实验二__蛋白质的颜色反应

实验试剂
1 2 3 4 5 6 7 蛋白质溶液； 蛋白质溶液； 0.1％茚三酮水溶液； 0.1％茚三酮水溶液； 浓硝酸； 浓硝酸； 10%NaOH溶液 溶液； 10%NaOH溶液； 尿素； 尿素； 1％硫酸铜溶液； 1％硫酸铜溶液； 0.01％ 0.01％考马斯亮蓝染液
实验操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。 （1）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素 熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨， 熔化 。 熔化的尿素开始硬化时， 停止加热， 尿素放出氨 ， 形成双缩脲。冷后， 10％氢氧化钠溶液约1毫升， 形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混 匀， 再加1 ％ 硫酸铜溶液1 滴， 再振荡 。 观察出现的粉红颜 再加1 硫酸铜溶液1 再振荡。 色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约10滴和10 10滴和10％ （ 2 ） 向另一试管加卵清蛋白溶液约 10 滴和 10 ％ 氢氧化钠溶 液约10滴 摇匀，再加1 硫酸铜溶液2 随加随摇， 液约 10滴，摇匀 ， 再加 1 ％ 硫酸铜溶液2 滴 ， 随加随摇， 观 10 察紫玫瑰色的出现。 察紫玫瑰色的出现。
(5) 操作方法
管号 1 2 蛋白质溶液 ml） （ml） 0 0.1 蒸馏水 ml） （ml） 1 0.9 考马斯亮蓝 染液（ 染液（滴） 2 2
思考题
请列举几种鉴别蛋白质的方法？ 1 请列举几种鉴别蛋白质的方法？ 2 通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有 何认识？ 何认识？
OH + பைடு நூலகம்NO 3 HO NO 2 + H 2O
OH HO NO 2 + NaOH O N OH
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸， 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以 都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化， 都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少 量浓硫酸后才能够发生黄色反应。 量浓硫酸后才能够发生黄色反应。
(二) 茚三酮反应
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外， 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所 有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物 氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物 质。 该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、 和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮； NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形 成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有 色物质。 色物质。
实验二 蛋白质的颜色反应
一
实验目的
1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联 1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联 接方式。 接方式。 2.了解蛋白质的颜色反应原理。 2.了解蛋白质的颜色反应原理。 了解蛋白质的颜色反应原理 3.学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。 3.学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。 学习几种常用的鉴定蛋白质的方法
O C C C O O C C C O OH H + RC H O + NH 3 + CO 2 OH OH + R H C NH 2 COOH
加热
O C C C O O C C C O N C C O NH 2 O C OH H +
O C C C O O + 2N H3
+
2 H 2O
（三）黄色反应 在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸， 在蛋白质分子中 ， 具有芳香环的氨基酸 ( 如酪氨酸 ， 色 氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物， 氨酸等 )残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物， 在碱性条件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物， 在碱性条件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应 为：
取试管1 加入蛋白质溶液1ml， (3) 取试管1支 ，加入蛋白质溶液 1ml，然后各加入 茚三酮水溶液2 混匀后于沸水浴中加热1 0.1 ％ 茚三酮水溶液 2 滴 ， 混匀后于沸水浴中加热 1-2 分钟，观察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。 分钟，观察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。 (4) 于一试管内 ， 置蛋白质溶液 10 滴 ， 浓硝酸 3-4 于一试管内， 置蛋白质溶液10 10滴 浓硝酸3 加热，冷却后于室温下逐滴加入10 NaOH溶液 10% 溶液5 滴 ， 加热， 冷却后于室温下逐滴加入10%NaOH溶液 5滴， 观察颜色变化。 观察颜色变化。
实验原理
(一) 双缩脲反应 一
1 原理 尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。 尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。 180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨 双缩脲在碱性环境中能与cu 结合生成紫红色化合物， 双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应 称为双缩脲反应。 称为双缩脲反应。 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似， 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此 反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应， 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩 脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
(四)考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在 G250具有红色和蓝色两种色调 酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色： 酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋 白质通过疏水作用结合后变成蓝色。 白质通过疏水作用结合后变成蓝色。 它染色灵敏度高。反应速度快，约在2分钟左 它染色灵敏度高。反应速度快，约在2 右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。 右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。 0.01mg蛋白质范围内 蛋白质范围内， 在0.01-1.0 mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与 A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 值成正比