这一特点将金纳米粒子做探针,用共振瑞利散射光测定卡那霉素.方法是将柠檬酸阴离子自组装于带正电的金纳米表面,使金纳米微粒成为一种被柠檬酸根包裹的带负电的超分子化合物.在p H4.4～6.8弱酸介质中与质子化的卡那霉素阳离子通过静电引力和疏水作用结合,形成更大的聚集体(使平均粒径从12nm 增至20nm).这种聚集体的形成将引起RRS显著增强,为金纳米微粒不用化学修饰直接作为RRS探针测定某些物质提供了可能性.实验表明,该方法比常用的荧光偏振免疫分析法和电分析法简便、快速.此方法的线性范围为0.1～8.0μg/mL,检出限为10.52ng/mL.据此,鲁群岷[51]等将金纳米微粒作为RRS探针用于检测亚甲蓝.方法线性范围为01071～3.00μg/mL,检出限为21.17ng/mL.3.2　电学检测研究表明将金纳米粒子修饰在玻碳电极上,金纳米会对某些生物分子具有良好的生物共容性.张宏[52,53]等利用电沉积的方式制备了金纳米修饰玻碳电极,该电极对去甲肾上腺素氧化反应有催化作用,且去甲肾上腺素对金纳米有很强的吸附作用.同时,用柠檬酸钠还原的纳米金表面也带有负电荷,因此,从去甲肾上腺素和抗坏血酸在金纳米修饰电极上的循环伏安法图上可以得到2个明显分开的氧化峰,峰位差达131mV,即利用这种修饰电极可实现在抗坏血酸共存的条件下选择性测定去甲肾上腺素.方法的线性范围为5×10-6～1×10-4mol/L.561第3期梁月园,等:纳米金标记分析据此,该研究小组还提出了2种在抗坏血酸共存条件下检测多巴胺的方法,线性范围分别为3×10-6～1×10-4mol/L和1.25×10-6～1×10-4mol/L.3.3　胶体金免疫层析分析胶体金免疫层析分析(GICA)是20世纪90年代初发展起来的,其原理是以NC膜为为载体,将特异性的抗原或抗体以条带状固定其上,胶体金标记试剂吸附在结合垫上,当待测样品加到试纸条一端的样品垫后,利用微孔膜的毛细管作用,使滴加在微孔膜一端的液体慢慢向另一端渗移,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后发生反应,在移动到固定的抗原或抗体区域时,待测物和金纳米标记试剂的复合物发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,通过颜色的变化来判断样品中是否存在目标检测物. GICA主要应用于抗原、抗体的检测[54,55],但现在也有一些利用此方法用于检测生物小分子的报道[56～58].4　展望金纳米具有特殊的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应,使得金纳米与生物体有着特殊的相互作用.并且金纳米标记具有方法比较方便、标记后对生物分子的活性影响较小,且能标记很大一部分分子(核酸、蛋白质、生物分子等)、免疫金纳米比较稳定,可以长期保存、金纳米对人体无害、标记用量少等特点,这些特点使得金纳米标记技术在生化检测中得到广泛地应用.总之,随着金纳米标记技术的发展,稳定、简便、快捷、安全无毒的标记和检测方法将成为金标记的主流.参考文献:[1]　Feldherr C M,Marshall J M.The use of colloidalgold for studies of intracellular exchanges in theameba chaos chaos[J].The Journal of Cell Biol,1962,12(3):6402645.[2]　Faulk W P,Taylor G M.An immunocolloid methodfor the electron microscope[J].Immunochemistry,1971,8:108121083.[3]　蒋治良,李芳,梁宏.金纳米粒子的粒径与共振散射光强度的关系[J].高等学校化学学报,2002,21(10):148821490.[4]　蒋治良,冯忠伟,蒋毅民,等.金纳米粒子的非线性共振散射及光强度函数研究[J].无机化学学报,2001,26(2):3552360.[5]　覃爱苗,蒋治良,蒋毅民,等.金纳米粒子的聚丙烯酰胺微波高压合成及光谱特征研究[J].应用化学,2002,10(19):115021153.[6]　Raghuraman K,Valerie R,Cathy C,et al.Nanocompatible chemistry toward fabrication ofarget2specific gold nanoparticles[J].J Am ChemSoc,2006,128(78):11342211343.[7]　Hornysk G L,Patdssi C J,Martin C R.Fabricationcharacterization and optical properties of goldnanoparticle/porous alumina composites thenonscattering Maxwell2gamett limit[J].J Phy ChemB,1997,101:154821555.[8]　Mirkin C A,Letsinger R L,Mucic R C,et al.DNAbased method for rationally assembling nanoparticlesinto macroscopic materials[J].Nature,1996,382(6592):6072609.[9]　Elghanian R,Storhoff J,Mucic P C,et al.Selectivecolorimetric detection of polynucleotides based on thedistance dependent optical properties of goldnanparticles[J].Science,1997,277(5329):107821081.[10]　Dubertret B,Calame M,Libchaber A.Dingle2mismatch detection using gold2quenched fluorescentoligonucleotides[J].Nature Biothchnology,2001,19(4):3652370.[11]　Hel,Musick M D,Nicewarner S R,et al.ColloidaAu2enhanced surface plasma resonance forultrasensirive detection of DNA hybridization[J].JAm Chem Soc,2000,122(38):907129077.[12]　Yuan Li,Alastair W,Wark,et al.Single2nucleotidepolymorphism genotyping by nanoparticle2enhancedsurface plasmon resonance imaging measurements ofsurface ligation reactions[J].Anal Chem,2006,9(78):315823164.[13]　Landegren U,Kaiser R,Sanders J,et al.DNAdiagnostics2molecular techniques and automation[J].Science,1988,241(4876):107021077.[14]　J ames J Storhoff,Anne A,Lanzarides,et al.WhatCoutrols the optical properties of DNA2linked goldnanoparticle assemblies?[J].J Am Chem Soc,2000,122:464024650.[15]　Marta G,Cerruti,Marc S,et al.G old and silica2coated gold nanoparticles as thermographic labels forDNA detection[J].Anal Chem,2006,10(78):328223288.[16]　Paul B,Anthony G,Frutos,et al.High2sensitivitydetection of DNA hybridization on microarrays using661分析测试技术与仪器第13卷resonance light scattering[J].Anal Chem,2002,8(74):179221797.[17]　聂立波,陈洪,谭美君,等.金标银染基因检测方法中杂交信号的提高[J].东南大学学报,2004,4(20)4622466.[18]　Cao Y,Jin R,Mirkin C A.Nanopectroscopicfingerprints for DNA and RNA detection[J].Science,2002,297(5586):153621540.[19]　赵立凡,李柏生,黑笑涵,等.银染增强的纳米金探针技术检测微量核酸[J].中国生物化学与分子生物学报,2006,22(11):9192923.[20]　Liu Y J,Wang Y X,Claus R,et yer2by layerionic self2assembly of Au colloids into multiplayerthin2films with bulk metal conductivity[J].Chem PhyLett,1998,298:3152319.[21]　蔡宏,王廷琴,何品刚,等.基于纳米金胶标记DNA探针的电化学DNA传感器研究[J].高等化学学报,2003,8(24):139021394.[22]　Joseph W,Danke X,Abdel2nasser K,et al.Metalnanoparticle based electrochemical strippingpotentimetric detection of DNA hybridization[J].Anal Chem,2001,73(22):557625581.[23]　赵红秋,林琳,唐季安.利用纳米金颗粒增强DNA探针在传感器上的固定程度和识别能力[J].科学通报,2001,46(4):2922295.[24]　Authier L,Grossiord C,Brossice P.G oldNanoparticle based quantitative electrochemicaldetection of amplified human cytomegalovirus DNAusing disposable microband electrodes[J].AnalChem,2001,73(18):445024456.[25]　Wang H,Zhang C X,Qi H L.Electrogeneratedchemilu minecscence detection for DNA hybridizationbased on gold nanoparticles carrying multiple probes[J].Anal Chem Acta,2006,575:2052211.[26]　王辉,李廷,漆红兰,等.纳米金修饰电极和探针载体的DNA电化学发光分析方法研究[J].陕西师范大学学报,2006,4(34):68272.[27]　李金花,胡劲波.功能化纳米金增强的DNA电化学检测和序列分析[J].化学学报,2004,20(62):208122088.[28]　王美佳,纪小会,王连英,等.DNA在纳米金标上的组装、杂交、检测与银增强[J].物理化学学报,2003,19(9):8792882.[29]　Nie B,Michael R,Shortreed,et al.Quantitativedetection of individual cleaved DNA molecules onsurfaces using gold nanoparticles and scanningelectron microscope imaging[J].Anal Chem,2006,5(78):152821534.[30]　Part S J,Taton T A,Mirkin C A.Array2basedelectrical detection of DNA with nanopaticle probes[J].Science,2002,295(5559):150321506.[31]　Cao C Y W,Jin R,Mirkin C A.Nanopaticles withRaman spectroscopic fingerprints for DNA and RNAdetection[J].Science,2002,297:153621540. 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