如何阅读质粒图谱(更新版本)
☆如何阅读质粒图谱
如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素#复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l＃P/E 启动子/增强子l＃Termsl 终止信号＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
5′粘性末端
3种切口 3′粘性末端 平头末端
① DNA样品纯度
A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生 非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段 电泳观察。 B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染 时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。 C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响 酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。
2) 命名原则
• 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础 上进行了系统分类 ① 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名 (genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ② 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③ 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的 先后顺序用罗马字母表示。
酶切前的DNA
酶切后的DNA
实验材料和试剂
实验材料：质粒pCAMBIA1302 银杏基因组DNA
实验试剂：
① EcoR Ⅴ酶及其酶切缓冲液 ② 琼脂糖(Agarose)、TAE电泳缓冲液等
实验仪器
表达载体的构建方法及步骤
令狐采学创作表达载体的构建方法及步骤令狐采学一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：(1)复制起始位点(加即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
(2)抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,I<an+(3)多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段(4)P/E启动子/增强子(5)Terms终止信号(6)加poly (A)信号可以起到稳定mRNA作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：[1]构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：令狐采学创作令狐采学创作(1)克隆载体的克隆能力一据克隆片段大小(大选大，小选小)。
如＜n)kb选质粒。
(2)表达载体据受体细胞类型一原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
(3)对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位; 表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产主阅读框架错位。
综上所述，选用质粒(最常用)做载体的5点要求：(1)选分子量小的质粒，即小载体(l-1.5kb) 一不易损坏，在细菌里面拷贝数也多(也有大载体)；(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般1()个以上的拷贝，而严谨型质粒＜1()个。
(3)必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；(4)必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (试一试)。
(5)满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如Pur。
实验新人必读（七）：一文学会读懂和查找质粒图谱
实验新⼈必读（七）：⼀⽂学会读懂和查找质粒图谱作者：解螺旋.⼦⾮鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医⽣科研助⼿导语质粒图谱即为质粒DNA序列的物理图谱，包含了质粒⼤⼩、筛选标记、克隆位点、转录及翻译元件等信息。
尽管它为我们选择质粒、了解质粒特点及应⽤提供了重要依据，然⽽我们常常要为图谱中丰富信息所困扰。
那么，本⽂就为你拨云见⽇，让你快速掌握质粒图谱。
三步法看懂质粒图谱Step 1:先了解质粒的基本组成元素。
1）复制起始点Ori。
该位点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，它是质粒中⼀段特定序列，富含AT和重复序列。
Tips：图谱上只有⼀个Ori，表⽰质粒是原核克隆表达质粒；有两个Ori，则表⽰该质粒是，穿梭质粒，即可在原核也可在真核中复制。
2）抗性筛选基因。
图谱中Kan/tet就是抗⽣素抗性基因，⽅便后续通过抗⽣素筛选阳性克隆。
特点就是单词最后会以⼤写R或上标r结束。
Tips：⼀般克隆载体只有⼀种抗性筛选标记，部分表达载体及穿梭质粒具有两种抗性筛选标记。
3）多克隆位点（MCS），即⼀系列限制性内切酶酶切位点，是外源DNA插⼊位点，⼀般可通过酶切/连接⽅式将外源DNA插⼊质粒，外源DNA⼀般⼩于10kb，⽽⽚段越长，转化效率越低。
Tips: ⼀般位于转录启动和转录终⽌信号之间；所包含的限制性内切酶位点数量和组成因载体不同会有所差异，且其中的酶切位点在质粒中为单⼀的酶切位点；同时在使⽤时需注意质粒载体与外源DNA酶切位点的兼容性问题4）荧光标记或蛋⽩标签序列。
蛋⽩纯化标签蛋⽩：His-Tag，GST-Tag等；蛋⽩检测标签蛋⽩：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Tag等；荧光蛋⽩表达标签：GFP，mCherry等。
Step 2:看质粒是否是表达载体，如果是，那就必定有这些原件：启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号。
1、启动⼦：促进DNA转录的DNA序列，可与RNApol特异性结合。
2、增强⼦/沉默⼦：前者是真核基因组中⼀种增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作⽤与增强⼦所在位置或⽅向⽆关。
质粒图谱怎么看
一、质粒（plasmid）：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
载体（Vector）：简单的来说就是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体，分为病毒类和非病毒类两种。
我们平时常说的载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的，通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作，同时加入一些多用途的辅助序列。
二、如何阅读质粒图谱看懂一个质粒图谱我们需要关注以下几点：1）弄清楚质粒的方向看质粒图谱的时候我们会发现大多数质粒都会有顺时针和逆时针两个方向的箭头，箭头的方向：一个方向是复制起始位点的方向，即该质粒在细菌或真菌中DNA复制的一个方向，有时图谱中还会有f1 ori，这个代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，但是可以用来测序。
另一个就是转录方向（一般是正向），主要是从启动子开始，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。
2）复制子复制子又称复制起始区，它控制着质粒DNA的复制，并决定了质粒的宿主和拷贝数。
复制子可分为严谨型复制子与松弛型复制子，分别对应低拷贝数的严紧型质粒和高拷贝数的松弛型质粒。
3）筛选标记：了解筛选标记类型（如抗生素抗性标记），方便后续确定筛选重组质粒载体。
常见抗菌素抗性标记有氨苄青霉素抗性（Amp）、卡那霉素抗性（Kan）、四环素抗性（Tet）、链霉素抗性（Str）、氯霉素（Cmr, 某些酵母表达质粒）、潮霉素（Hyg, 农杆菌里常用的）。
4）多克隆位点MCS区：既外源基因的插入位点。
具有多个限制酶酶切位点，外源性的DNA一般可通过酶切/连接的方式插入质粒。
）其他元件，如表达系统元件和蛋白标签等常见的启动子有：CMV、EF1（常规表达，一般启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），CAMV35S、Ubi（植物表达常用），T7（常用原核系统表达启动子）。
载体图谱
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Oriλ即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+λ ,Kan+多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段λP/E 启动子/增强子λTermsλ终止信号加poly（A）信号λ可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
λ增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
质粒图谱怎么看
一、质粒（plasmid）：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
载体（Vector）：简单的来说就是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体，分为病毒类和非病毒类两种。
我们平时常说的载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的，通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作，同时加入一些多用途的辅助序列。
二、如何阅读质粒图谱看懂一个质粒图谱我们需要关注以下几点：1）弄清楚质粒的方向看质粒图谱的时候我们会发现大多数质粒都会有顺时针和逆时针两个方向的箭头，箭头的方向：一个方向是复制起始位点的方向，即该质粒在细菌或真菌中DNA复制的一个方向，有时图谱中还会有f1 ori，这个代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，但是可以用来测序。
另一个就是转录方向（一般是正向），主要是从启动子开始，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。
2）复制子复制子又称复制起始区，它控制着质粒DNA的复制，并决定了质粒的宿主和拷贝数。
复制子可分为严谨型复制子与松弛型复制子，分别对应低拷贝数的严紧型质粒和高拷贝数的松弛型质粒。
3）筛选标记：了解筛选标记类型（如抗生素抗性标记），方便后续确定筛选重组质粒载体。
常见抗菌素抗性标记有氨苄青霉素抗性（Amp）、卡那霉素抗性（Kan）、四环素抗性（Tet）、链霉素抗性（Str）、氯霉素（Cmr, 某些酵母表达质粒）、潮霉素（Hyg, 农杆菌里常用的）。
4）多克隆位点MCS区：既外源基因的插入位点。
具有多个限制酶酶切位点，外源性的DNA一般可通过酶切/连接的方式插入质粒。
）其他元件，如表达系统元件和蛋白标签等常见的启动子有：CMV、EF1（常规表达，一般启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），CAMV35S、Ubi（植物表达常用），T7（常用原核系统表达启动子）。
质粒图谱查询方法
0037--pQE9--Qiagen--原核表达--jpsgf
0038--pCANTAB5E--Phamcia--噬菌体抗库--yanBaggio
0039--pET-24a--Novagene--原核表达--yanBaggio
0006--pQEx--Qiagen--原核表达--wangjun2002274
0007--pIVEX2.3--Roche--体外转录翻译--wangjun2002274
0008--pIRES-EGFP--/--/--luoqingli2003
0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274
0014--pcDNA3--invitrogen--真核表达--kras
0015--pfastbac1--invitrogene--昆虫表达--cox2wj
0016--pEGFP-C3--clontech--真核表达--smilely
0017--pSecTag2--invitrogen--真核表达--kenmed
0018--PYX212--/--真核表达--Gmail
0019--pET20b--Novagen--原核表达--Gmail
0020--pEGFP-1--BD BIO--转录调控--wyh
0021--pEGFP/U6 --/--siRNA--songbinn
0022--pThioHisA--invitrogen--原核表达--xuezhishui
0081--pcDNA5/FRT/CAT—INVITROGEN--真核表达--renke3333
实验五 酶切
多功能
异源三聚体 ATP、 Mg2+ 、SAM
单功能
同源三聚体 Mg2+
双功能
异源二聚体 ATP、 Mg2+
识别序列
距识别序列1kb处
4~6bp回文序列
距识别序列下游 24~26bp处
随机性切割
切割位点
随机性切割
识别序列内或附近 特异切割 常用
应 用
不常用
数量很少，无实际 作用
4) 基本特性及用途
② DNA样品甲基化程度
限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该 DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一， DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。 如：
AccⅠ识别序列 能切割 AccⅠ 不能切割 T CCGG T ×CCGG AGA
6mATC
注意此处的区别
限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GATATC CTATAG
产生平末端：
GAT CTA
ATC TAG
则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、 2624bp和6325bp的三条DNA 片段
Eco RV (10442)
35S promoter UTR pUC18 MCS lacZ promoter 35S promoter
① DNA样品纯度
A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生 非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段 电泳观察。 B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染 时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。 C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响 酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。
如何阅读分析质粒图谱
如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+多 克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA 片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
增强子/沉默子－为真核 基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
质粒图谱大全
（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
质粒图谱大全
（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
怎么查找质粒图谱(活动za)
经常在坛子里看到一些人求助质粒图谱，很多时候我发现其实有些质粒图谱还是很容易找到了，刚开始帮忙查找了下，还公布了一些查找质粒图谱比较好的网站，后来看得多了，很多时候，这样的帖子直接跳过了。
今天又看到几个求质粒图谱的帖子，因此决定就查找质粒图谱的方法，写个汇总报告帖子，希望对虫子们有些帮助。
这些方法，大部分是自己学习的过程中积累的，也许汇总报告得还不够全面，望其他虫友指正。
方法一：安装软件做分子实验，经常和不同的质粒打交道，了解各种质粒的图谱信息是必需的，公司的这款软件绝对是分子生物学虫子们的福音，功能强大、界面美观，使用起来很人性化。
后面的很多方法都是基于在这款软件的使用之上，因此我觉得要想对质粒图谱了解更直观，安装这款软件是非常必要的。
而且，一旦安装了这款软件，你就发现这款软件的软件包里面会包括公司的所有质粒图谱信息和其他比较常见和经典的质粒图谱（不是有虫子求系列质粒吗？帖子链接，如下图，数据库中本身就有很多）。
这里就不一一细说，各位虫子可以自己体验下。
（这款软件的下载和使用说明书站内很多）方法二：查找质粒图谱的网站：这个之前有人求助质粒图谱时，我在回应求助帖里面公布过几个我经常用的网址，估计不是专题，很多人没看到，现在在此重新汇总报告下地址：这个网站很页面很人性化，直入主题，也是我经常用到一个网站，比如同样这个帖子求类质粒图谱（注意，是一类质粒图谱，没关系，照样能找到），直接在搜索框输入，可以看到，之类质粒一共有三十多个。
找到自己需要的质粒名称，点击进入，就可以看到质粒图谱了拿第一个质粒举例，如上图，质粒图谱是不是很难看，对，我也觉得很难看，没关系，看见了吗？点击进入，我们就得到该质粒图谱的序列了。
如何得到比较好看的质粒图谱呢，看到了吗？对，熟悉的虫子们肯定知道该如何做了，对，点击进入，如下图，复制所有的代码部分，新建文件，粘贴上代码后，将文件扩展名由更改为格式，导入，你就可以在里面看到质粒图谱了。
如何查找质粒图谱
如何查找质粒图谱
[转贴]如何查找质粒图谱。
最好的图谱就是NCBI和公司里提供的了，
第一步去NCBI查找，一般常用质粒都有了。
然后以.db格式下载，再用Invitrogen的VectorNTI打开，就能得到一张很好的质粒图。
如果找不到，就去google，(baidu上比较不准)，最好加个pdf，找到公司的质粒介绍，那种图也不错。
如果还是找不到，就在google，baidu上查质粒的序列，把序列输入Invitrogen的VectorNTI，能够得到类似酶切的图谱，凑合着用吧，如果有序列信息，再自己添加也一样。
我就是这么查的，相信大家用的多数都是常用序列，查起来应该不难。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
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如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素#复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l＃P/E 启动子/增强子l＃Termsl 终止信号＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
＃增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
/沉默子－负增强子，负调控序列。
＃核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。
l＃转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针？那其实是代表两条DNA 链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）1. 什么是载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类＃按功能分成：（1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨型载体）（2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA 顺序的载体。
＃按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
3. 基因工程载体的3个特点：（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。
4. 载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：－－－（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb选质粒。
－－－（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
－－－（3）对原核表达载体应该注意3点：－－－－－－①选择合适的启动子及相应的受体菌；－－－－－－②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；－－－－－－③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（最常用）做载体的4点要求：①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
质粒载体质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
其特点如下：①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。
②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。
一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。
按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制（stringent control）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxed control）型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。
每个质粒DNA上都有复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。
有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中，随宿主DNA复制，称为附加体，例如细菌的性质粒就是一种附加体，它可以质粒形式存在，也能整合入细菌的DNA，又能从细菌染色质DNA上切下来。
F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合（conjugation），通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。
③质粒对宿主生存并不是必需的。
这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。
线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。
某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。
所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。
答学生问：克隆载体与表达载体FROM：红泥小火炉问题：基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后，再将其转移到表达载体中实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？回答：1.克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的DNA片段，重组进入载体，然后于宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库的建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的，而克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。
2.重组DNA需要使用限制性内切酶，因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点，现在的T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR效率就更高。
3.表达载体的目的是多样化的，为了实现实际工作中的需要，不同的目的就要设计不同的载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。
4.细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少。
5.细菌承受的工作负荷也是有限的，给它的工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是一个道理。
原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多。
所以我们一般的策略是，将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。
回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。
新浪网友2009-10-10 08:48:28 [举报]您好！您博文里得“T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR 效率就更高。
”是什么意思？我是初学者，请求赐教。
博主回复：2009-10-16 09:51:51T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了T，而Taq酶有在PCR产物后随机加A的特性，所以PCR产物直接可以接入T载体。
而经典的克隆PCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体，所以在设计PCR引物时两端要加酶的识别位点，而加装的序列与模板不配对，因此PCR效率会低很多。
新浪网友2010-01-08 13:00:09 [举报]老师，您好！您的意思是说克隆载体只是为了得到大量的目的基因，而现在多用PCR就可以达到这个目的。
那这个目的基因的主要用途是什么？只用来测序吗？表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧？盼望您的回复！谢谢博主回复：2010-03-20 13:07:05嗯，基本是这个意思。