彗星实验

应用慧星试验研究细胞D NA损伤的原理与方法

山西大学生命科学系环境生物毒理学研究室(太原030006)　孟紫强

中国辐射防护研究院二所　张连珍

提　要　对应用慧星试验(即单细胞微凝胶电泳(SCGE技术)研究细胞DNA损伤的操作过程、技术原理以及实验操作过程中应注意的事项,进行了详细介绍和讨论。

关键词　慧星试验　单细胞微凝脉电泳　DNA损伤　哺乳类细胞　淋巴细胞

诱变剂往往是通过引起DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。近年来由Singh等改进和建立的慧星试验(Com et assay)即单细胞微凝胶电泳(SCGE)技术,是一项测定和研究细胞DNA损伤的新技术,该技术在国外有关研究领域内已得到广泛的应用〔1,2〕。但在我国有关研究报道甚少。为此,本文对我们研究室建立和改进的SCGE技术作了详细报道,以期与国内同行交流和进一步改进。

1　SCGE测定原理

哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想的实验条件下,对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成慧星状图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成慧星状图象。DNA受损伤愈严重,产生的断链和碱易变性片断就愈多,断链也愈小;在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多,迁移的距离就愈长。因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系。

我们的实验也表明,未处理的对照组淋巴细胞DNA在SCGE实验中也表现有微弱的迁移现象。我们认为这主要是由于人血淋巴细胞从静脉血分离出来之后,体外条件必竟是一种非生理条件,离开活体的细胞不可避免地会受到某些非生理条件的不利影响,使细胞中的DNA受到不同程度的损伤,导致微量DNA在电泳中迁移。我们在用碱洗脱法和DNA碱解旋速率法测定DNA单链断裂时,也发现未处理对照组的人血淋巴细胞和其它哺乳类细胞的DNA单链断裂占总DNA的5～30%〔3—5〕,也表明非生理条件能诱发DNA 损伤,与本实验结果一致。

2　SCGE实验方法

211　细胞分离和处理　(1)人血淋巴细胞分离:从健康人静脉采血015～1mL,沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上,3500r m in离心2m in,吸取中间层淋巴细胞於10m l离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)至5m l,1500r m in离心8m in,如此重复洗涤细胞两次,再将细胞悬于PBS,置4℃待用。(2)其它细胞的分离制备:对于体外培养的细胞株,若为贴壁生长的细胞,当细胞处于对数生长期时,可弃去培养液,加适量011%胰蛋白酶H ank’s溶液,在37℃下3-5m in,使细胞脱离瓶壁,用PBS洗涤细胞2—3次,调节至适当的细胞密度即可;若为悬浮培养的细胞,只需用PBS 洗涤细胞两次即可。对于实体肿瘤、胸腺、脾及其它组织,可用不锈钢剪去除结缔组织,剪碎,压研通过60目不锈钢网,再用PBS洗涤细胞2—3次,调节适当细胞密度即可。对于肝细胞的分离制备比较复杂,需经过含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注,再分离肝细胞。(3)紫外线或Χ-线照射:取新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞悬液,用PBS调细胞浓度为1×105个细胞 m l,于冰水浴中经紫加线或60Co-Χ线照射,照后细胞置于冰水浴中,并立即用于SCGE测定。(4)化学处理:新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞,在SCGE测定前用待测化学物在37℃下处理2-4h,细胞密度均为1×105个 m l。随后将细胞保存在4℃下或冰水浴中,立即进行测定。

212　制片　(1)磨砂载玻片:用水砂纸(粒度,N o. 380)将普通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨,使形成的磨砂面均匀细密。磨时谨防加压过大、用力过猛,以免在载玻片面上形成粗纹痕迹。实验发现如磨砂面有粗纹划痕,细胞裂解液处理后,载玻

片上的凝胶容易脱落,选用的载玻片宜薄不宜厚,过度时会导致用荧光显微镜观察时调焦距离不够。(2)制胶板:分作三层,第一层为正常熔点琼脂糖(NM A)层,第二层为含有细胞的低熔点琼脂糖(LM A)层,第三层又为LM A层。第一层除了使第二层紧密附着外,还可使第二层的所用细胞处在相同条件下,第三层可防止第二层细胞DNA在碱处理和电泳时脱离凝胶,使所有细胞DNA在同样的电泳条件下。第一层凝胶的制备:将上述磨好的载玻片,磨砂面向上,预热40℃左右,将预热45℃的100uL015%正常熔点琼脂糖(NM A)的无Ca2+、M g2+磷酸盐缓冲液(PBS)滴在载玻片上,迅速盖上干净的1号盖玻片,再置4℃下10m in使NM A 凝固。在第一层凝胶制备过程中,特别注意载玻片不可象个别文献介绍的那样预冷,而是要预热。我们的实验证明载玻片预冷使凝胶凝固过快、铺展不匀、且易脱落。另外,1号盖玻片必需清洗干净,用前用无水酒精擦洗干净,盖在第一层凝胶上之后要立即放入4℃冰箱中,以便在下步移开盖玻片时不会把第一层胶破坏。第二层凝胶的制备:将10ΛL含有1000个受检人血淋巴细胞的PBS和75Λl含015%LM A的无Ca2+、M g2+ PBS分别在37℃下预热并相混。继之,轻轻揭去盖玻片,迅速将含细胞的LM A滴到第一层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片,置4℃10m in使第二层LM A 凝固。第三层凝胶的铺制:第二层LM A凝固后,在室温下小心移去盖玻片,滴加预热37℃的75Λl含015% LM A的无Ca2+、M g2+PBS,如上盖上盖玻片4℃下凝固。(3)细胞裂解:移去盖玻片,将凝胶水平浸入新配制的预冷的4℃细胞裂解液(215mo l L N aC l,100mmo l L N a2ED TA,10mmo l L T ris-HC l pH10,1%肌氨酸钠,用前加1%T riton X-100,10%二甲基亚砜)中至少2h。这一处理可使细胞膜、核膜和其它生物膜破坏,细胞内的蛋白质、RNA、及其它成份扩散出胶进入裂解液内,只有细胞DNA由于它的高分子量和超螺旋结构,仍保持在原处,对于正常的未处理的细胞其DNA结构在理想条件下应仍象在细胞中那样。(4) DNA碱解旋:将凝胶取出,用吸水纸吸干裂解液,并列置于水平电泳槽的阳极端,电泳槽中盛有新配制的碱性电泳缓冲液(1mmo l L N a2ED TA,300mmo l L N aOH),约覆过凝胶胶面0125c m左右,放置40m in,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使DNA断链在电场中易于迁移。我们在预试中观察到碱解旋时间延长可使DNA迁移长度增加。(5)单细胞电泳:在电压25V、电流300mA下,电泳40m in,电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。在预试中观察到电泳时间加长可使DNA迁移长度增加。(6)中和与染色:电泳后将载玻片凝胶平放在小瓷盘内。为使凝胶中的碱液中和,缓缓沿壁加入014mmo l L T ris-HC l(pH715)缓冲液,将凝胶淹没15分钟,再将T ris-HC1缓冲液吸去,用滤纸将盘内液体吸干,再缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋1h。之后,吸去乙醇,凉干或室温下过夜。每凝胶加50u l30ug m l溴化乙锭(EB)水溶液,再盖上盖玻片染色20m in。本实验发现酒精处理可明显增强DNA荧光强度。EB染液在4℃下至少可保存6个月,而不是个别文献所说的只能保存二周。213　观察和拍照　EB梁色后的样本应尽快在荧光显微镜下观察电泳图象,本实验采用奥林帕斯荧光显微镜紫外光(U)激发、DNA图象呈橙黄色,可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即慧星尾)。每个样本随机选择25个细胞,尽快用目镜测微尺测定核DNA直径和DNA迁移的长度。有条件者可借助图象分析仪进行分析。对细胞DNA电泳图象也可拍照记录,本实验拍照条件为目镜10X、物镜40X,采用乐凯黑白卷(A SA400)。

3　讨　论

311　SCGE技术的优点及应用　一些化学、物理和生物性的诱突变剂或诱癌剂往往可引起DNA的损伤。DNA 链断裂是细胞DNA损伤的主要类型之一。测定细胞DNA链断裂的方法很多,例如中性或碱性蔗糖密度梯度离心法、DNA碱解旋法、中性或碱性滤膜洗脱法、DNA 粘度测量法等〔1,2〕。这些方法所获得的结果反映了群体细胞DNA损伤效应,不能对单个细胞进行分析,而且除粘度法以外均需要对活细胞进行放射性同位素标记,设备条件和技术条件要求高,使它们的应用有一定局限性。近年来由Singh等改进和建立的SCGE技术,与传统方法相比,其操作简便、快速、灵敏,无需放射性标记、所需细胞少,适于体内、外不同类型实验和各种类型细胞DNA 损伤的研究。因此,SCGE法在国外有关研究领域内已得到了广泛的应用〔2〕。

SCGE技术能够对单个细胞的DNA损伤进行研究,从而避免了只能对细胞群体的DNA改变进行测定的不足。加之,DNA荧光测定极为灵敏,这就使SCGE技术的灵敏度大为提高。SCGE不仅可研究活细胞DNA的损伤,也可研究死细胞的DNA损伤,从而避免了只能用活细胞研究(如染色体畸变、微核、姐妹染色单体互换等)的限制,使SCGE不仅可研究低剂量下的生物效应,也可研究高剂量下的生物效应。由于SCGE的上述优点,SCGE技术不仅可用来研究物理、化学、生物学因子,单独或联合时对细DNA的损伤和修复的效应,而且可用于研究抗癌药物的抗癌作用机理,细胞调亡(A pop to sis)过程、放射和化学防护、肿瘤放射治疗监护等领域的问题,相信SCGE技术将迅速在我国推广应用起来。

312　SCGE试验操作的几点体会　本文在方法建立中发现,制胶时环境温度很重要,尤其是第一层凝胶的