大肠埃希菌O157：H7新型多重PCR检测方法的建立及其初步应用

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ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｉｒｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｌｉｆ７ａｎｄ
中图分类号：Ｒ３７ பைடு நூலகம் ．２＋１Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：１００４ — ５５０３（２０１５）０９ — ０９５６ — ０５
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉ０ｎ０ｆＥ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧ憎ＺｏｎＥ — ｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｌ一２００６＠１６３．ｃｏｎｒ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｍｕｌｔｉｐｌｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｏｎ — ｓｉｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ｉｎａｂｓｅｎｃｅｏｆ
样品。结论建立了大肠埃希菌Ｏ１５７：Ｈ７微量快速多重ＰＣＲ检测方法，该方法特异性、灵敏性和重复性均良好，可在现场约ｌｈ报告结果，对突发性传染病的防治具有重要意义。
关键词：大肠埃希菌０１５７：Ｈ７；多重ＰＣＲ
ＬＩＺｈｅｎｇ ‘ ，ＢＵＺｈａｏ — ｙａｎｇ，ＬＵＸｉａｏ — ｒａｎ，ＬＩＳｂｉ — ｙｕ，ＬＡＮＧＸｕ — ｌｏｎｇ，ＷＡＮＧＸｉｎｇ — ｌｏｎｇ，ＷＵＤａ — ｃｈｅｎｇ
李争。，卜昭阳１，２，３，卢晓冉。，李诗语，郎需龙，王兴龙，吴大成
１．吉林农业大学动物科技学院，吉林长春１３００６２；２．军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春１３００６２；３．吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春１３００６２；４．广东省农科院动物卫生研究所，广东广州５１０６４０摘要：目的建立一种能够满足现场快速检测、完全脱离实验室仪器设备的大肠埃希菌Ｏ１５７：Ｈ７多重ＰＣＲ检测方法。方法利用大肠埃希菌Ｏ１５７：Ｈ７抗原基因保守序列和帕Ｅ设计２对引物，并对ＰａｌｍＰＣＲＧＩ一１２退火温
温度为５４，循环数为２５个循环，上下游引物浓度为１０ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ，２对引物最适比为Ｃｈ：帕Ｅ＝１：３。大肠埃希
菌Ｏ１５７：Ｈ７扩增产物可见６２５ｂｐ（，ｚｉＣ）和２１３ｂｐ（ｒ『６Ｅ）的特异性片段，而大肠埃希菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、猪链球菌２型、金黄葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、小肠耶尔森菌、单增李斯特菌、沙门菌的ＰＣＲ检测结果均为阴性，最低扩增ＤＮＡ浓度为１０ｐｇ／ｌ，重复扩增５次均可见目的条带。９份疑似病牛粪便样品中，共检测出７份大肠埃希菌０１５７：Ｈ７阳性
ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，］ｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００６２，ＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ
９５６
中国生物制品学杂志２０１５年９月第２８卷第９期ＣｈｉｎＪＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓＳｅｐｔｅｍｂｅｒ２０１５，Ｖｏ１．２８Ｎｏ．９
技术方法
大肠埃希菌Ｏ１５７：Ｈ７新型多重ＰＣＲ检测方法的建立及其初步应用
度、循环数、引物浓度及引物最佳比例进行优化，建立微量快速检测大肠埃希菌Ｏ１５７：Ｈ７的多重ＰＣＲ方法，并对该
方法的特异性、灵敏性、重复性进行验证。取疑似病牛粪便共９份，利用粪便ＤＮＡ提取试剂盒提取ＤＮＡ，按照建立的ＰＣＲ方法进行扩增，扩增产物经微型电泳仪电泳检测并照相。结果确定大肠埃希菌０１５７：Ｈ７ＰＣＲ的最佳退火