蛋白质定量：(BCA法)学习资料

实验原理

BCA(bicinchoninic acid)是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性，在562nm 处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。

实验准备

1. BCA定量试剂盒：含A液和B液

A液：BCA碱性溶液（配方：1%BCA二钠盐，0.4%氢氧化钠，0.16%酒石酸钠，2%无水碳酸钠，0.95%碳酸氢钠，这些液体混合后再调PH至11.25）B 液：4%硫酸铜

2.牛蛋白血清（BSA）

3.待测的蛋白样品

实验步骤

1.配置BCA工作液：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA 工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）

2.配置不同浓度的标准蛋白液（BSA），1ug/ul，2.5 ug/ul，5 ug/ul，7.5 ug/ul，10 ug/ul，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液（如待测样品溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释标准蛋白液）。

3.取空白组（0ug/ul BSA）各浓度的标准蛋白液5ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品5ul，加入96孔板。

PS：上图加样的量仅作为参考，蛋白液和BCA工作液的比例符合即可。

4.向各孔的蛋白液中加入300ul的BCA工作液，混匀，37度放置30分钟，（加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数）。PS：温度和放置时间可以调整，可在60度放置30分钟or室温放置2小时。

5.静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲线。

6.根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。

注意事项

BCA法测定蛋白浓度时，吸光度可随时间的延长不断加深，且显色反应会随温度升高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育or延长孵育时间。

标准蛋白液的加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来的标准曲线出现偏差，影响待测样品的浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置标准蛋白液，另一方面应使用精确度高的移液枪。

A液和B液混合可能出现浑浊，此时应成分振荡混匀，最后可见透明溶液。

为加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但切勿过热。

当结果出现空白组本身就有较高的背景，可用Bradford法重新测定蛋白浓度。

优缺点

优点：

测定快速简便，45分钟内完成

准确灵敏,检测浓度为5-200 mg/ml

干扰物质少，BCA法不受大部分样品中的去垢剂等化学物质影响，可兼容样品中高达5%的SDS，5%Triton X-100,5%的Tween 20

在一定浓度范围内，有良好的线性关系

检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝法蛋白定量

缺点：

与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够

蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果

BCA蛋白定量和Bradford法蛋白定量的区别：

1、Bradford法测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA则没有选择性

2、BCA法蛋白浓度定量是二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（biuret reaction），一价铜离子和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。Bradford法蛋白定量是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH 4 ) 2 SO 4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。