高效液相色谱同时测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留

ｌＪ］．ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．１９９４，７７（４）：８７１—８７５． ［２］Ｒｏｙｂａｌ Ｊ Ｅ，Ｐｆｅｒｍｉｎｇ Ａ Ｐ．Ｔｕｒｎｉｐｅｅｄ Ｓ Ｂ．ｅｔ ａ１．
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｉｎ ｍｉｌｋ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［ｊ］．ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．１９９７．９０ｆ５）：９８２—９８７． ［３３ Ｄｒａｋｏｐｏｕｌｏｓ Ａ Ｉ，ｌｏａｎｎｏｕ Ｐ Ｃ．ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｉｄ—ｂａｓｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｏｆｌｏｘａｅｉｎ，ｎｏｒｆｌｏｘａｅｉｎ．ｅｉｐｒｏｆｌｏｘａｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｆｌｏｘａｃｉｎ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｅｔａ，１９９７，３５４（１－３）：１９７—２０４． ［４］Ｗａｌｉｌｙ Ａ ＦＭ，Ｂｅｌａｌ ＳＦ．ＢａｋｒｙＲ Ｓ．ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｓｐｅｅｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｐｒｏｆｔｏｘａｅｉｎ ａｎｄ ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ ｂｙ ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｏｓｉｎ ａｎｄ ｐａｌｌａｄｉｕｍ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎｆｌｌ．１９９６．１４（５）：５６ｆ一５６９． Ｉｓ］Ａｒｇｅｋｅｒ Ａ Ｐ，Ｋａｐａｄｉａ Ｓ Ｕ．Ｒａｉ ｓ Ｖ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ ａｎｄ ｔｉｎｉｄａｚｏｌｅ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
中图分类号：￥８５９．８４
文越标识码：Ｂ
氟喹诺酮类药物因其具有吸收好、组织浓度高、 半衰期长、抗菌谱广与其他抗菌药物无交叉耐药性 等优点而在临床上被广泛应用。由于该类药物常有 不合理用药和滥用药的情况发生．因此，氟喹诺酮类 药物残留问题越来越引起人们的重视。氟喹诺酮类 药物的常规测定方法主要有反相高效液相色谱 法‘““、分光光度法‘“、荧光法Ｆ“、薄层色谱法叫等。 固相革取反相高效液相色谱方法已经成功地应用于 可食性动物组织Ⅱ。］、动物血液口３以及人血浆、人尿 液０１等体系中的药物残留分析。对该类药物的残留 检测方法国外研究较多，但是牛奶中环丙沙星、恩诺 沙星、沙拉沙星和二氟沙星残留量检测方法在国内 仍处于空白。本研究旨在建立一种简单、快速、可靠 的同时检测环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙 星在牛奶中残留量的方法。 １材料与方法 １．ｉ仪器与设备高效液相色谱仅：惠普１１００型 系列，配备四联泵、脱气泵、色谱工作站、荧光检测 器、自动进样器和柱温箱等，美国ＡＧＩＬＥＮＴ公司； 电子分析天平、离心机、微型混合器、多功能振荡器、 可调微量移液器等。 １．２ 试剂和溶液 恩诺沙星对照品：含量为 １００．Ｏ％，批号为Ｈ０１０１０２，中国兽医药品监察所；盐 酸环丙沙星对照品：含量为９９．８％，批号为 Ｈ０１０５９８，中国兽医药品监察所；沙拉沙星对照品： 含量为９９．６％，批号为Ｈ０６１２００，中国兽医药品监察 所ｆ二氟沙星原料药：含量为１００．６％，批号为 ０１１６０１，广州惠华有限公司；柠檬酸、乙酸镀、三乙 胺、甲醇、乙腈、正已烷均为国产分析纯试剂；乙腈： 色谱纯，批号为７５—０５—８，香港Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司； 水为去离子水。提取液：称取１０ ｇ三氯乙酸溶于ｉ００ ｍＬ甲醇中。 １．３ 色谱条件ＨｙｐｅｒｓｉｌＢＤＳ—Ｃ１８，（５ ｐｍ，４．６× ２５０ｍｍ）色谱柱；荧光检测器，激发波长Ｏ．ｅｘ）２７８ ｎｍ，发射波长Ｏ，ｅｍ）４６５ ｎｍ，流动相：０．０５ ｍｏｌ／Ｌ 柠檬酸一０．１ ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵＋乙腈（８２ Ｉ １８，ｖ／Ｖ） ［ｏ．０５ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸一０．１ ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵：准确称 取１０．５５９８ ｇ柠檬酸和７．８６５０ ｇ乙酸铵，用去离子
万方数据
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
中国兽医杂志２００７年（第４３卷）第７期８９
（Ａ）与相对应的药物浓度（Ｃ）作直线回归，求得标准 曲线回归方程的线性范围为０．０２～２．００ ｔｔｇ／ｍＬ，相 关系数大于０．９９。定量限均为２０ ｎｇ／ｍＬ，环丙沙星、
文章编号：０５２９—６００５（２００７）０７—００８８—０２
水稀释至１ ０００ｍＬ，加１ ｍＬ三乙胺调ｐＨ．用０．２２ ／ｚｍ微孔膜过滤脱气处理］。柱温：４０℃，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，进样量为３０ ｐＬ。 １．４标准曲线的绘制 １．４．１标准储备液 １．４．１．１称取恩诺沙星对照品０．０１００ ｇ，沙拉沙星 对照品０．０１００ ｇ，以１０％醋酸溶解，用甲醇分别定容 至２个１０ｍＩ。棕色容量瓶中，制成浓度为１ｍｇ／ｍＬ 的储备液，存放于４℃冰箱中。 １．４．１．２称取盐酸环丙沙星对照品０．０１１６ ｇ，盐酸 二氟沙星原料药０．００９９ ｇ，用超纯水溶解，用甲醇分 别定容至２个１０ ｍＬ棕色容量瓶中，制成浓度为 １ ｍｇ／ｍＬ的储备液，存放于４℃冰箱中。 １．４．２标准工作液Ｉ 移取４种标准储备液各 ｌ ｍＬ，用甲醇稀释并定容于１０ｍＬ棕色容量瓶中， 制成浓度为１００ ｐ－ｇ／ｍＬ的标准工作液Ｉ。 １．４．３标准工作液Ｉ 移取标准工作液Ｉ １ ｍＬ， 用甲醇稀释并定容于１０ｍＬ棕色容量瓶中，制成浓 度为１０ Ｐｇ／ｍＬ的标准工作液Ⅱ。 １．４．４绘制标准曲线用工作液Ⅱ 移取标准工作 液Ｉ，用甲醇稀释制成浓度为０．０１、０．０２、０．０５、 ０．１０ｋ０．２０、０．５０、１－００，ａｇ／ｍＬ系列标准工作液，存 放于４‘Ｃ冰箱中。 ｌＩ ５乳汁样品预处理准确吸取０．５ ｍＬ乳样于 ２ ｍＬ离心管中，加人０．４ ｍＬ提取液，旋涡混合器上 混合至少３０ ｓ以上，静置２０ ｒａｉｎ。１５ ０００ ｇ，离心。吸 取上清液，０．２ ｐｍ微孔滤头过滤至棕色自动进样瓶 中，上机检测。 ２结果与讨论 ２．１色谱图添加药物的乳汁样品按１．５方法处 理，按１．３测定，能将４种氟喹诺酮类药物与样品中 其他成分分开。以１００ ｎｇ／ｍＬ的添加浓度为例，所得 色谱图见图ｌ。由于氟喹诺酮类药物为两性化合物． 在流动相中加入三乙胺可以消除硅羟基的影响，在 ｌ Ｌ流动相中加入１ ｍＬ三乙胺用以抑制解离，改善 峰形。在本试验所采用的条件下，４种氟喹诺酮类药 物都可以得到有效的分离，出峰顺序是环丙沙星、恩 诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星，其保留时间分别为 ５．１５５ ｒａｉｎ、６．９００ ｒａｉｎ、９．０８２ ｒａｉｎ和１０．７８８ ｒａｉｎ，各 组分分离度好，色谱峰形好，保留时间合理。 ２．２标准曲线的测定准确吸取０．５ｍＬ空白乳样 于８支塑料离心管中，取１００ ｐＬ系列浓度的工作液 ■，旋涡混合器上混合３０ ｓ，静置３０ ｒａｉｎ，第ｌ管不加 药物作对照。按１＿５方法处理，依次从低浓度到高浓 度测定，将测得的氟喹诺酮类药物的色谱峰面积
８８ 中国兽医杂志２００７年（第４３卷）第７期
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
高效液相色谱同时测定牛奶中４种氟喹诺酮类药物残留
廖洁丹“２，李守军１，刘文字１，贺利民１，刘 戎１，沈祥广１，刘雅红１
（１．华南农业大学兽医学院，广东广州５１０６４２｝２．佛山科学技术学院生命科学学院，广东佛山５２８０００）
收稿日期：２００７—０４—０２ 基金项目：国家自然科学基金（３０４７１３０８），广州市科技计划项目 （２００５ＪＩ－Ｃ０１１１），农业部行业标准制定项目（０３１５） 作者简介ｉ廖洁丹（１９７９一），女，助教．硕士，主要从事基础兽医药 理学和药物残留方面研究，目前工作单位为佛山科学技术学院，
Ｅ—ｍａ通ｉｌ： 讯ｌ作ｉａ奇ｏｊｉｉ刘ｅｄａ雅ｎ＠红１８，３．Ｅｃ—ｏｍｍａｉｌ】ｇａｌｅ＠ｓ㈨ｄｕ．ｃｎ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｈｉｇｈ—ｐｃｒｆｏｒｍａｎｇｅ ｔｈｉｎ—ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｌａｎａｒ Ｃｈｒｏｍａ—ｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍｏｄｅｒｎ，１９９６．９ （３）１ ２０８ ２１１． ［６］Ｓｔｒｅｌｅｖｉｔｚ Ｔ Ｊ，Ｌｉｎｈａｒｅｓ Ｍ ｃ Ｓｉｍｕ［ｔａｎｃｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄａｎｏｆｌｏｘａｃｉｎ ａｎｄ Ｎ—ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄａｎｏｆ［ｏｘａｃｉｎ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ ａｎｄ ｅｈｉｃｋｅｎ ｅｄｉｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ， １９９６，６７５：２４３－２５０．
恩诺沙星的最低检测限为８ ｎｇ／ｍＬ，沙拉沙星、二氟 沙星的最低检测限为１０ ｎｇ／ｍＬ。
Ｊ ９
恤、 ８
７ ６ ５ ４ ３ Ｚ
Ａ空白乳样
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱＣ空白乳样加标准品
田１乳样中４种■喹诺酮类药物分析色谱圈
２．３ 回收率和变异系数的测定准确吸取１００ ｐＬ 系列浓度的标准工作液Ⅲ，分别加入到０．５ ｍＬ空白 乳样中，制得环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙
星的终浓度为０．０２，０．１０，０．２０，０．４０／１９／ｍＬ和２．ｏｏ ｇｇ／ｍＬ的乳汁样品，按１．５方法处理并测定。乳样制 得０．０２，０．１０，０．２０，０．４０／１９／ｍＬ和２．００ ｇｇ／ｍＬ ５ 个浓度，按每个浓度作５个重复，共作４个批次（Ｅｌ 问）。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星在５ 个添加水平上的平均回收率分别为９１％～９９％， ９６％～９８％，９１％～９６％和９４％～９７％。本方法批 内、批问变异系数的均值分别为３．１３％和５．０７％。 ２．４样品前处理方法的确定 生物制品含有大量 的脂类、蛋白质等干扰物质会影响色谱分离和检测； 故在分析前需对样品进行预处理。去除蛋白质的方 法很多，有甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀法等。 样品提取液曾试用５％三氯乙酸甲醇溶液，１０％三氯 乙酸甲醇溶液，５％三氯乙酸乙腈溶液，１０％三氯乙 酸乙腈溶液，３０％三氯乙酸乙腈溶液，５％与１０％浓 度的三氯乙酸及其与甲醇混合物，都能使蛋白质完 全沉淀。乙腈与三氯乙酸混合物的提取液也能使蛋 白质沉淀，但三氯乙酸浓度不同，沉淀效果有别。５％ 三氯乙酸乙腈提取液沉淀不完全，出现微浑浊，再次 离心液不能使上清澄清。１０％与３０％浓度的三氯乙 酸乙腈都能使蛋白沉淀，但回收率较低。故选用了 １０％三氯乙酸甲醇溶液作为提取液。 ２．５样品前处理方法的比较在对牛奶中氟喹诺酮 类药物检测的样品前处理中，本试验在相同的色谱 条件下，不同的流动相比例，比较了３种不同的样品 前处理方法：方法一，用甲醇一１０％三氯乙酸提取液 提取，过滤后直接上样；回收率大于９０％，批内变异 系数小于６％，批间变异系数小于８％＃其定量限为２０ ｎｇ／ｍＬ。方法二，用磷酸一甲醇提取两次后浓缩定容 上样，回收率为７７％～９７％，批内变异系数小于 １０％，批间变异系数小于１４％；其定量限为１０ ｎｇ／ ｍＬ。方法三，用乙腈一１０％三氯乙酸（３：７，Ｖ／Ｖ）为 提取液，通过ＳＰＥ净化后浓缩并定容上样，４种氟喹