蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

（二）蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2.盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3.有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分

离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

卵清蛋白分离提取及纯化的具体试验步骤

一、实验目的与原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯

度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。

二、材料与试剂：1．材料：新鲜鸡蛋2 只

2:仪器：抽滤瓶500—1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器

3：试剂：

10%TCA，用固体NaOH 调调PH 至1.05—1.10,需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M , PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE 和

2.22mgCaCL2），50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL 缓冲液

三、操作步骤

1,取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25C —30C,在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸一丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5,再继续搅拌30min,然后在4C冰箱中放置过夜。

2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。

3,边搅拌边加入4C预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4C放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min,收集沉淀。

4,将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h,换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm 离心10min ,去除不溶物。

抗菌蛋白分纯的步骤

准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95汇醇无水乙醇1%SDS

操作步骤：

1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml 异丙醇，室温放置10分钟，2〜8C 12000Xg离心10分钟弃上清。

2.用含0.3M盐酸胍的95%L醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2〜8C 7500Xg离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml 无水乙醇同样方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白质沉淀5〜10分钟，用1%SD溶解蛋白质，反复吸打，50C温浴使其完全溶解，不溶物2〜8C 10000Xg离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20 C保存备用。

注意事项：

1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95聽醇或无水乙醇中2〜8°C—个月以上或-5至-20 C一年以上。

2.用0.1% SDS在2〜8C透析三次，10000Xg离心10分钟取上清即可用于Western Blot 。

常见问题分析：

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底。

B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。

丫球蛋白分离，纯化，鉴定的方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项）

[ 原理]

血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B -球蛋白和丫-球蛋白，其中丫-球蛋白含量约占16%, 100ml血清中约含1.2g 左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中（常用硫酸铵）溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有丫-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25 凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分

离。a—球蛋白、B -球蛋白的PK6.0 ; 丫一球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的a —球蛋白和B -球蛋白能与DEAE

纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的丫—球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有丫-球蛋白，从而使丫 -球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：

用上述方法分离得到丫 -球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的丫 -球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

[ 操作]

⑴盐析——中性盐沉淀：取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9 %氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙 4.0ml，混匀后于室温中放

置10min，3000r/min离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5〜1.0ml使之溶解。此液即为粗提的丫一球蛋白溶液。

(2)脱盐――凝胶柱层析

①装柱