pET-41b(+)大肠杆菌表达载体说明
大肠杆菌表达操作规程
大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。
2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。
3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。
4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。
5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。
二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。
培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。
2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。
3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。
4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。
5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。
6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。
7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。
8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。
9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。
三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。
2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。
3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。
4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。
大肠杆菌的genotype说明，看懂大肠杆菌菌株的genotype
大肠杆菌的genotype说明，看懂大肠杆菌菌株的genotype 总结了一些关于大肠杆菌基因型的资料，和大家分享一下。
大肠杆菌基因型说明hsdR 有利于非甲基化DNA（如PCR扩增产物）的有效转化。
mcrA 有利于甲基化DNA（如基因组）的有效转化。
acZΔM15 用于蓝白斑筛选。
endA1 无Endonuclease I 酶活性，有利于质粒的纯化。
recA1 减少克隆DNA的非特异性重组。
DE3 编码T7 RNA聚合酶，用于诱导T7-启动的表达系统的表达。
DeoR 可以高效吸收大片段DNA，有利于文库的构建。
Tn10 含有四环素抗性的转座子。
OmpT 表明大肠杆菌缺乏外膜蛋白酶。
缺乏外膜蛋白酶的菌株可以降低表达的外源蛋白在细菌中被降解的程度，有利于获得完整的重组蛋白。
PLys 含编码T7溶菌酶的质粒；通过抑制T7 RNA聚合酶基础表达水平来降低T7启动的表达体系的基础表达水平。
ArgF 由于突变细菌不能利用arginine。
F’一个低拷贝可移动的质粒，当被M13噬菌体侵染时，可产生单链DNA。
LacI 编码lac抑制子，用于蓝白斑筛选时需加入IPTG，才可启动表达β-gal。
dam/dcm 消除了内源腺苷和鸟苷的甲基化。
在此种细菌中繁殖的DNA不被甲基化F-，F 因子缺失φ80dlacZΔM15，lacZDM15（Lactose）Map position：8 min 功能：lacZM15是表达β-半乳糖苷酶α片断的一段基因，当M15缺失（△M15）时，lacZ基因虽然能表达ω片断，但不能表达α片断，β- 半乳糖苷酶没有活性。
当带有lacZ（α片断）基因的lac操纵子通过载体DNA（如pUC19 DNA）转化到lacZ△M15基因型的细胞(如E.coli JM109）时，在有IPTG (异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 存在的情况下, β-半乳糖苷酶表现出活性,它能分解X-gal (半乳糖类似物)，使其呈现蓝色。
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种常用的重组蛋白表达方法，具有以下特点：
1. 简单易用：大肠杆菌是一种常见的细菌，易于培养和操作。
其表达体系基于质粒介导的转化和表达，具有操作简单、成本低廉的优点。
2. 高表达水平：大肠杆菌表达体系能够实现高表达水平，通常可以达到10-50%的总蛋白含量。
这一特点使其成为生物制药和科学研究领域中最受欢迎的表达体系之一。
3. 多种表达宿主：大肠杆菌表达体系有多种表达宿主，包括
BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。
这些表达宿主具有不同的特点，能够适应不同的表达需求。
4. 可定制化：大肠杆菌表达体系可以通过基因工程技术进行改造，实现蛋白质的定制化表达。
例如，可以通过融合表达标签、选择性培养、调控表达等方式来优化表达效果。
5. 可用于生物制药：大肠杆菌表达体系可以用于制备多种蛋白药物，如重组人胰岛素、干扰素、白介素等。
这些蛋白药物已经被广泛应用于临床治疗和研究领域。
总之，大肠杆菌表达体系是一种快速、高效、可定制化的表达系统，已经成为蛋白质表达和生物制药领域中最常用的表达系统之一。
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pET-39b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-39b(+)编号 载体名称北京华越洋生物VECT5020 pET-‐39b(+)pET39b载体基本信息别名: pET39b, p et 39b质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 6106 b p5' 测序引物: T75' 测序引物序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'载体标签: His (中间和C端), N-‐DsbA, N-‐S, N-‐EK, N-‐Thrombin载体抗性: Kanamycin备注: Encodes D sb t ag f or e xport a nd p eriplasmic f olding o f t arget p roteins. 稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pET39b载体质粒图谱和多克隆位点信息Feature N ame Start EndT7_terminator 120 1T7_Terminal_primer 69 87EK 266 252S15 326 2826xHIS 386 369T7_transl_en_RBS 1056 1040lacO 1101 1074T7_promoter 1119 1101tet (300 -‐ 563) 1155 1418pBRrevBam_primer 1226 1207lacI 1501 2592tet (576 -‐ 851) 2651 2926ROP 3401 3592pGEX_3_primer 3608 3586pBR322_origin 4626 4007KanR2 4732 5547ORF Start EndORF f rame 3 1031 147ORF Start EndORF f rame 3 1032 1760ORF f rame 1 1633 2592ORF f rame 1 4732 5547Enzyme N ame CutXhoI 174NotI 182EagI 182HindIII 189SalI 195SacI 206EcoRI 208BamHI 214NcoI 227KpnI 271BstBI 301SacII 365SpeI 396AflII 418PstI 552AscI 917AgeI 928NdeI 1030XbaI 1068BclI 1874ApaI 2071FspI 2942NruI 4820pET39b载体简介The pET-‐39b(+) vector (Cat. No. 70090-‐3) is designed for expression of DsbA fusion proteins. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed o n t he c ircle m ap. T he cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single s tranded s equencing s hould b e p erformed u sing t he T7 t erminator p rimer (Cat. N o. 69337-‐3).pET39b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTTAGCAG CCTAGGTATT AATCAATTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTCGAGT181 GCGGCCGCAA GCTTGTCGAC GGAGCTCGAA TTCGGATCCG ATATCGCCAT GGTTGAGGAG 241 AAGCCCGGGC TCTTGTCGTC GTCATCGGTA CCCAGATCTG GGCTGTCCAT GTGCTGGCGT 301 TCGAATTTAG CAGCAGCGGT TTCTTTCATA CCAATTGCAG TACTACCGCG TGGCACCAGA 361 CCCGCGGAGT GATGGTGATG GTGATGACCA GAACCACTAG TTGATCCTTT TTTCTCGCTT 421 AAGTATTTCA CTGTATCAGC ATACTGCTGA ACAAAAACAT CCATATTGCT GGTATCCATA 481 CCCTGCGGAT TCAGCTGATA TTTACCGTTA ACAAACATCG CCGGAACGCC ACGCAATTGC 541 ACGTCAGCTG CAGCTTTTTC CTGCTGAGCG ACCAGAGATT TCACCACGAA GCTGTTCCAC 601 GCCGCGTCGT ACTCTTCACC TTTAATACCT GCGTTGATAA ATACATCGCG GATATCAGAA 661 GCAGAACGAA TGGTCTGGGT TTTCTGTACG CCTTCAAACA GCGGAACAGT CACTTTGTCT 721 TCCACGCCCA GCGCCATCGC CACAGCCCAT GCCTGAGTCA GATCTTTGCC CAGGTCACCA 781 CCCATGAAGT TGACGTGGTA TTTAGTCATC TTCACGCCTT CCGGCAGTTT TTTCTTCACA 841 TTATCAGAAA TATGCAGAAC TTCTTCAAAC TGATAGCAGT GCGGGCAGAA GAAAGAGAAA 901 AACTCCAGCA CTTGCGGCGC GCCAGCTACC GGTTTTTCCA GGGTAGTGTA CTGTTTACCA 961 TCTTCATACT GCGCCGCCGA TGCGCTAAAC GCTAAAACTA AACCAGCCAG CGCCAGCCAA 1021 ATCTTTTTCA TATGTATATC TCCTTCTTAA AGTTAAACAA AATTATTTCT AGAGGGGAAT 1081 TGTTATCCGC TCACAATTCC CCTATAGTGA GTCGTATTAA TTTCGCGGGA TCGAGATCGA 1141 TCTCGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG CCGGCATCAC CGGCGCCACA GGTGCGGTTG 1201 CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA 1261 TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG CAGGCCCCGT GGCCGGGGGA CTGTTGGGCG 1321 CCATCTCCTT GCATGCACCA TTCCTTGCGG CGGCGGTGCT CAACGGCCTC AACCTACTAC 1381 TGGGCTGCTT CCTAATGCAG GAGTCGCATA AGGGAGAGCG TCGAGATCCC GGACACCATC 1441 GAATGGCGCA AAACCTTTCG CGGTATGGCA TGATAGCGCC CGGAAGAGAG TCAATTCAGG 1501 GTGGTGAATG TGAAACCAGT AACGTTATAC GATGTCGCAG AGTATGCCGG TGTCTCTTAT 1561 CAGACCGTTT CCCGCGTGGT GAACCAGGCC AGCCACGTTT CTGCGAAAAC GCGGGAAAAA 1621 GTGGAAGCGG CGATGGCGGA GCTGAATTAC ATTCCCAACC GCGTGGCACA ACAACTGGCG 1681 GGCAAACAGT CGTTGCTGAT TGGCGTTGCC ACCTCCAGTC TGGCCCTGCA CGCGCCGTCG 1741 CAAATTGTCG CGGCGATTAA ATCTCGCGCC GATCAACTGG GTGCCAGCGT GGTGGTGTCG 1801 ATGGTAGAAC GAAGCGGCGT CGAAGCCTGT AAAGCGGCGG TGCACAATCT TCTCGCGCAA 1861 CGCGTCAGTG GGCTGATCAT TAACTATCCG CTGGATGACC AGGATGCCAT TGCTGTGGAA 1921 GCTGCCTGCA CTAATGTTCC GGCGTTATTT CTTGATGTCT CTGACCAGAC ACCCATCAAC 1981 AGTATTATTT TCTCCCATGA AGACGGTACG CGACTGGGCG TGGAGCATCT GGTCGCATTG 2041 GGTCACCAGC AAATCGCGCT GTTAGCGGGC CCATTAAGTT CTGTCTCGGC GCGTCTGCGT 2101 CTGGCTGGCT GGCATAAATA TCTCACTCGC AATCAAATTC AGCCGATAGC GGAACGGGAA 2161 GGCGACTGGA GTGCCATGTC CGGTTTTCAA CAAACCATGC AAATGCTGAA TGAGGGCATC 2221 GTTCCCACTG CGATGCTGGT TGCCAACGAT CAGATGGCGC TGGGCGCAAT GCGCGCCATT 2281 ACCGAGTCCG GGCTGCGCGT TGGTGCGGAC ATCTCGGTAG TGGGATACGA CGATACCGAA 2341 GACAGCTCAT GTTATATCCC GCCGTTAACC ACCATCAAAC AGGATTTTCG CCTGCTGGGG 2401 CAAACCAGCG TGGACCGCTT GCTGCAACTC TCTCAGGGCC AGGCGGTGAA GGGCAATCAG 2461 CTGTTGCCCG TCTCACTGGT GAAAAGAAAA ACCACCCTGG CGCCCAATAC GCAAACCGCC 2521 TCTCCCCGCG CGTTGGCCGA TTCATTAATG CAGCTGGCAC GACAGGTTTC CCGACTGGAA 2581 AGCGGGCAGT GAGCGCAACG CAATTAATGT AAGTTAGCTC ACTCATTAGG CACCGGGATC 2641 TCGACCGATG CCCTTGAGAG CCTTCAACCC AGTCAGCTCC TTCCGGTGGG CGCGGGGCAT 2701 GACTATCGTC GCCGCACTTA TGACTGTCTT CTTTATCATG CAACTCGTAG GACAGGTGCC 2761 GGCAGCGCTC TGGGTCATTT TCGGCGAGGA CCGCTTTCGC TGGAGCGCGA CGATGATCGG2821 CCTGTCGCTT GCGGTATTCG GAATCTTGCA CGCCCTCGCT CAAGCCTTCG TCACTGGTCC 2881 CGCCACCAAA CGTTTCGGCG AGAAGCAGGC CATTATCGCC GGCATGGCGG CCCCACGGGT 2941 GCGCATGATC GTGCTCCTGT CGTTGAGGAC CCGGCTAGGC TGGCGGGGTT GCCTTACTGG 3001 TTAGCAGAAT GAATCACCGA TACGCGAGCG AACGTGAAGC GACTGCTGCT GCAAAACGTC 3061 TGCGACCTGA GCAACAACAT GAATGGTCTT CGGTTTCCGT GTTTCGTAAA GTCTGGAAAC 3121 GCGGAAGTCA GCGCCCTGCA CCATTATGTT CCGGATCTGC ATCGCAGGAT GCTGCTGGCT 3181 ACCCTGTGGA ACACCTACAT CTGTATTAAC GAAGCGCTGG CATTGACCCT GAGTGATTTT 3241 TCTCTGGTCC CGCCGCATCC ATACCGCCAG TTGTTTACCC TCACAACGTT CCAGTAACCG 3301 GGCATGTTCA TCATCAGTAA CCCGTATCGT GAGCATCCTC TCTCGTTTCA TCGGTATCAT 3361 TACCCCCATG AACAGAAATC CCCCTTACAC GGAGGCATCA GTGACCAAAC AGGAAAAAAC 3421 CGCCCTTAAC ATGGCCCGCT TTATCAGAAG CCAGACATTA ACGCTTCTGG AGAAACTCAA 3481 CGAGCTGGAC GCGGATGAAC AGGCAGACAT CTGTGAATCG CTTCACGACC ACGCTGATGA 3541 GCTTTACCGC AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA 3601 GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA 3661 GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA 3721 TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC 3781 CATATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCT 3841 CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT 3901 CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA 3961 ACATGTGAGC AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT 4021 TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT 4081 GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC 4141 GCTCTCCTGT TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA 4201 GCGTGGCGCT TTCTCATAGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT 4261 CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA 4321 ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG 4381 GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC 4441 CTAACTACGG CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA 4501 CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG 4561 GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT 4621 TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG 4681 TCATGAACAA TAAAACTGTC TGCTTACATA AACAGTAATA CAAGGGGTGT TATGAGCCAT 4741 ATTCAACGGG AAACGTCTTG CTCTAGGCCG CGATTAAATT CCAACATGGA TGCTGATTTA 4801 TATGGGTATA AATGGGCTCG CGATAATGTC GGGCAATCAG GTGCGACAAT CTATCGATTG 4861 TATGGGAAGC CCGATGCGCC AGAGTTGTTT CTGAAACATG GCAAAGGTAG CGTTGCCAAT 4921 GATGTTACAG ATGAGATGGT CAGACTAAAC TGGCTGACGG AATTTATGCC TCTTCCGACC 4981 ATCAAGCATT TTATCCGTAC TCCTGATGAT GCATGGTTAC TCACCACTGC GATCCCCGGG 5041 AAAACAGCAT TCCAGGTATT AGAAGAATAT CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG 5101 CTGGCAGTGT TCCTGCGCCG GTTGCATTCG ATTCCTGTTT GTAATTGTCC TTTTAACAGC 5161 GATCGCGTAT TTCGTCTCGC TCAGGCGCAA TCACGAATGA ATAACGGTTT GGTTGATGCG 5221 AGTGATTTTG ATGACGAGCG TAATGGCTGG CCTGTTGAAC AAGTCTGGAA AGAAATGCAT 5281 AAACTTTTGC CATTCTCACC GGATTCAGTC GTCACTCATG GTGATTTCTC ACTTGATAAC 5341 CTTATTTTTG ACGAGGGGAA ATTAATAGGT TGTATTGATG TTGGACGAGT CGGAATCGCA 5401 GACCGATACC AGGATCTTGC CATCCTATGG AACTGCCTCG GTGAGTTTTC TCCTTCATTA5461 CAGAAACGGC TTTTTCAAAA ATATGGTATT GATAATCCTG ATATGAATAA ATTGCAGTTT 5521 CATTTGATGC TCGATGAGTT TTTCTAAGAA TTAATTCATG AGCGGATACA TATTTGAATG 5581 TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA 5641 AATTGTAAAC GTTAATATTT TGTTAAAATT CGCGTTAAAT TTTTGTTAAA TCAGCTCATT 5701 TTTTAACCAA TAGGCCGAAA TCGGCAAAAT CCCTTATAAA TCAAAAGAAT AGACCGAGAT 5761 AGGGTTGAGT GTTGTTCCAG TTTGGAACAA GAGTCCACTA TTAAAGAACG TGGACTCCAA 5821 CGTCAAAGGG CGAAAAACCG TCTATCAGGG CGATGGCCCA CTACGTGAAC CATCACCCTA 5881 ATCAAGTTTT TTGGGGTCGA GGTGCCGTAA AGCACTAAAT CGGAACCCTA AAGGGAGCCC 5941 CCGATTTAGA GCTTGACGGG GAAAGCCGGC GAACGTGGCG AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC 6001 GAAAGGAGCG GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC ACGCTGCGCG TAACCACCAC 6061 ACCCGCCGCG CTTAATGCGC CGCTACAGGG CGCGTCCCAT TCGCCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 CpTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+)pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTapKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
pBad gIII C大肠杆菌表达载体说明
pBad/gIII C编号 名称北京华越洋VECT-‐430 pBad/gIII CpBadgIII C载体基本信息载体名称: pBad/gIII C， pBadgIII C, p BadgIIIC. p Bad/gIIIC 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高启动子: araBad克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4149 b p5' 测序引物及序列: pBAD-‐F: A TGCCATAGCATTTTTATCC3' 测序引物及序列: pBAD-‐R: g atttaatctgtatcagg载体标签: N-‐GIII s ignal, C-‐His, C-‐Myc载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pBadgIII C载体质粒图谱和多克隆位点信息pBadgIII C载体简介pBAD/gIII载体质粒是衍生于pBR322载体。
载体设计用来在大肠杆菌中进行可调节分泌性表达和纯化重组目的蛋白。
使用基因III信号序列来定位重组蛋白，使其分泌到大肠杆菌周质腔中。
使用大肠杆菌araBAD启动子（pBAD）增强了大肠杆菌重组蛋白可溶性表达的水平。
载体上的调节蛋白AraC能够调控pBad启动子。
pBadgIII C载体序列 AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCA AACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACA AAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAG CATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACC CGTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTC TATAGCCATAGCACCATGGCGGCCGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA ACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAAC GGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGA AGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCA GAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCA AATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCT GAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACA AACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATG CTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAG CAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTT ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTA CTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGAT AAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGT ATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGT GCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAG TTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC GTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG TTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTA CAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGG GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT CGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCT GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGC AGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATT TCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGC TATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCAC CGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCT GTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTA CCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGG CCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGG CGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGA CGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGC TGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCA TCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCA GCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCT GGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGT AGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAA TCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCC CCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGAT AACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGAT CATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAG其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyan pDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPO pBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His C pBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+) pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐His pRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5xpTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+) PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis BpET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3XpGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99apET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KGpGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。
pET-21a(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-21a(+)编号 载体名称北京华越洋生物VECT4170 pET-‐21a(+)pET21a载体基本信息别名: pET21a, p et 21a质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5443bp5' 测序引物: T75' 测序引物序列: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'载体标签: N-‐T7, C-‐His载体抗性: Ampicillin备注: Same a s p ET24abcd(+) b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS; T he f1 o riginis o riented s o t hat i nfection w ith h elper p hage w ill p roduce v irionscontaining single-‐stranded DNA that corresponds to the codingstrand.稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pET21a载体质粒图谱和多克隆位点信息pET21a载体简介The pET-‐21a-‐d(+) vectors carry an N-‐terminal T7•Tag® sequence plus an optional C-‐terminal His•Tag® sequence. These vectors differ from pET-‐24a-‐d(+) only by their selectable marker (ampicillin vs. kanamycin resistance). Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed o n t he circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNApolymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage willproduce virions containing single-‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, s ingle-‐stranded s equencing s hould b e p erformed u sing t he T7 t erminator p rimer.pET21a载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGCGACCC ATTTGCTGTC CACCAGTCAT GCTAGCCATA241 TGTATATCTC CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC301 ACAATTCCCC TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC361 CGGACGCATC GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC421 CGACATCACC GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG481 CGTGGGTATG GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC541 ACCATTCCTT GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT601 GCAGGAGTCG CATAAGGGAG AGCGTCGAGA TCCCGGACAC CATCGAATGG CGCAAAACCT661 TTCGCGGTAT GGCATGATAG CGCCCGGAAG AGAGTCAATT CAGGGTGGTG AATGTGAAAC721 CAGTAACGTT ATACGATGTC GCAGAGTATG CCGGTGTCTC TTATCAGACC GTTTCCCGCG781 TGGTGAACCA GGCCAGCCAC GTTTCTGCGA AAACGCGGGA AAAAGTGGAA GCGGCGATGG841 CGGAGCTGAA TTACATTCCC AACCGCGTGG CACAACAACT GGCGGGCAAA CAGTCGTTGC901 TGATTGGCGT TGCCACCTCC AGTCTGGCCC TGCACGCGCC GTCGCAAATT GTCGCGGCGA961 TTAAATCTCG CGCCGATCAA CTGGGTGCCA GCGTGGTGGT GTCGATGGTA GAACGAAGCG1021 GCGTCGAAGC CTGTAAAGCG GCGGTGCACA ATCTTCTCGC GCAACGCGTC AGTGGGCTGA1081 TCATTAACTA TCCGCTGGAT GACCAGGATG CCATTGCTGT GGAAGCTGCC TGCACTAATG1141 TTCCGGCGTT ATTTCTTGAT GTCTCTGACC AGACACCCAT CAACAGTATT ATTTTCTCCC1201 ATGAAGACGG TACGCGACTG GGCGTGGAGC ATCTGGTCGC ATTGGGTCAC CAGCAAATCG1261 CGCTGTTAGC GGGCCCATTA AGTTCTGTCT CGGCGCGTCT GCGTCTGGCT GGCTGGCATA1321 AATATCTCAC TCGCAATCAA ATTCAGCCGA TAGCGGAACG GGAAGGCGAC TGGAGTGCCA1381 TGTCCGGTTT TCAACAAACC ATGCAAATGC TGAATGAGGG CATCGTTCCC ACTGCGATGC1441 TGGTTGCCAA CGATCAGATG GCGCTGGGCG CAATGCGCGC CATTACCGAG TCCGGGCTGC1501 GCGTTGGTGC GGATATCTCG GTAGTGGGAT ACGACGATAC CGAAGACAGC TCATGTTATA1561 TCCCGCCGTT AACCACCATC AAACAGGATT TTCGCCTGCT GGGGCAAACC AGCGTGGACC1621 GCTTGCTGCA ACTCTCTCAG GGCCAGGCGG TGAAGGGCAA TCAGCTGTTG CCCGTCTCAC1681 TGGTGAAAAG AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG1741 CCGATTCATT AATGCAGCTG GCACGACAGG TTTCCCGACT GGAAAGCGGG CAGTGAGCGC1801 AACGCAATTA ATGTAAGTTA GCTCACTCAT TAGGCACCGG GATCTCGACC GATGCCCTTG1861 AGAGCCTTCA ACCCAGTCAG CTCCTTCCGG TGGGCGCGGG GCATGACTAT CGTCGCCGCA1921 CTTATGACTG TCTTCTTTAT CATGCAACTC GTAGGACAGG TGCCGGCAGC GCTCTGGGTC1981 ATTTTCGGCG AGGACCGCTT TCGCTGGAGC GCGACGATGA TCGGCCTGTC GCTTGCGGTA2041 TTCGGAATCT TGCACGCCCT CGCTCAAGCC TTCGTCACTG GTCCCGCCAC CAAACGTTTC2101 GGCGAGAAGC AGGCCATTAT CGCCGGCATG GCGGCCCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC2161 CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA2221 CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA2281 ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC2341 TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT 2401 ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC 2461 ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA 2521 GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA 2581 AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC 2641 CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT 2701 GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC 2761 CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC 2821 ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT 2881 GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT 2941 GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG TACTGAGAGT GCACCATATA TGCGGTGTGA 3001 AATACCGCAC AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT 3061 CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC 3121 GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG 3181 CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG 3241 CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG 3301 ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC 3361 CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA 3421 TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT 3481 GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC 3541 CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG 3601 AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC 3661 TAGAAGGACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT 3721 TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA 3781 GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG 3841 GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA 3901 AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT 3961 ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC 4021 GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT 4081 ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC 4141 GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC 4201 TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG 4261 TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT GCAGGCATCG TGGTGTCACG 4321 CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG 4381 ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG 4441 TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT 4501 CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA 4561 ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC 4621 ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC 4681 AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC 4741 TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC 4801 CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA 4861 ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT 4921 TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGAAAT4981 TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT 5041 TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG 5101 GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT 5161 CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC 5221 AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG 5281 ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA 5341 AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC 5401 CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCCCATTCG CCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyan pDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMO pCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPO pBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His C pBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+) pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
pBV220大肠杆菌表达载体说明
pBV220⼤肠杆菌表达载体说明pBV220编号名称北京华越洋VECT--‐110 pBV220pBV220载体基本信息载体名称: pBV220质粒类型: 原核表达载体，温控型表达载体，热诱导表达载体⾼拷贝/低拷贝: ⾼拷贝启动⼦: pR/pL克隆⽅法: 多克隆位点，限制性内切酶载体⼤⼩: 3666 b p5' 测序引物及序列: pBV220--‐F: 5?′--‐AAGAAGGGCAGCATTCAAAG--‐3‘3' 测序引物及序列: pBV220--‐R: 5?′--‐CTGCGTTCTGATTTAATCTG--‐3‘载体标签: --‐--‐载体抗性: 氨苄筛选标记: --‐--‐备注: pBV220质粒的SD sequence（⽤于结合原核⽣物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插⼊带起始ATG的外源基因，可表达⾮融合蛋⽩。
载体含有强的转录终⽌⼦可防⽌出现"通读"现象，有利于质粒--‐宿主系统的稳定。
载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。
pBV220含有PL启动⼦和编码对该启动⼦具有抑制作⽤⽽⼜对温度敏感的cI蛋⽩基因cIts857调控基因cI，因此可⽤温度对插⼊其中的外源基因的转录进⾏调控。
温控型原核表达载体，⾼拷贝数，⼤容量，强启动⼦，强转录终⽌⼦，可在任何受体菌中诱导表达。
pBV220载体是λPL/PR--‐cI857温度敏感系统表达载体，能够在42 表达⾮融合的⽬的蛋⽩。
在利⽤pBV220载体进⾏质粒构建的时候，需要加⼊ATG起始密码⼦。
PBV220质粒属于温度诱导表达型，培养温度为30 ，诱导温度为42 。
稳定性: 诱导表达组成型: ⾮组成型病毒/⾮病毒: ⾮病毒pBV220载体质粒图谱和多克隆位点信息Ampr, 氨苄抗性基因;ori, 质粒复制起点;cIts857, lambda 噬菌体表达抑制基因，但是在热诱导条件下能够表达⽬的基因; PRPL, 来⾃于lambda 噬菌体的串联的PR和PL启动⼦，保证基因的⾼⽔平表达; SD, Shine-Dalgarno序列;rrnB, 核糖体rrnB基因，是基因转录终⽌信号;pBV220载体简介pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所⾃⾏构建的⼤肠杆菌温控表达载体,⽬前仍在⼴泛使⽤.pBV220载体序列ORIGIN1 GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTTCTGT TTTGGCTTAT GAGAGAAGAT 61 TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC 121 TCCCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG 181 TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA GCCAACTGCC AGGCATCAAA 241 TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA 301 ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC 361 CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG GCATCAAAGG AATCAGAAGG 421 CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT TTGTTTATTT TTCTAAATAC 481 ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA 541 AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT 601 TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 661 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA 721 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG 781 CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC 841 AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 901 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 961 TGACAACGAT CGGGAGGACCGAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT 1021 GTAACTCGCC TTGATCGTTG GGAACCGGAT CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT 1081 GACACCACGA TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA 1141 CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA 1201 CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT 1261 GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC 1321 GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT 1381 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA 1441 CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT 1501 GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC 1561 GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG 1621 CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT 1681 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG 1741 TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG 1801 CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC 1861 TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA 1921 CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCATTGA 1981 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC 2041 GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT 2101 GTCGGGTTTC GCCAACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG 2161 AGCCTATGGA AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT 2221 TTTGCTCACA TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC 2281 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC 2341 GAGGAAGCGG AAGAGCGCCC TTATCTTTCC CTTTATTTTT GCTGCGGTAA GTCGCATAAA 2401 AACCATTCTT其他⼤肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET--‐52b(+) pAmCyan pDsRed--‐Express2 pBV220 pCold--‐GST pColdS--‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE--‐SUMO pCold--‐ProS2 pBAD102/D--‐TOPO pBAD202/D--‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio--‐TOPO pBad/Myc--‐His C pBad/Myc--‐His B pBad/Myc--‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD--‐TOPO pET--‐23b(+) pET--‐23a(+) pET--‐23c(+) pET--‐23(+) pET--‐12b(+) pET--‐12c(+)pET--‐12a(+) pET--‐11b(+) pET--‐11a(+) pET--‐11c(+) pBad24 pQE--‐82L pQE--‐81L pQE--‐80LpQE--‐32 pQE--‐9 pQE--‐16 pQE--‐31pQE--‐60 pQE--‐70 pQE--‐40 pET--‐51b(+)pET--‐50b(+) pET--‐49b(+) pET--‐48b(+) pET--‐47b(+)pET--‐26b(+) pET--‐32a(+) pET--‐21b(+) pET--‐22b(+)pET--‐14b pET--‐16b pET--‐15b pET--‐19bpET--‐20b(+) pET--‐21d(+) pET--‐21c(+) pET--‐21b(+)pET--‐21a(+) pET--‐24a(+) pET--‐24d(+) pET--‐25b(+)pET--‐27b(+) pET--‐28a(+) pET--‐30a(+) pET--‐42a(+)pET--‐43.1c(+) pET--‐43.1b(+) pET--‐43.1a(+) pET--‐44a(+)pET--‐44c(+) pET--‐46 E K/LIC pET--‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT--‐His pET302/NT--‐His pRSET--‐CFP pRSET--‐EmGFP pRSET--‐BFP pGFPuvpET300/NT--‐DEST pET301/CT--‐DEST pGEM--‐T pBad43pGEX--‐4T--‐3 pGEX--‐5X--‐2 pBlueScript S K(+) pG--‐Tf2pG--‐KJE8 pGro7 pET--‐SUMO pSE380pET--‐17b pET102/D--‐TOPO pCDFDuet--‐1 pMAL--‐p5xpTf16 pET--‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET--‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(--‐) pTYB12pMAL--‐p5e pACYCDuet--‐1 pEGM--‐11ZF(+) pEGM--‐7ZF(+) PinPoint X a--‐3 PinPoint X a--‐2 PinPoint X a--‐1 pSP73 pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET--‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET--‐5a(+) pMal--‐p4X pMal--‐p2G pkk223--‐3pkk232--‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL--‐c5x pMal--‐p2E pMal--‐p2X pET--‐44 E K/LIC pET--‐43.1 E K/LIC pET--‐41 E K/LIC pMal--‐c4X pTrcHis BpET--‐31b(+) pET--‐3b(+) pET--‐41a(+) pGEX--‐3XpGEX--‐4T--‐2 pETDuet--‐1 pGEX--‐4T--‐1 pTrc99apET--‐28b(+) pET--‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli--‐6xHN--‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX--‐KGpGEX--‐2T pRSFDuet--‐1 pCOLADuet--‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET--‐41b(+) pET--‐42b(+) pET--‐3a(+) pGEX--‐6P--‐3 pGEX--‐6P--‐2 pGEX--‐6P--‐1 pGEX--‐5X--‐3 pGEX--‐5X--‐1 pGEX--‐2TK pRSET A pMal--‐c2G pMal--‐c2E pMal--‐c2X pRSET C pQE--‐30pET--‐45b(+) pET--‐44b(+) pET--‐42c(+) pET--‐41c(+) pET--‐40b(+) pET--‐33b(+) pET--‐39b(+) pET--‐32 E K/LIC pET--‐32 X a/LIC pET--‐32c(+) pET--‐32b(+) pET--‐30 X a/LIC pET--‐30 E K/LIC pET--‐30c(+) pET--‐29c(+) pET--‐29b(+) pET--‐29a(+) pET--‐24c(+) pET--‐24b(+) pET--‐24(+) pET--‐23d(+) pET--‐11d(+) pBad33。
大肠杆菌表达
大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。
大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。
本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。
大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。
表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。
启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。
参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。
大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。
2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。
3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。
4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。
5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。
大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。
2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。
3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。
4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。
总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。
重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定
重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定欧阳东云;徐丽慧;高琦;郭贺;陈清;何贤辉【摘要】中性氨基酸转运蛋白(ASCT2)是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,ECL2是该受体的其中一个较大的胞外结构域.通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的胞外区ECL2序列,与pET-41b连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白在N-和C-端分别融合谷胱甘肽转移酶(GST)和His6标签,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,具有结合合胞素的潜在活性,这些结果为进一步研究ASCT2与合胞素的相互作用奠定了基础.【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2010(014)003【总页数】6页(P213-218)【关键词】合胞素;中性氨基酸转运蛋白;胞外结构域;原核表达【作者】欧阳东云;徐丽慧;高琦;郭贺;陈清;何贤辉【作者单位】暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学生物工程研究所,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q786人类内源性病毒（human endogenous retroviruses，HERV）是远古逆转录病毒在人类基因组中的遗迹，约占人类基因组总量的8%.与今天仍然活跃的逆转录病毒一样，一个典型的人类内源性病毒也有必需的gag，pol和env 3个基因.这3个基因的两端被长末端重复序列（LTRs）分隔［1］.合胞素（syncytin）是HERV-W家族的包膜蛋白，主要表达于滋养层和合胞滋养层界面，一般认为由它介导单核的滋养层细胞融合，形成合胞滋养层，因此与胎盘形成和维持有关［2，3］.但近年亦发现该基因表达于乳腺癌［4］和结肠直肠癌［5］等细胞表面.尽管合胞素的表达与肿瘤形成的关系尚不清楚，至少人们相信合胞素可能具有潜在的早期诊断价值.现推测其可能的作用为：1）协助肿瘤细胞免疫逃逸.人免疫缺陷病毒（HIV-1）的gp41存在一个17肽，与C型病毒和D型病毒中的一段保守序列有同源性，具有免疫抑制功能［6］.有意思的是，相似的序列也存在于合胞素中（氨基酸残基373-397）［3］.表达HERV-H包膜蛋白的转基因小鼠细胞，能够在同种异基因小鼠体内成瘤，逃避宿主的免疫排斥［7］；2）与相邻的正常细胞表面受体相互作用，有利于肿瘤细胞的迁移.现已发现，合胞素的受体为D型逆转录病毒受体，即中性氨基酸转运蛋白ASCT2和ASCT1［2］.合胞素包裹的假HIV病毒颗粒，可以通过其受体，进入CD4阴性细胞，可能是造成母婴传播的部分原因.此外，表达合胞素的癌变细胞，也可以通过其受体与相邻的正常细胞（如内皮细胞）［8］相互融合.但是，癌变细胞与正常细胞通过合胞素及其受体而相互融合，对于肿瘤发生的影响，也还存在争论.一种观点认为癌变细胞可以籍此获得p53和Rb等肿瘤抑制因子，抑制癌变细胞向恶性肿瘤发展，或走向凋亡；另一种观点则刚好相反，毕竟大家熟知的单克隆抗体的制备就是将产生抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，由此产生的杂交瘤细胞仍然具有永生能力.研究表明合胞素抗体、合胞素CHR肽段以及合胞素基因的反义核苷酸都可抑制细胞通过合胞素及其受体相互融合［9］.深入研究合胞素的表达及其与受体的相互作用，在临床上具有重要的意义.合胞素有可能成为抑制乳腺癌和结肠直肠癌的药物靶点，可能的途径包括通过受体或单克隆抗体封闭细胞表面合胞素，通过受体/抗体介导抗肿瘤药物或者通过受体/抗体介导细胞毒淋巴细胞对癌变细胞的杀伤作用.蛋白质分析表明，由541个氨基酸组成的合胞素受体ASCT2，有9个跨膜结构域.我们在大肠杆菌中表达和纯化了ASCT2其中一个主要的胞外结构域ECL2蛋白，为研究ASCT2与合胞素之间的相互作用奠定了基础.大肠肝菌DH5α、BL21（DE3）pLysS菌株和质粒pET-41b购自Novagen.小鼠抗His6抗体、TRIzol试剂购自Invitrogen公司.第一链cDNA的合成试剂盒（PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit，D6110）、蛋白质分子质量标准、DNA分子质量标准以及EcoRⅠ和XhoⅠ等内切酶为Takara公司（大连）产品.GSH-Agarose及二氨基联苯胺（DAB）为Sigma公司产品.辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠 IgG为 Jackson Immune Research产品（北京中山分装）.pEGFPN1为CLONTECH公司产品，本实验室保存.1.2.1 细胞培养及总RNA的提取人乳腺癌细胞MCF-7用RPMI-1640加10%胎牛血清常规培养，每周传代2次，至对数生长期时，收集1×107个细胞，按厂商说明书，用TRIzol试剂提取总RNA，电泳检测后，立即用于第一链cDNA的合成.1.2.2 pET-41b/ECL2表达载体的构建首先从MCF-7第一链cDNA中扩增包含ASCT2基因编码区全序列的DNA片段.上游引物为5′-GTG CTG TTA CTC AAC TCA GTC CT-3′，下游引物为5′-TCC ATT CCT CAT AAT CCA GTG T-3′.PCR反应条件为：94℃，1 min；98℃，10 s，68℃，2.5 min，35个循环；68℃，10 min；4℃保存.扩增产物理论大小为1 794 bp.然后用上游引物5′-T ATA CTC GAG GCC Acc ATG GTG GCC GAT CCT CCA CGA GAC TCC AAG GGG CTC G-3′，下游引物5′-G CCG AAT TCG CAT GAC TGA TTC CTT CTC AGA GG-3′，同样PCR条件扩增ASCT2基因全序列，扩增产物为1 649 bp.然后将扩增的DNA，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶，克隆至pEGFP-N1真核表达载体（pEGFP/ASCT2）.ASCT2胞外结构域ECL2，采用下列引物，直接从pEGFP/ASCT2中进行扩增，上游引物为5′-TAT GAA TTC TCT GCA GCC GGG CGC CGC CT-3′，下游引物为5′-TAT TCT CGA GGC TAC CCT CCA CCT CCT GCC CCA CGG GCA-3′，PCR反应条件为：94℃，1 min；98℃，10 s，68℃，1 min，35个循环；68℃，10 min；4℃保存.产物理论大小为251 bp.1.2.3 重组ECL2在大肠杆菌中表达PCR产物经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，与同样酶切的pET-41b连接（pET-41b/ECL2），转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定接入预期大小外源基因的转化子，送Invitrogen公司测序确认.测序正确的pET-41b/ECL2质粒，转化感受态BL21（DE3）pLysS细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃摇菌，并以0.2 mmol/L IPTG诱导外源基因表达.1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳参照文献［10］方法，收集处理菌液.超声破菌处理后得到的全菌、上清和沉淀样品（上样量为80 μg），经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶50 g/L，分离胶120 g/L SDS-PAGE），分别以考马斯亮蓝R-250染色和硝酸纤维素膜免疫印迹方法，分析目的蛋白条带.免疫印迹分析所用一抗为抗His6抗体（1∶3 300），二抗为羊抗鼠IgG（1∶3 000），二氨基联苯胺显色.1.2.5 蛋白质纯化融合表达GST标签的 ECL2蛋白以GSHAgarose柱（1 mL）进行纯化.超声破菌处理后得到的上清液，直接上PBS平衡的柱，以PBS-1% Triton X-100充分洗涤后，特异性结合的蛋白以3 mL含10 mmol/L还原型谷胱甘肽的PBS洗脱下来，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后超滤浓缩，并将缓冲液置换为PBS，快速冷冻后置-70℃保存备用.1.2.6 结合活性测定MCF-7细胞按每孔7 500个细胞接种于96孔板，培养48 h后，PBS-1%FCS洗2次，加入200 μL 0.1%NaN3的PBS孵育30 min，同上洗后加入50 μL不同浓度的ECL2或GST蛋白（带His6标签，每个浓度做3个复孔），于室温孵育3 h 后4℃过夜，洗后加入100 μL抗His6抗体（1∶3 000），二抗为HRP-羊抗鼠IgG（1∶3 000），邻苯二胺显色，以酶标仪（Bio-Rad Microplate Reader 680）读取490 nm光吸收值.数据以非配对t检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义.用RT-PCR的方法克隆ASCT2基因分两步进行.首先设计引物，分别对应ASCT2基因上游和下游的一段cDNA序列，并以从MCF-7细胞总RNA逆转录获得的第一链cDNA为模板，扩增出预计大小（1 794 bp）的DNA片段（图1，泳道1）.然后以此为模板，扩增ASCT2基因自起始密码子至终止密码子（不含）的DNA片段，电泳检测显示，扩增片段大小与预计大小相符（1 649 bp，含引物两端附加的酶切位点）.产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，与pEGFP-N1载体连接，转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选多个抗性单克隆，提取质粒后经双酶切鉴定，证明已插入预计大小的外源基因（图1，泳道2、3、4）.测序分析显示，这3个克隆插入的外源基因序列完全相同，表明已成功获得ASCT2基因的cDNA编码区全长序列，该序列已在GenBank登录，登录号为GQ919058.利用跨膜结构蛋白分析工具（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/，http：//phobius.sbc.su.se）分析表明，ASCT2为9次跨膜蛋白，其中153～227位氨基酸为其中一个较大的胞外结构域（ECL2）.以克隆的 ASCT2全长序列（pEGFP/ ASCT2）为模板，设计特异性引物，扩增ECL2序列.电泳分析表明，扩增片段大小与预期相符（251 bp）（图2，泳道1）.产物经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，与pET-41b载体（图2，泳道2）连接.筛选接入目的片段的阳性克隆（图2，泳道4），经测序验证插入序列为ECL2目的片段，其5′端融合谷胱甘肽-S-转移酶（GST）编码序列，3′端含编码甘氨酸-丝氨酸接头（引物来源）和编码6个组氨酸（质粒来源）序列，由此获得原核表达载体pET-41b/ECL2.将构建的pET-41b/ECL2原核表达载体转化E.coli BL21（DE3）pLysS，得到含重组质粒的基因工程菌.细菌在37℃条件下摇菌培养，至OD值约0.6时，加IPTG诱导5 h后，超声破菌，分别制备全菌、上清、沉淀样品.各样品经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色表明，未经IPTG诱导的工程菌不表达外源蛋白；经IPTG诱导后，分别在全菌、上清和沉淀样品中，均可检出分子质量约为45 kD的外源蛋白，与ECL2融合蛋白（含上游GST和下游His6标签）理论值相符（图3a）.对比诱导前后蛋白条带（全菌）的变化，并经法国VL公司PhotoCapt Ver11.01软件分析，外源蛋白表达仅占细菌总蛋白量的3.5%.免疫印迹分析进一步证明上述45 kD蛋白条带为带有His6标签的ECL2（图3b）.表达的外源蛋白同时存在于上清和沉淀样品中，说明该融合蛋白能可溶性表达，但有较大部分以包涵体的形式存在.将表达可溶性ECL2融合蛋白的上清液部分上GSH-Agarose柱，充分洗柱后，以10 mmol/L还原型谷胱甘肽将结合的蛋白从柱上洗脱下来，SDS-PAGE分析显示，获得的蛋白分子质量与ECL2融合蛋白相符，纯度为95%（图4，泳道1）.进一步以免疫印迹分析，显示蛋白含有His6标签（图4，泳道3）.利用表达合胞素的MCF-7细胞分析ECL2融合蛋白与合胞素的结合活性.文献报道［8］，合胞素蛋白表达于MCF-7细胞表面.我们通过RTPCR的方法也检出该细胞转录较高水平的mRNA（数据略）.ECL2蛋白与MCF-7结合活性见图5，结果显示ECL2能与MCF-7特异性结合，其活性明显高于GST蛋白.人类内源性病毒（HERV）是古代逆转录病毒感染，进入人类基因组，并通过生殖细胞遗传至今.由于突变产生的序列缺失或提前终止，大多数人类内源性病毒的基因已失去了翻译活性［11］.但是，也有些基因，如HERV-W家族的包膜蛋白基因（env），仍然保留了完整的开放读码框，其编码的蛋白，具有细胞融合功能，故称为合胞素（syncytin）.合胞素主要表达于胎盘组织，少量表达于睾丸，前者可能与合胞滋养层的形成有关，后者可能与精卵结合有关.通过体外诱导（如毛喉素（forskolin）刺激BeWo细胞）［12］或转染（如中国仓鼠细胞）［13］而表达合胞素基因的细胞，都可以与受体细胞融合.在缺氧环境下，合胞素基因的表达下降，细胞滋养层不能正常融合发育成合胞体滋养层，引起先兆子痫（pre-eclampsia）［14］.因此，人们推测合胞素的主要生理功能可能有两个，一是促使细胞滋养层融合，形成合胞滋养层，为胎儿提供一个发育的环境，二是抑制母体免疫系统的排斥，因为合胞素蛋白中含有一个具有免疫抑制功能的多肽片段.合胞素在人体中的表达受到严格的调控，是一个有高度组织特异性的表达基因.该基因十分保守.HERV-W家族作为内源性病毒固定于人类基因组的时间大概是2 500万年到4 000万年前，早于新大陆猴与旧大陆猴的分化［15］，但该基因的转录仅限于人类，而不在旧大陆猴体内表达［16］.我们分别从正常胎盘组织和乳腺癌MCF-7细胞中克隆的合胞素基因序列，均与GenBank报道的序列完全相同.目前也尚未见到有该基因序列突变的报道.人们有理由相信，该基因的异常表达，可能会引起灾难性的后果.现已发现，合胞素高表达于绒癌、乳腺癌、直肠癌等癌细胞［4，5］.转基因表达合胞素的仓鼠CHO-52细胞，可以抵御药物诱导的凋亡［13］.可以预见，合胞素基因在癌症发病机制中的作用，将成为研究的热点.我们以前的研究表明，CD40的胞外区即具有与其天然配体CD40L的结合活性［10］.有研究发现，在小鼠移植模型中，可溶性的CD40-Ig对移植物抗宿主病的发生具有明显的保护作用［17］，而转基因表达的CD40-Ig的胰岛异种移植物的存活时间大大延长［18］，说明可溶性CD40-Ig能有效阻断CD40-CD40L的相互作用而发挥抑制对移植物的排斥反应.利用膜蛋白的天然配体的胞外区，阻断配体的细胞信号传导，其突出优点是不会因为诱导抗体而削弱两者之间的相互结合. 合胞素介导细胞之间的相互融合，可能是与其受体ASCT2（以及ASCT1）之间相互作用的结果.通过膜蛋白分析，ECL2和C-末端是ASCT2的两个较大的胞外区.克隆这两个片段，可用于研究合胞素和受体之间的相互作用.由于ECL2仅有75个氨基酸，为尽量保持其天然构象，同时有利于分离纯化，我们将它的氨基端与谷胱甘肽转移酶偶联，在羧基端与6个组氨酸（His6）偶联.用His6抗体检测重组蛋白，分别在细菌裂解液上清和沉淀检出45 kD的清晰条带，说明重组蛋白在一定条件下可以可溶性表达.重组蛋白的可溶性表达，有利于保持蛋白的天然构象，也有利于后期重组蛋白的活性和功能检测.乳腺癌细胞MCF-7组成性表达合胞素［8］，因此可用于检测ECL2蛋白与合胞素的结合活性.我们的结果显示，ECL2蛋白与MCF-7具有明显的结合活性，提示ASCT2主要胞外区ECL2可能是与合胞素结合的主要部位.进一步的研究将通过定点突变等技术阐明ASCT2上参与结合的具体位点和氨基酸残基.总之，我们从人乳腺癌细胞中成功克隆了ASCT2的cDNA编码区全长序列，构建了该蛋白的ECL2胞外区原核表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，纯化产物具有与合胞素结合的潜在活性.这些结果为进一步研究该胞外区的活性和功能提供了条件.【相关文献】[1] BANNERT N，KURTH R.Retroelements and the human genome：new perspectives on an old relation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（Suppl 2）：14572-14579.[2] BLOND J L，LAVILLETTE D，CHEYNET V，et al.An envelope glycoprotein of the human endogenous retrovirus HERV-W is expressed in the human placenta and fuses cells expressing the type D mammalian retrovirus receptor[J].J Virol，2000，74（7）：3321-3329.[3] MI S，LEE X，LI X，et al.Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis [J].Nature，2000，403（6771）：785-789.[4] LARSSON L I，HOLCK S，CHRISTENSEN I J.Prognostic role of syncytin expression in breast cancer[J].Hum 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Syncytin immunoreactivity in colorectal cancer：potential prognostic impact[J].Cancer Lett，2009，280（1）：44-49.[6]DENNER J，NORLEY S，KURTH R.The immunosuppressive peptide of HIV-1：functional domains and immune response in AIDS patients[J].AIDS，1994，8（8）：1063-1072.[7] MANGENEY M，de PARSEVAL N，THOMAS G，et al.The full-length envelopeofanHERV-H humanendogenous retrovirus has immunosuppressive properties[J].J Gen Virol，2001，82（Pt 10）：2515-2518.[8] BJERREGAARD B，HOLCK S，CHRISTENSEN I J，et al. Syncytin is involved in breast cancer-endothelial cell fusions [J].Cell Mol Life Sci，2006，63（16）：1906-1911.[9] LARSSON L I，BJERREGAARD B，TALTS J F.Cell fusions in mammals[J].Histochem Cell Biol，2008，129（5）：551-561.[10]何贤辉，徐丽慧，刘毅，等.重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定[J].免疫学杂志（HE Xian-hui，XU Li-hui，Liu Yi，et al.Purification and identification of human CD40 extracellular domain expressed in Escherichia coli[J].Immunol J），2006，22（2）：195-198.[11]LÖWER R，LÖWER J，KURTH R.The viruses in all of us：characteristics and biologicalsignificance of human endogenous retrovirus sequences[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（11）：5177-5184.[12]KUDO Y，BOYD C A.Changes in expression and function of syncytin and its receptor，amino acid transport system B（0）（ASCT2），in human placental choriocarcinoma BeWo cells during syncytialization[J].Placenta，2002，23（7）：536-541.[13]KNERR I，SCHNARE M，HERMANN K，et al.Fusiogenic endogenous-retroviral syncytin-1 exerts anti-apoptotic functions in staurosporine-challenged CHOcells[J].Apoptosis，2007，12（1）：37-43.[14]LEE X，KEITH J C Jr，STUMM N，et al.Downregulation of placental syncytin expression and abnormal protein localization in pre-eclampsia[J].Placenta，2001，22（10）：808-812.[15]VOISSET C，BLANCHER A，PERRON H，et al.Phylogeny of a novel family of human endogenous retrovirus sequences，HERV-W，in humans and other primates[J].AIDS Res Hum Retroviruses，1999，15（17）：1529-1533.[16]CÁCERES M，NISC ComparativeSequencingProgram，THOMAS J W.The gene of retroviral origin Syncytin 1 is specific to hominoids and is inactive in Old World monkeys [J].J Hered，2006，97（2）：100-106.[17]LIU H，MAO N，HOU C，et al.Protective effect of human CD402Ig fusion protein in a murine model of acute graftversus-host disease[J].Chin Med J（Engl），2001，114（7）：685-689.[18]JIN Y Z，XIE S S.Bicistronic adenovirus-mediated gene transfer of CTLA4Ig gene and CD40Ig gene result in indefinite survival of islet xenograft[J].Transplant Proc，2003，35（8）：3165-3166.。
pET-28b(+)载体
pET-28b（+）载体（基本信息、图谱和多克隆位点信息、简介、序列）1.pET28a载体基本信息：质粒类型：大肠杆菌表达载体表达水平：高克隆方法：多克隆位点，限制性内切酶载体大小：5368bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'载体标签: N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His载体抗性：Kanamycin (卡那霉素)N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处病毒类型：非病毒2.pET28a载体质粒图谱和多克隆位点信息：3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。
pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。
注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。
T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。
质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白翻译。
3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处载体描述：The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal His•Tag®/ thrombin/ T7•Tag® configuration plus an optional C-terminal His•Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containingsingle-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).PET-28a-c(+) 向量进行 N-末端His•Tag® / 凝血酶/ T7•Tag® 配置再加上可选的 C-末端His•Tag 序列。
载体介绍
8
λ噬菌体载体举例：λgt10 载体
9
λ噬菌体载体举例：λEMBL3
10
λ噬菌体载体主要特点
主要有如下特点： (1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大
仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建，也经常用 于外源目的基因的克隆。
贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷
贝数多（10-200个）。
32
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型（conjugative plasmid) 非接合型（non-conjugative plasmid)
2. F质粒(y factor)
4.高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于30kb）。
15
噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载 体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
16
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
17
pUC118 (MCS)
pUC119 (MCS)
puC118和 pUC119噬 菌粒载体 的分子结 构
30
质粒给宿主细胞的标记
1.氨苄青霉素 (Ampicillin ) 2.卡那霉素 (Kanamycin) 3. 四环素（Tetracycline） 4. 氯霉素(Chloramphenicol) 5. 链霉素（Streptomycin） 6. 潮霉素（Hygromycin ）
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质粒的复制类型
据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为： 1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷
pG-KJE8大肠杆菌表达载体说明
pG-KJE8编号 载体名称北京华越洋生物VECT4250 pG-‐KJE8pG-‐KJE8载体基本信息载体名称: pG-‐KJE8质粒类型: Chaperone P lasmid分子伴侣质粒 高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: -‐-‐克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 11.1kb5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: chloromycetin筛选标记: Tetracycline备注: -‐-‐稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: -‐-‐pG-‐KJE8载体质粒图谱和多克隆位点信息其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyan pDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMO pCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPO pBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His C pBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+) pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。
利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。
本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。
一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。
选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。
2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。
3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。
可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。
4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。
通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。
二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。
这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。
2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。
通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。
3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。
通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。
4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。
将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。
5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。
通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。
大肠杆菌表达载体
pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
pGEX-3T---X因子
位相载体
西南大学生物技术专业 基因工程 14
分泌型融合表达载体----pEZZ18
西南大学生物技术专业 基因工程
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分泌型表达载体----pINIII-ompA1
西南大学生物技术专业 基因工程
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四、表达产物的纯化
1 、包涵体 (inclusion body) 的纯化：许多情况下表达产物 在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融 法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除 杂蛋白，用盐酸胍、尿素和 SDS 溶解包涵体，再通过一定 的法使蛋白质折叠。 有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后 就没有活性了，但可作为抗原。 2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内解物的上清部分用于 纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。
西南大学生物技术专业 基因工程 7
3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
西南大学生物技术专业 基因工程
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2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化●实验目的：1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。
●实验原理：1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。
IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。
3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。
组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。
组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化.4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC.酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。
一个新的erm家族分子的鉴定及对细胞形态的影响
分类号密级国际十进分类号（UDC）第四军医大学学位论文一个新的ERM家族分子的鉴定及对细胞形态的影响（题名和副题名）徐清（作者姓名）指导教师姓名张斌副教授指导教师单位第四军医大学生物化学与分子生物学教研室申请学位级别医学硕士专业名称生物化学与分子生物学论文提交日期2009.05答辩日期2009.05论文起止时间2006年8月至2009年5月学位授予单位第四军医大学独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。
论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。
本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。
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论文作者签名导师签名：日期：一个新的ERM家族分子的鉴定及对细胞形态的影响研究生：徐清学科专业：生物化学与分子生物学所在单位：第四军医大学导师：张斌副教授辅导教师：陈南春高级实验师资助基金项目：国家自然科学基金（30770420）全军医药卫生科研基金（06H036）关键词：人Ermin（hErmin）；少突胶质细胞；细胞骨架；胶质瘤；多克隆抗体中国人民解放军第四军医大学2009年05月目录缩略语表 (1)中文摘要 (2)ABSTRACT (4)前言 (6)文献回顾 (7)一、少突胶质细胞相关临床疾病 (7)（一）脱髓鞘疾病 (7)（二）胶质瘤 (8)二、少突胶质细胞的发育和分化 (10)（一）少突胶质细胞的起源和分化 (10)1、神经元和胶质细胞共同的前体细胞：多能干细胞 (11)2、VZ中的少突胶质前体细胞（precursor cell） (12)3、SVZ中的少突胶质细胞祖细胞 (12)4、少突胶质细胞迁移的机制 (13)5、少突胶质细胞的成熟阶段 (16)（二）少突胶质细胞发育所需的营养因子 (16)1、少突胶质细胞存活和成熟所必需的因子 (16)2、影响髓鞘形成的因子 (17)（三）少突胶质细胞的形态 (17)（四）少突胶质细胞的特异组分 (20)1、少突胶质细胞系成熟过程中的Marker (21)2、髓鞘标志物 (22)3、其它少突胶质细胞蛋白标志物 (23)（五）少突胶质的其它细胞生物学特性 (23)1、接触抑制作用 (23)2、调节神经元和胶质细胞的存活与功能 (24)3、构成神经网络 (24)三、本文研究的HERMIN分子 (25)正文 (27)实验一 (27)1 材料 (27)1.1主要仪器 (27)1.2主要试剂 (27)1.3实验动物 (27)2 方法 (28)2.1 hErmin160、hErmin 148原核表达载体的构建以及hErmin160蛋白的诱导和纯化 (28)2.2 hErmin160抗血清的制备和纯化 (30)3 结果 (31)3.1 hErmin160、hErmin148编码序列的扩增 (31)3.2表达载体pET41-b(+)-hErmin160、 pET41-b(+)-hErmin148的酶切鉴定和测序 (32)3.3 hErmin160融合蛋白的表达和纯化 (35)3.4 hErmin160融合蛋白的Western-blot鉴定 (35)3.5抗血清和纯化的hErmin160抗体的Western-blot 检测 (36)4 讨论 (37)4.1 hErmin160融合蛋白的表达 (37)4.2 hErmin160融合蛋白的纯化 (37)4.3抗hErmin160多克隆抗体的纯化 (38)实验二 (39)1 材料 (39)1.1主要仪器 (39)1.2主要试剂 (39)1.3组织标本 (39)2 方法 (40)2.1用纯化的抗体鉴定正常人脑组织中表达的hErmin分子 (40)2.2细胞免疫荧光法观察hErmin过表达对细胞形态的影响 (41)2.3免疫组织化学法检测胶质瘤石蜡切片中hErmin分子表达的特点413 结果 (41)3.1 hErmin真核表达载体的构建 (41)3.2 hErmin在正常人脑组织中的鉴定 (42)3.3 hErmin真核表达载体的转染和免疫荧光检测 (43)3.4 hErmin在人胶质瘤中的表达特点 (44)4 讨论 (45)4.1人脑少突胶质瘤中hErmin和Olig2表达的关系 (45)4.2 hErmin和其它ERM家族成员 (45)小结 (48)参考文献 (50)个人简历和研究成果 (57)致谢 (58)缩略语表缩略词英文全称中文全称CNP 2ˊ, 3ˊ-Cyclic Nucleotide 3ˊ-Phosphodiesterase2ˊ, 3ˊ-环核苷3ˊ-磷酸二酯酶DAB diaminobenzidine 二氨基联苯胺E.coli Escherichiacoli 大肠杆菌GFAP Glial fibrillary acidicprotein 胶质纤维酸性蛋白IPTG Isopropylthio-β-D-Galactoside 异丙基硫代β-D半乳糖苷MBP Myelin Basic Protein 髓鞘碱性蛋白Olig2 Oligodendrocyte lineage transcriptionfactor 2少突胶质细胞系转录因子2PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphatepolacrylamine gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SVZ subventricularzone 室下层VZ ventricularzone 室层-1-一个新的ERM家族分子的鉴定及对细胞形态的影响硕士研究生：徐清导师：张斌副教授第四军医大学生化教研室，西安 710032中文摘要目的制备抗hErmin氨基端160个氨基酸（hErmin160）多克隆抗体，鉴定hErmin分子在正常成人脑组织中的表达，以及研究hErmin对细胞形态的影响，为深入研究hErmin分子的功能奠定基础。
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pET-41b(+)编号 名称北京华越洋VECT-‐540 pET-‐41b(+)pET41b载体基本信息别名: pET41b, p ET 41b质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p5' 测序引物: T7或pGEX-‐5‘5' 测序引物序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'; pGEX-‐5': 5'-‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-‐3'载体标签: N-‐GST, N-‐His, N-‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin备注: Encodes GST fusion tag; Nterm thrombin cleavage site; Nterm enterokinase c leavage s ite; P shAI b lunt c loning s ite; a,b,c v ary b y M CS稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒pET41b载体质粒图谱和多克隆位点信息Feature N ame Start End T7_terminator 120 1 T7_Terminal_primer 69 87 EK 278 264 S15 353 309 6xHIS 413 396 GST (variant) 1094 444 T7_transl_en_RBS 1119 1103 lacO 1164 1137 T7_promoter 1182 1164 tet (300 -‐ 563) 1218 1481 pBRrevBam_primer 1289 1270 lacI 1564 2655 ROP3227 3418 pGEX_3_primer 3434 3412 pBR322_origin44523833Feature N ame Start EndKanR2 4558 5373ORF Start EndORF f rame 3 1094 147ORF f rame 3 1095 1823ORF f rame 1 1696 2655ORF f rame 1 4558 5373Enzyme N ame CutXhoI 174NotI 182EagI 182HindIII 189SalI 195SacI 206PstI 214AscI 216StuI 226EcoRI 235BamHI 241EcoRV 251NcoI 254AgeI 291KpnI 298BglII 301SacII 392SpeI 423MscI 886NdeI 1093XbaI 1131ApaI 2134HpaI 2429NruI 4646SmaI 4863XmaI 4861pET41b载体简介The pET-‐41 series is designed for cloning and high-‐level expression of peptide sequences fused with the 220 aa GST•Tag™ protein. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed o n t he circle m ap. T he c loning/expression r egion o f t he c oding s trand t ranscribed b y T7 R NA p olymerase is s hown b elow. T he f1 o rigin i s o riented s o t hat i nfection w ith h elper p hage w ill p roduce v irions containing s ingle s tranded D NA t hat c orresponds t o t he c oding s trand. T herefore, s ingle s trandedsequencing should be performed using the T7 terminator primer. Vector encoded sequence can be completely removed when cloning into the PshAI site and then cleaving the GST fusion protein w ith E nterokinase.pET41b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTTAGCAG CCTAGGTATT AATCAATTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTCGAGT 181 GCGGCCGCAA GCTTGTCGAC GGAGCTCGCC TGCAGGCGCG CCAAGGCCTG TACAGAATTC 241 GGATCCCCGA TATCCATGGG ACTCTTGTCG TCGTCATCAC CGGAGCCACC ACCGGTACCC 301 AGATCTGGGC TGTCCATGTG CTGGCGTTCG AATTTAGCAG CAGCGGTTTC TTTCATACCA 361 ATTGCAGTAC TACCGCGTGG CACCAGACCC GCGGAGTGAT GGTGATGGTG ATGACCAGAA 421 CCACTAGTTG AACCATCCGA TTTTGGAGGA TGGTCGCCAC CACCAAACGT GGCTTGCCAG 481 CCCTGCAAAG GCCATGCTAT ATACTTGCTG GATTTCAAGT ACTTATCAAT TTGTGGGATA 541 GCTTCAATAC GTTTTTTAAA ACAAACTAAT TTTGGGAACG CATCCAGGCA CATTGGGTCC 601 ATGTATAAAA CAACATCAAG AGCGTCATAC AACATGAAGT CAGGATGGGT TACATGATCA 661 CCATTTAAAT ATGTTTTATG ACATAAACGA TCTTCGAACA TTTTCAGCAT TTCAGGTAGC 721 TTGCTAAGAA AATCAACTTT GAGAGTTTCA AAGTCTTTAC TATATGCAAT TCTCGAAACA 781 CCGTATCTAA TATCCAAAAC CGCTCCTTCA AGCATTGAAA TCTCTGCACG CTCTTTTGGA 841 CAACCACCCA ACATGTTGTG CTTGTCAGCT ATATAACGTA TGATGGCCAT AGACTGTGTT 901 AATTTAACAT CACCATCAAT ATAATAAGGA AGATTGGGAA ACTCCAAACC CAATTCAAAC 961 TTTTTGTTTC GCCATTTATC ACCTTCATCG CGCTCATACA AATGCTCTTC ATATTTTTCT 1021 TCAAGATATT CCAAAAGAAG TCGAGTGGGT TGCACAAGGC CCTTAATTTT CCAATAACCT 1081 AGTATAGGGG ACATATGTAT ATCTCCTTCT TAAAGTTAAA CAAAATTATT TCTAGAGGGG 1141 AATTGTTATC CGCTCACAAT TCCCCTATAG TGAGTCGTAT TAATTTCGCG GGATCGAGAT 1201 CGATCTCGAT CCTCTACGCC GGACGCATCG TGGCCGGCAT CACCGGCGCC ACAGGTGCGG 1261 TTGCTGGCGC CTATATCGCC GACATCACCG ATGGGGAAGA TCGGGCTCGC CACTTCGGGC 1321 TCATGAGCGC TTGTTTCGGC GTGGGTATGG TGGCAGGCCC CGTGGCCGGG GGACTGTTGG 1381 GCGCCATCTC CTTGCATGCA CCATTCCTTG CGGCGGCGGT GCTCAACGGC CTCAACCTAC 1441 TACTGGGCTG CTTCCTAATG CAGGAGTCGC ATAAGGGAGA GCGTCGAGAT CCCGGACACC 1501 ATCGAATGGC GCAAAACCTT TCGCGGTATG GCATGATAGC GCCCGGAAGA GAGTCAATTC 1561 AGGGTGGTGA ATGTGAAACC AGTAACGTTA TACGATGTCG CAGAGTATGC CGGTGTCTCT 1621 TATCAGACCG TTTCCCGCGT GGTGAACCAG GCCAGCCACG TTTCTGCGAA AACGCGGGAA 1681 AAAGTGGAAG CGGCGATGGC GGAGCTGAAT TACATTCCCA ACCGCGTGGC ACAACAACTG 1741 GCGGGCAAAC AGTCGTTGCT GATTGGCGTT GCCACCTCCA GTCTGGCCCT GCACGCGCCG 1801 TCGCAAATTG TCGCGGCGAT TAAATCTCGC GCCGATCAAC TGGGTGCCAG CGTGGTGGTG 1861 TCGATGGTAG AACGAAGCGG CGTCGAAGCC TGTAAAGCGG CGGTGCACAA TCTTCTCGCG 1921 CAACGCGTCA GTGGGCTGAT CATTAACTAT CCGCTGGATG ACCAGGATGC CATTGCTGTG 1981 GAAGCTGCCT GCACTAATGT TCCGGCGTTA TTTCTTGATG TCTCTGACCA GACACCCATC 2041 AACAGTATTA TTTTCTCCCA TGAAGACGGT ACGCGACTGG GCGTGGAGCA TCTGGTCGCA 2101 TTGGGTCACC AGCAAATCGC GCTGTTAGCG GGCCCATTAA GTTCTGTCTC GGCGCGTCTG 2161 CGTCTGGCTG GCTGGCATAA ATATCTCACT CGCAATCAAA TTCAGCCGAT AGCGGAACGG 2221 GAAGGCGACT GGAGTGCCAT GTCCGGTTTT CAACAAACCA TGCAAATGCT GAATGAGGGC2281 ATCGTTCCCA CTGCGATGCT GGTTGCCAAC GATCAGATGG CGCTGGGCGC AATGCGCGCC 2341 ATTACCGAGT CCGGGCTGCG CGTTGGTGCG GACATCTCGG TAGTGGGATA CGACGATACC 2401 GAAGACAGCT CATGTTATAT CCCGCCGTTA ACCACCATCA AACAGGATTT TCGCCTGCTG 2461 GGGCAAACCA GCGTGGACCG CTTGCTGCAA CTCTCTCAGG GCCAGGCGGT GAAGGGCAAT 2521 CAGCTGTTGC CCGTCTCACT GGTGAAAAGA AAAACCACCC TGGCGCCCAA TACGCAAACC 2581 GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG 2641 GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA ACGCAATTAA TGTAAGTTAG CTCACTCATT AGGCACCGGG 2701 ATCTCGACCG ATGCCCTTGA GAGCCTTCAA CCCAGTCAGC TCCTTCCGGT GGGCGCGGGG 2761 CATGACTAGC ATGATCGTGC TCCTGTCGTT GAGGACCCGG CTAGGCTGGC GGGGTTGCCT 2821 TACTGGTTAG CAGAATGAAT CACCGATACG CGAGCGAACG TGAAGCGACT GCTGCTGCAA 2881 AACGTCTGCG ACCTGAGCAA CAACATGAAT GGTCTTCGGT TTCCGTGTTT CGTAAAGTCT 2941 GGAAACGCGG AAGTCAGCGC CCTGCACCAT TATGTTCCGG ATCTGCATCG CAGGATGCTG 3001 CTGGCTACCC TGTGGAACAC CTACATCTGT ATTAACGAAG CGCTGGCATT GACCCTGAGT 3061 GATTTTTCTC TGGTCCCGCC GCATCCATAC CGCCAGTTGT TTACCCTCAC AACGTTCCAG 3121 TAACCGGGCA TGTTCATCAT CAGTAACCCG TATCGTGAGC ATCCTCTCTC GTTTCATCGG 3181 TATCATTACC CCCATGAACA GAAATCCCCC TTACACGGAG GCATCAGTGA CCAAACAGGA 3241 AAAAACCGCC CTTAACATGG CCCGCTTTAT CAGAAGCCAG ACATTAACGC TTCTGGAGAA 3301 ACTCAACGAG CTGGACGCGG ATGAACAGGC AGACATCTGT GAATCGCTTC ACGACCACGC 3361 TGATGAGCTT TACCGCAGCT GCCTCGCGCG TTTCGGTGAT GACGGTGAAA ACCTCTGACA 3421 CATGCAGCTC CCGGAGACGG TCACAGCTTG TCTGTAAGCG GATGCCGGGA GCAGACAAGC 3481 CCGTCAGGGC GCGTCAGCGG GTGTTGGCGG GTGTCGGGGC GCAGCCATGA CCCAGTCACG 3541 TAGCGATAGC GGAGTGTATA CTGGCTTAAC TATGCGGCAT CAGAGCAGAT TGTACTGAGA 3601 GTGCACCATA TATGCGGTGT GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA 3661 GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG 3721 CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG GATAACGCAG 3781 GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC 3841 TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC 3901 AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC 3961 TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT 4021 CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG 4081 TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT 4141 CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG 4201 CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT 4261 GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC 4321 CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA 4381 GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG 4441 ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA 4501 TTTTGGTCAT GAACAATAAA ACTGTCTGCT TACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTTATG 4561 AGCCATATTC AACGGGAAAC GTCTTGCTCT AGGCCGCGAT TAAATTCCAA CATGGATGCT 4621 GATTTATATG GGTATAAATG GGCTCGCGAT AATGTCGGGC AATCAGGTGC GACAATCTAT 4681 CGATTGTATG GGAAGCCCGA TGCGCCAGAG TTGTTTCTGA AACATGGCAA AGGTAGCGTT 4741 GCCAATGATG TTACAGATGA GATGGTCAGA CTAAACTGGC TGACGGAATT TATGCCTCTT 4801 CCGACCATCA AGCATTTTAT CCGTACTCCT GATGATGCAT GGTTACTCAC CACTGCGATC 4861 CCCGGGAAAA CAGCATTCCA GGTATTAGAA GAATATCCTG ATTCAGGTGA AAATATTGTT4921 GATGCGCTGG CAGTGTTCCT GCGCCGGTTG CATTCGATTC CTGTTTGTAA TTGTCCTTTT 4981 AACAGCGATC GCGTATTTCG TCTCGCTCAG GCGCAATCAC GAATGAATAA CGGTTTGGTT 5041 GATGCGAGTG ATTTTGATGA CGAGCGTAAT GGCTGGCCTG TTGAACAAGT CTGGAAAGAA 5101 ATGCATAAAC TTTTGCCATT CTCACCGGAT TCAGTCGTCA CTCATGGTGA TTTCTCACTT 5161 GATAACCTTA TTTTTGACGA GGGGAAATTA ATAGGTTGTA TTGATGTTGG ACGAGTCGGA 5221 ATCGCAGACC GATACCAGGA TCTTGCCATC CTATGGAACT GCCTCGGTGA GTTTTCTCCT 5281 TCATTACAGA AACGGCTTTT TCAAAAATAT GGTATTGATA ATCCTGATAT GAATAAATTG 5341 CAGTTTCATT TGATGCTCGA TGAGTTTTTC TAAGAATTAA TTCATGAGCG GATACATATT 5401 TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC 5461 ACCTGAAATT GTAAACGTTA ATATTTTGTT AAAATTCGCG TTAAATTTTT GTTAAATCAG 5521 CTCATTTTTT AACCAATAGG CCGAAATCGG CAAAATCCCT TATAAATCAA AAGAATAGAC 5581 CGAGATAGGG TTGAGTGTTG TTCCAGTTTG GAACAAGAGT CCACTATTAA AGAACGTGGA 5641 CTCCAACGTC AAAGGGCGAA AAACCGTCTA TCAGGGCGAT GGCCCACTAC GTGAACCATC 5701 ACCCTAATCA AGTTTTTTGG GGTCGAGGTG CCGTAAAGCA CTAAATCGGA ACCCTAAAGG 5761 GAGCCCCCGA TTTAGAGCTT GACGGGGAAA GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGAAGGGAA 5821 GAAAGCGAAA GGAGCGGGCG CTAGGGCGCT GGCAAGTGTA GCGGTCACGC TGCGCGTAAC 5881 CACCACACCC GCCGCGCTTA ATGCGCCGCT ACAGGGCGCG TCCCATTCGC CA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyanpDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMOpCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPOpBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His CpBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+)pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 CpTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐HispRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5x pTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1 pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12 pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+) PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3 pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18 pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis B pET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3X pGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99a pET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177 pBR322 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