第十章 分光光度法

紫外可见分光光度法的特点： 1、灵敏度高，被测物质浓度的下限 可达到10-5~ 10-6 mol•L-1，因而适用于 微量及痕量成分含量的测定。
2、准确度较高。一般相对误差为 2%-5%。
3、简便、快速。
第二节 物质对光的选择性吸收
一、光的基本性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性。
描述波动性的重要参数是波长 和频率v，它
们与光速c的关系是：c= v 光的粒子性是把光看成是带有能量的粒子流， 这种粒子称为光子或光量子。光子的能量取决于 c 光的频率： E h h

光的能量与波长成反比，波长越短，能量越高。
单一波长的光称为单色光，由不同波长组成
的光称为复色光。 人的眼睛能感觉到的光称为可见光，其波长 范围为400-760nm，不同波长的光使人眼的颜色感 觉不同，大致：400-450nm为紫，450-480为蓝，
二、可见分光光度法测量条件的选择 （一）选择物质的最大吸收波长 作为入射 max 光波长。 （二）显色反应及反应条件的选择 1、对显反反应的要求： （1）选择性好 （2）灵敏度高 （3）有色化合物组成恒定 （4）有色化合物的化学性质稳定 （5）显色剂在测定波长处无明显吸收
2、反应条件的选择： （1）显色剂的用量 （2）溶液的pH值 （3）显色时间 （4）显色温度 （5）溶剂的性质 （6）加入试剂的顺序 （7）稳定性 （8）共存离子的干扰及消除
根据 Lambert-Beer 定律，以 A 为纵坐标，以 cB或ρB 为横坐标 作图，应得到一条通过原点的直 线。 但在实际测定中，常会出现标 准曲线偏离直线的现象，曲线向 上或向下发生弯曲，这种现象称 为偏离 Lambert-Beer 定律。
引起偏离 Lambert-Beer 定律的原因 有物理因素和化学因素两大类。
蓝
绿蓝 蓝绿
黄
橙 红
580－600
600－650 650－760
原因：当一束光照射在某物质或某溶液时，组 成该物质的分子、原子或离子等粒子与光子作用获 得能量，从低能量状态跃迁到高能量状态，即由基 态转变为激发态，这个过程即是物质对光的吸收。 M（基态）＋hν → M*（激发态）
不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择 吸收光子的能量也不同，即吸收光的波长不同。
（ 二）物质的吸收光谱
任何一种溶液对不同波长的光的吸收程度是 不相等，可通过吸收光谱的绘制来反映溶液对不 同波长光的吸收程度。 吸光度A ：溶液对不同波长单色光的吸收程
度。
将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度 的有色溶液，测定相应的吸光度A，以波长 为 横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线， 此曲线就是吸收光谱或吸收曲线。
（一）物理因素引起的偏离 1. 非单色光引起的偏离 2. 非平行入射光引起的偏离 3. 介质不均匀引起的偏离（仅适用于稀溶液） （二）化学因素引起的偏离 1. 溶液浓度过高引起的偏离 2. 化学反应引起的偏离
第四节 可见分光光度法
一、分光光度法的测定仪器：紫外可见分光光 度计 分光光度计的基本组成部件：
A bc
1
b：液层厚度（cm） c：溶液物质的量浓度（mol· L-1） ε：摩尔吸光系数（L· mol-1· cm-1）
若用质量浓度代替物质的量浓度，则上述公式 可表示为：
A ab
2
a：质量吸光系数（L· g-1· cm-1）
a和ε可通过下式转换：
aM
a或ε的数值越大，表明溶液对入射光越容易 吸收，测定的灵敏度就越高。因此，摩尔吸光系 数ε、质量吸光系数a是有色物质在一定波长下的特 征常数，常用来衡量光度法的灵敏度。 一般 ε 值大于103即可进行分光光度法测定。 ε 值为104 ~ 105 L· mol-1· cm-1时，通常认为是高灵敏 的显色反应。 由Lambert-Beer定律可知：
注意： 使用Lambert-Beer定律有两个限制条 件： 单色光 和 稀溶液。
医药学中还常用比吸光系数 E 1ｃm时的吸光度值。 同一物质：
1% 1cm
，是指
１００ｍＬ溶液中含被测物质１ｇ和液层厚度为
E
1% = 10 ε / M 1cm
0.1E
1% 1cm
a 0.1E
1% 1cm
CuSO4溶液选择性地吸收白光中间的黄色光， 故CuSO4溶液呈蓝色。 [Fe(SCN)6]3-呈血红色，说明其溶液选择性 地吸收白光中的青色光。
物质呈现的颜色 颜色 黄50－480
橙黄 红紫
紫
绿蓝 绿
黄绿
480－500 500－560
560－580
如果溶液中存在两种或两种以上对 光有吸收的物质，在同一波长下只要共 存物质不互相影响，即不因共存物的存 在而改变本身的吸光系数，则吸光度是 各共存物质吸光度之和，即：
A Aa Ab Ac .......
式中A为总吸光度，Aa、Ab、Ac…..为 溶液中共存物质各组分a、b、c……的 吸光度。
300 350 400 500
600
相同物质在不同浓 度的吸收光谱形状基本一 致， max都在相同的位置； 并且溶液浓度越大，吸收 光谱的峰值越高，吸光度 A越大，两者成正比关系。 若在最大吸收波长处测定 吸光度，则灵敏度最高。 吸收光谱体现了物质 的特性，是进行定性、定 量分析的基础。
60mg· L-1
40mg· L-1
20mg· L-1 10mg· L-1
KMnO4 的吸收曲线
第三节
光的吸收定律
一、透光率和吸光度
当一束平行的单色光照射到有色溶液时， 一部分光被溶液吸收，剩余部分则透过溶液。
若入射光的强度为Io，透过光的强度为It，则
透射光的强度It与入射光强度Io之比称为透光率，
用T表示： 透光率的负对数称为吸光度，用A表示。A越 大，溶液对光的吸收越多。
It T I0
I0 A lg T lg It
透光率越大，溶液对光的吸收越少；反之，透
光率越小，溶液对光的吸收越多。
二、朗伯-比耳定律
Lambert定律：对所有的均匀介质(即低浓度溶液） 在浓度一定时： A k b 1 b : 液层厚度； k1：比例系数，与被测物质的性质、入射光的波长、 溶剂、溶液浓度及温度等有关的常数。
例：
已知某化合物的相对分子质量为 251，将此化合物用乙醇作溶剂配制成浓度 为0.150mmol· L－1的溶液，在480nm波长处 用2.00cm吸收池测得透光率为39.8％，求 该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数ε及 质量吸光系数 a 。
解：由Lambert-Beer定律可得：
A lg T bc bc 已知：c=0.150×10-3mol· L－1，b=2.00cm， T=0.398 代入上式
第六节
分光光度法定量测定方法
（一）标准曲线法（校正曲线法） （二）标准对比法
（一）标准曲线法
测定步骤： （1）配制标准系列：用标准样品配制一 系列不同浓度的标准溶液（称为标 准系列）。 （2）测定标准系列的吸光度A：将标准 系列置于一定规格的比色皿中，在 一定波长（ max ）下，测定其相应的 吸光度A值。
lg 0.398 3 -1 -1 480nm 1.33 10 (L mol cm ) 4 1.50 10 2.00
a 480nm
480nm
M
1.33 103 -1 -1 5.30 (L g cm ) 251
三、 Lambert-Beer定律的表观偏离
3、吸收池
分光光度计中用来盛放溶液的容器称为 吸收池又称为比色皿，是用光学玻璃制成。 在测定中同时配套使用的吸收池应相匹配， 即有相同的厚度和相同的透光性。
4、检测器
可见分光光度计中的检测器一般用 光电管，它是用一个阳极和一个对光敏 感材料制成的阴极所组成的真空二级管， 当光照射到阴极时，表面金属发射电子， 流向电势较高的阳极而产生电流。光电 管输出的电讯号很弱，约为1×10－6A， 经放大器放大后输入指示器。指示器一 般有微安电表，记录器，数字显示和打 印等。透光率刻度是等分的，因吸光度 与透光率是负对数关系，所以吸光度刻 度是不均等的。
处于同一直线上的两种单色光为互补色光，从 图中见，蓝光与黄光互补，青光与红光互补等。
二、物质的颜色对不同波长光的吸收特性
（一）物质对光的吸收具有选择性 现象：当一束白光通过溶液时，如果溶液不 吸收白光，则溶液呈无色透明；溶液对所有颜色 的光全部吸收，则溶液呈黑色。若溶液选择性地 吸收了某种颜色的光，则溶液呈现出吸收光的互 补色光的颜色。如：
此法适用于非经常性的分析工作。
（三）应用－铁的测定
1、硫氰酸盐法
2、磺基水杨酸法 3、磺基水杨酸合铁（III）离子
1、硫氰酸盐法
在酸性条件下，Fe3＋与过量显色剂硫 氰酸钾反应生成血红色的 [Fe(SCN) ] ，反应 式为：
A lg T
lg T bc
T 10
bc
公式（1）和（2）表明：当一束平行的 单色光通过均匀的某溶液时，溶液的吸光 度与溶液的组成量度和液层厚度的乘积成 正比，这一定律称为Lambert-Beer定律， 又称为光吸收定律。 朗伯-比尔定律是分光光度法定量分析 的依据。
（3）绘制标准曲线：以溶液的浓度为横 坐标，相应的A值为纵坐标作图， 得到一条通过坐标原点的直线—— 标准曲线。 （4）样品含量的测定：用相同的方法， 在相同的条件下测定样品溶液的A值， 然后在标准曲线上找到该A值，其对 应的浓度数值即为样品溶液的浓度。
1.2 1 0.8 A 0.6 0.4
0.2
Cr2O72-、MnO4- 的吸收光谱
Absorbance
1.0
0.8 0.6 0.4 0.2
350
525 545