DNS法测定α淀粉酶活力的方法
淀粉酶活力的测定方法
淀粉酶活力的测定方法淀粉酶是一类能够催化淀粉水解的酶，在生物体内和工业生产中都具有重要的作用。
准确测定淀粉酶的活力对于研究酶的性质、生物体的代谢过程以及相关工业应用都具有重要意义。
下面将介绍几种常见的淀粉酶活力测定方法。
一、碘淀粉比色法碘淀粉比色法是一种较为经典且常用的测定方法。
其原理是淀粉经淀粉酶水解后，剩余的淀粉与碘液反应生成蓝色复合物，颜色的深浅与剩余淀粉的量成正比。
通过比色法测定反应后溶液的吸光度，即可计算出淀粉酶的活力。
具体操作步骤如下：首先，准备一系列含有不同浓度淀粉溶液的试管，并向其中加入适量的淀粉酶溶液，在一定的温度和 pH 条件下反应一段时间。
然后，迅速向各试管中加入碘液，使反应终止。
最后，使用分光光度计在特定波长下测定各试管溶液的吸光度。
根据事先绘制的标准曲线，将吸光度值转换为剩余淀粉的浓度，从而计算出淀粉酶水解淀粉的量，进而得出淀粉酶的活力。
这种方法的优点是操作相对简单、成本较低，但缺点是灵敏度相对较低，对于低活力的淀粉酶测定可能不够准确。
二、DNS 法（3,5-二硝基水杨酸法）DNS 法是另一种常用的测定淀粉酶活力的方法。
其原理是淀粉在淀粉酶的作用下水解为还原糖，还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸在碱性条件下共热，被还原成棕红色的氨基化合物。
在一定范围内，还原糖的生成量与淀粉酶的活力成正比，通过比色测定棕红色物质的吸光度，即可计算出淀粉酶的活力。
操作过程如下：将淀粉溶液与淀粉酶溶液在适宜条件下反应一定时间后，取出适量反应液，加入DNS 试剂，在沸水浴中加热一段时间，使反应充分进行。
冷却后，使用分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度。
与碘淀粉比色法相比，DNS 法的灵敏度较高，能够更准确地测定低活力的淀粉酶，但操作过程相对复杂一些。
三、斐林试剂法斐林试剂法也是基于淀粉水解产生还原糖的原理。
斐林试剂由硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液组成，还原糖能将斐林试剂中的二价铜离子还原为一价铜离子，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。
淀粉酶活力的测定
收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL
1、分别计算0时刻、5 min时刻的A540nm平均值。 2、根据图表中的实验结果，并利用实验 “3,5-二
硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准 曲线，计算淀粉酶的活力。
需要详细过程。
5 min时刻吸光值
5 min时刻还原糖mg数
0 min时刻吸光值
0 min时刻还原糖mg数
二者相减，计算酶活力。 1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶*稀释倍数
七. 思考题
1、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？ 2、本实验中两次加入NaOH溶液的意义是什么?
八、分析
1.三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？ 2.酶液的稀释倍数是否要改变。 3.计算酶液的总活力、回收率。
操作
0号管 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 B1 B1’ F1 F1’ B2 B2’ F2 F2’ B3 B3’ F3 F3’
淀粉酶液 (ml)
0.3
0.2
0.5
H2O (ml) 3.5 pH 6.8缓冲液 0.3 ％ NaCl
预热
各 1 ml 各 1 ml 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min
实验七 淀粉酶活力的测定
一、实验目的
掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法
二、实验原理
DNS法测定α-淀粉酶活力的方法
蒸馏水 （mL）2.0 1.6 Nhomakorabea1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量 （mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂 （mL）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。
预留发酵液酶活力测定 需要稀释倍数
10、100、1000、10000、 50000…… 对照设置1个就可以，10或100倍； 按照DNS方法测定。
酶 活 力 测 定 步 骤 （ 流 程 ）
1ml稀释酶液 40℃水浴保温5min
加入2.0mlDNS 40℃水浴保温10min
加入1.0ml1%淀粉溶液 （预先40℃水浴保温5min）
沸水浴5min 冷却定容至25ml
540nm作比色调 “0”、“100”用
1ml稀释酶液 40℃水浴保温5min
加入1.0ml1%淀粉溶液 （预先40℃水浴保温5min）
调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续 排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4， 1/5……）。
α-淀粉酶酶活力测定的原理
底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反 应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原 糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生 成量（如DNS法），从而计算出酶活力单 位。
40℃水浴保温10min
加入2.0mlDNS 沸水浴5min
冷却定容至25ml
540nm比色测定 OD值
代入回归方程计算出麦芽糖生成量
计算公式
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ， pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶 量定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶（酶 U/活 m ）L 麦 力芽糖毫 N 10
DNS法测定α-淀粉酶活力的方法
3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 配制说明
21g 氢氧化钠（先加入溶解）； 182g 酒石酸钾钠（同上）； 6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加 热完全溶于上述溶液中； 5g 重蒸苯酚（冷却后加入）； 5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）； 完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越 长越稳定。 引自： 朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城， 袁厚积编著．生物化学实验．上海：上海 科学技术出版社，1981．
比酶活力计算
定义：1mg蛋白质的酶活力单位。 计算公式：
酶活力单位 （U） 比酶活力 （U / mU/mL）和蛋白质含 量（mg/mL）。 可以反映样品中酶的纯度。
分光光度计介绍
原理：在一定条件下，遵循朗伯－比尔 （Lambert-Beer）定律 组成：光源、单色器（棱镜、光栅）、吸 收池、检测器（光电管、光电倍增管、光 电二极管阵列）、显示系统
标准曲线法
取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液， 在选定波长处（通常为λ max），用同样厚 度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（ OD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标 作图，得到一通过坐标原点的直线－标准曲 线（工作曲线）。 理想的标准曲线满足以下条件： 1、至少5个点，一般不超过7个点； 2、2个以上重复值； 3、重复值误差小于5%； 4、点与线的垂直距总和最小； 注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测 定范围）
利用DNS法测定α-淀粉酶活力 的方法
目的要求
了解生物学研究中针对糖含量测定的常用 方法及相关原理。 掌握一般标准曲线制作的意义及要求。 掌握DNS比色法测定α-淀粉酶活力的原理 、方法及操作步骤。 掌握利用EXCEL分析工具库数据分析—— 回归分析，得到回归方程及相关分析结果 。
糖的测定方法
测定α-淀粉酶活力的方法
测定α-淀粉酶活力的方法实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。
酶催化的反应称为酶促反应。
生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。
能提高酶活力的物质，称为激活剂。
激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。
使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。
氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。
应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。
酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。
温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。
同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。
食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。
但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。
α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。
α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。
本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。
淀粉酶检测方法
淀粉酶检测方法淀粉酶是一种在生物体内分解淀粉的酶类，在工业生产中也有广泛的应用。
淀粉酶检测方法的研究和开发对于生物学和工业生产都具有重要的意义。
本文将介绍10种常用的淀粉酶检测方法，并展开详细描述。
1. 检测淀粉酶酶活力的方法淀粉酶酶活力的检测是在一定的条件下测定淀粉酶对淀粉分子链断裂的程度。
其方法多种多样，如I2-KI法、Nelson-Somogyi法、DNS法、酚硫酸法等。
其中DNS法的操作简单、精密度高、结果准确，被广泛运用于淀粉酶酶活力的测定中。
DNS法的具体流程：取淀粉酶反应液1ml，加入60μl 1% 普鲁士蓝，阴离子化的淀粉酶会将淀粉水解成低聚糖，反应后加入7.5ml DNS液，于100℃水浴烘箱加热10min，将反应液冷却至室温后用1mol/L NaOH调至中性，以1cm光程在720nm波长处测定吸光度。
2. 紫外线比色法紫外线比色法是一种测定淀粉酶酶活力的快速、准确、灵敏的方法。
该法利用酶水解淀粉时所产生的差异色团在化学性质和吸收光谱方面的变化来测定淀粉酶酶活力。
紫外线比色法的具体流程：取一定量的淀粉酶及淀粉，在相应的pH值下孵育一定的时间后，停止反应，加入氢氧化钠，合并各样品，稀释，分别于270nm、309nm处记录吸光值，然后计算各组淀粉酶的缩合作用所产生的光吸收值，即可求出淀粉酶的酶活力。
3. pH滴定法pH滴定法是以酶水解完淀粉后所生成的氢离子释放量作为反应结束的依据。
该方法的特点是操作简单，易于掌握，准确度高。
pH滴定法的具体流程：取一定量的淀粉酶及淀粉，设置相应的pH值，在一定的温度下孵育一定时间，取出样品，加入酚酞pH指示剂，并滴加NaOH溶液，直到溶液从淡红色转为深红色，记录NaOH滴加量，计算其中的氢离子产生量即可求出淀粉酶的酶活力。
4. 薄层酶法薄层酶法是将淀粉酶和淀粉均匀混合后涂在薄层板上，然后观察酶诱导的淀粉分解反应的变化，以判断淀粉酶的活力。
薄层酶法的具体流程：将淀粉酶和淀粉均匀混合后涂在薄层板上，然后孵育一段时间，用紫碱蓝溶液滴在板上，若淀粉分解为葡萄糖，其降解产物将与紫碱蓝成蓝绿色，而未被淀粉酶降解的淀粉则呈紫色。
DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定
在以 ２ ％可 溶性 淀 粉 为唯 一碳 源 的查 氏（ ｚｐ ｋ ￣ Ｃ ａｅ ） 液体
培 养 基 中 分 别 接 种 香 菇 、 菇 、 菇 、 曲 根 霉 ，７ｃ恒 温 摇 平 姬 酒 ２ Ｃ
发 价 值 的生 产 菌 种 的生 理性 状 ， 中包 括 食 用 菌生 产 菌 种 其 对 环境 的适 应性 ， 归结 为 食用 菌 的代谢 能 力 ， 能够 利 用廉价
原 料迅 速 生 长 并大 量 合成 目 的产物 。 多 工业 发 酵 菌 种 不 许 能 直接 利用淀 粉 ， 物 工厂 必须 对原 材料 进 行预 处理 ， 生 通过 液化、 糖化 生产 微 生物 可 以直接 利 用 的淀 粉 水解 糖 。 果选 如 育 出具 有 淀粉 酶 活 力 的生 产 菌种 ， 可 以 实现 边 糖化 边 发 就
ｍｅ ｔｍ ｎ ｗｈｔ ｈ ｎｙ ｃ ｒｏ ｏ ｒｅ Ｗａ ％ ｓ ｌｂｌ ｔ ｃ ａ ｄ ａ ｌｓ ｎ ｒ ｙ ｒｎ ｅ ｒｍ ．１ ｔ ． ７ Ｕ／ ｏ ｇ Ｌｅ ｔ ｌ ｄ ｄ ｓ， ｄｕ ｉ ｉ ｔｅ ｏ ｌ ａｂ ｎ ｓ ｕｃ ｓ ２ ｈ ｏｕ ｅ ｓａ ｈ， ｎ ｍｙａ ｅ ｅ ｅ ｇ ａ ｇ ｄ ｆｏ １５ ３ ｏ ３４１ ｍＬ ａ ｎ ｎｉ ａ ｅ ｏ ｅ ｒ ｍ ｎｕ Ｐｉｕｏ ｕ ｓｒ ａｕ Ｐｌｕｏ ｕ ｏｎ ｃ ｐｉｅ，Ｏａ ｏｐｕ ｏｗａ ｄａｒ ｆｒｎｃ ｎ ｎ ｌｓｓｍｅｈ ｄｆｒｔｅｅ ｉｌ ｕ ｇｓｒｉ ｅｅ ｔｏ ｅ ｒｔｚ ｏ ｔｅ ｔｓ， ｅ ｒｔｓｃ ｒ ｕ ｏ ａ Ｓ ｓｔ ｔ ｒ ｒ ｅｅ ｅ ｅａ ｄａ ａｙｉ ｔｏ ｄｂ ｅｆ ｎ ｉｔａｎ ｓｌｃｉｎ． ｆ ｏ ｈ Ｋｅ ｙｗｏ ｄ ｅ ｉ ｌ ｕ ｉ ｆｒ ｅ ｔｏ ＤＮＳ； ｙａ ｅ； ｃｉｉｙｄ ｔ ｒ ｎ ｔｏ ｒ ｓ ｄ ｂｅｆｎｇ ；ｅｍ ｎ ｉｎ； ｍ ａ ｌｓ ａ ｔｖｔ ｅｅｍｉ ａｉｎ
淀粉酶活性测定
淀粉酶活性测定淀粉酶是一种非常重要的酶类，是一种负责水解淀粉质的消化酶。
淀粉酶活性测定可以用于评价淀粉酶的水解能力和功能，有助于监测动物体内的淀粉酶活性水平，以及在食品、农业、医学等方面的应用。
在此文中，我们将详细介绍淀粉酶活性测定的方法、原理、重要性等相关知识。
1、Iodine-starch法此方法是基于淀粉直接加热与淀粉酶水解后不同的化学反应。
淀粉水解后的葡萄糖分子，会使加入碘化钾后的淀粉溶液变成淡黄色或透明状态，因而用这种方法来测定淀粉酶活性。
操作步骤：（1）将淀粉溶液分配到不同的试管中，并分别加入一定量的淀粉酶和缓冲液；（2）将试管随之放入水浴器中，在一定的温度下反应一定时间后；（3）将反应好的样品加入适量的碘化钾溶液，混合均匀；（4）观察样品颜色的变化与对照样品进行比较。
淀粉酶活性越强，颜色变化越明显。
2、DNS法（3,5-dinitrosalicylic acid）此法是由3,5-二硝基水杨酸和淀粉水解后形成的糖类反应，也是一种将淀粉水解后产生的葡萄糖利用于测定淀粉酶活性的方法。
（3）在沸水中进行加热封闭处理，使淀粉酶反应后产生的糖分子与DNS反应生成产物，颜色变化呈红色。
淀粉直接加热会发生硫酸化反应，而加入淀粉酶水解后，形成的产物降解了银离子和碘化物的复合物，导致样品中碘的浓度下降，进而改变样品的颜色。
2、DNS法淀粉酶活性水平是衡量动物消化能力的重要指标之一，同时，则涉及到食品、中药、农业等领域相关工作的研究。
用于测定淀粉酶活性，在动物营养研究和饲料生产中具有广泛的应用。
在动物营养领域中，淀粉酶活性测定可以用来评价不同饲料淀粉的消化能力和饲料营养价值，甚至可以评价不同品种和不同饲料来源的淀粉酶活性差异。
在饲料生产方面，淀粉酶活性测定有助于优化饲料制造流程和配方，从而提高生产效率和经济效益。
此外，在工业领域，淀粉酶的活性测定也具有重要的应用价值。
例如，在酿酒过程中，淀粉酶活性的测定可以使发酵操作更加稳定和高效。
实验一α-淀粉酶活力的测定
结果处理与计算
数据处理
根据实验数据，我们计算了酶活力、 反应速率等参数。
图表绘制
我们使用图表展示了实验结果，以便 更直观地分析数据。
结果分析
酶活力比较
通过比较不同浓度酶液的酶活力，我们可以得出酶活力与酶浓度 之间的关系。
反应速率分析
通过分析反应速率，我们可以了解酶促反应的动力学特征。
结论总结
综合以上分析，我们可以得出实验一α-淀粉酶活力测定的结论， 并为其应用提供依据。
用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定各管 的吸光度值。
数据记录与处理
01
记录实验数据，计算α-淀粉酶活力。
02
根据实验数据绘制标准曲线和酶 活性曲线。
04
结果分析
数据记录
实验数据
在实验过程中，我们记录了不同浓度 酶液处理后的反应时间、温度、pH值 等数据。
实验误差
在实验过程中，我们尽量减小误差， 如使用精确的测量工具、多次测量取 平均值等。
05
实验总结与讨论
实验总结
01
实验原理
本实验通过测定α-淀粉酶催化淀粉水解生成可溶性糖的速率，从而确定
酶活力的大小。
02 03
实验步骤
准确称取适量淀粉和底物溶液，加入试管中，加入适量酶液，在适宜温 度下恒温水浴一定时间，然后加入碘液和氢氧化钠溶液终止反应，最后 用斐林试剂进行滴定。
实验结果
通过滴定结果计算出α-淀粉酶活力的大小。
DNS溶液
称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，溶解于50mL蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液 16.8mL，再加入20%酒石酸钾钠溶液10mL和2mol/L硫酸溶液20mL，混合均匀后 加热至80℃，不断搅拌，直至溶液呈透明。冷却后用蒸馏水定容至100mL，避光保 存。
测定淀粉酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解淀粉酶的生物学特性及其在生物体内的作用。
2. 掌握淀粉酶活性的测定方法。
3. 分析淀粉酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理淀粉酶是一种水解淀粉的酶，可以将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖。
淀粉酶活性是指单位时间内淀粉酶催化淀粉分解的速率。
本实验采用DNS法测定淀粉酶活性，DNS 法是一种灵敏、准确、精确度高的测定方法，适用于测定小样品淀粉酶活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：淀粉酶、淀粉、DNS试剂、标准葡萄糖溶液、pH缓冲液、蒸馏水、试管、恒温水浴锅、移液器、量筒、滴定管等。
2. 实验仪器：pH计、电子天平、电子显微镜、分光光度计等。
四、实验步骤1. 配制淀粉酶溶液：称取适量淀粉酶，用蒸馏水溶解，配制成一定浓度的淀粉酶溶液。
2. 配制淀粉溶液：称取适量淀粉，用蒸馏水溶解，配制成一定浓度的淀粉溶液。
3. 测定淀粉酶活性：取一定量的淀粉溶液于试管中，加入适量淀粉酶溶液，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应一定时间。
4. 测定DNS反应液：取一定量的反应液，加入DNS试剂，置于沸水浴中反应一定时间。
5. 比色：用分光光度计在特定波长下测定DNS反应液的吸光度。
6. 计算淀粉酶活性：根据标准葡萄糖溶液的吸光度值，绘制标准曲线，计算反应液中葡萄糖的浓度，进而计算淀粉酶活性。
五、结果与分析1. 淀粉酶活性随温度升高而增加，在一定温度范围内达到最大值，之后随温度升高而降低。
2. 淀粉酶活性随pH值升高而增加，在一定pH范围内达到最大值，之后随pH值升高而降低。
3. 淀粉酶活性受激活剂和抑制剂的影响，其中激活剂可以增强淀粉酶活性，抑制剂可以抑制淀粉酶活性。
六、实验结论1. 淀粉酶是一种水解淀粉的酶，在生物体内具有重要作用。
2. DNS法是一种灵敏、准确、精确度高的测定淀粉酶活性的方法。
3. 淀粉酶活性受温度、pH值、激活剂和抑制剂等因素的影响。
七、实验讨论1. 实验过程中，淀粉酶溶液和淀粉溶液的浓度对实验结果有较大影响，需要严格控制浓度。
淀粉酶活性测定实验报告
一、实验目的1. 了解淀粉酶的生物学特性及其在生物体内的重要作用；2. 掌握淀粉酶活性测定的原理和方法；3. 通过实验，探究温度、pH值等因素对淀粉酶活性的影响。
二、实验原理淀粉酶是一种能够水解淀粉的酶，其活性高低可以反映酶的催化能力。
本实验采用DNS 法测定淀粉酶活性，DNS 法是利用淀粉酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖与DNS 试剂发生反应，产生黄色化合物，通过比色法测定还原糖的浓度，从而间接反映淀粉酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 淀粉酶（市售）- 淀粉溶液- DNS 试剂- 碘液- 酚酞指示剂- 蒸馏水- pH 试纸- 温度计2. 实验仪器：- 721分光光度计- 磁力搅拌器- 电子天平- 试管- 移液器四、实验步骤1. 配制淀粉酶溶液：将市售淀粉酶按照说明书配制一定浓度的淀粉酶溶液。
2. 设置实验组：- 温度实验组：分别设置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃ 的温度梯度，每组加入相同量的淀粉酶溶液和淀粉溶液，搅拌反应 10 分钟。
- pH 值实验组：分别设置 pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的 pH 值梯度，每组加入相同量的淀粉酶溶液和淀粉溶液，搅拌反应 10 分钟。
3. DNS 反应：- 取反应后的溶液，加入 DNS 试剂，沸水浴加热 5 分钟。
- 取出后，加入 1 滴酚酞指示剂，继续沸水浴加热 5 分钟。
4. 比色：- 使用 721 分光光度计在 540 nm 波长下测定溶液的吸光度值。
5. 数据处理：- 根据标准曲线，计算各组反应生成的还原糖浓度。
- 比较各组实验结果，分析温度、pH 值等因素对淀粉酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 温度对淀粉酶活性的影响：- 从实验结果可以看出，淀粉酶活性随着温度的升高而增加，在60℃ 时达到峰值，之后随着温度的继续升高，淀粉酶活性逐渐降低。
2. pH 值对淀粉酶活性的影响：- 从实验结果可以看出，淀粉酶活性在 pH 6.0 时达到峰值，之后随着 pH 值的继续升高或降低，淀粉酶活性逐渐降低。
天然产物化学实验之α-淀粉酶的活性测定及比活计算
天然产物化学实验之α-淀粉酶的活性测定及比活计算1实验目的略2 试剂及设备3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)；葡萄糖标准液(10mg/ml)；福林试剂；淀粉溶液(10mg/ml)；磷酸盐缓冲液(pH6.0，0.02mol/L)。
722 型(或721 型)分光光度计；4 000r/min 的离心机；分析天平。
3 原理与方法3.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin 试剂)还原，产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。
Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。
此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
3.2 淀粉酶活性测定淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。
淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。
淀粉酶主要包括α-55淀粉酶和β-淀粉酶两种。
α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。
β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。
淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应式如下：3,5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
淀粉酶活力的测定方法要点
淀粉酶活力的测定方法淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。
不同来源的淀粉酶，性质有所不同。
植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。
α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。
Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。
单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。
β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min可使其钝化。
通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α + β）淀粉酶总活力，然后在60 ℃加热 15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去α - 淀粉酶活力，就可求出β- 淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的 3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
1 酶活测定方法（1）标准曲线的制作(见下表)①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。
②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。
取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。
并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。
表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值试剂麦芽糖标准液（mL）H2O（mL） 3,5-二硝基水杨酸（mL）麦芽糖含量（mg）OD5201 0 2.0 2.0 02 0.2 1.8 2.0 0.23 0.6 1.4 2.0 0.64 1.0 1.0 2.0 1.05 1.4 0.6 2.0 1.46 1.8 0.2 2.0 1.87 2.0 0 2.0 2.0(2)粗酶液淀粉酶活力测定①待测粗酶液的制备：发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。
DNS比色法测定白芸豆中α-淀粉酶抑制剂活性的方法研究
DNS比色法测定白芸豆中α-淀粉酶抑制剂活性的方法研究赵蓉;李多伟;任涛;林芳;林道发
【期刊名称】《中成药》
【年(卷),期】2013(035)003
【摘要】目的建立DNS比色法测定从白芸豆中分离纯化α-淀粉酶抑制剂活性的方法.方法通过测定波长、DNS的用量及显色反应时间的试验,确定研究方法.结果确定最佳条件为检测波长470 nm,α-淀粉酶抑制剂与等量α-淀粉酶溶液37℃预温15 min,加入2％可溶性淀粉溶液,准确反应5 min.再加入DNS试剂2 mL,沸水浴5 min后流水冷却.该方法平均回收率为99.95％ (n=9),精密度实验RSD=1.01％.结论该方法具有简便、快捷、重复性良好等特点.适用于常规α-淀粉酶抑制剂的活性测定.
【总页数】4页(P573-576)
【作者】赵蓉;李多伟;任涛;林芳;林道发
【作者单位】西北大学生命科学学院,陕西西安710069
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1;Q55
【相关文献】
1.DNS比色法测定污泥中淀粉酶活性的研究 [J], 刘贺红;万金泉;马邕文;王艳
2.碘试液比色法测定α-淀粉酶抑制剂活性 [J], 谢雨杉;李多伟;李银芳;智彩辉
3.白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取工艺研究 [J], 程敏;田童童;李甜;朱新荣;张建
4.白芸豆α-淀粉酶抑制剂在低GI方便粥中的应用 [J], 马艳丽;让一峰;赵伟;杨瑞金
5.白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取纯化及活性测定条件优化 [J], 钟颖颖;何绮怡;冯俊超;朱秋雁;张春国;赵肃清
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淀粉酶活力测定方法
1 溶液的配制：轻工业部标准DNS试剂的配制称取3，5-二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。
(1)DNS的配制：DNS（3,5-二硝基水杨酸）：称取10g DNS溶于600mL水中，全部溶解后，逐渐加入20g NaOH，搅拌溶解。
缓慢加入200g 酒石酸钾钠，加热溶解（55℃）后加入2g 苯酚和0.5g 无水亚硫酸钠，加热搅拌至全部溶解，冷却，用水稀释至1000ml，储存于棕色试剂瓶中，一周后使用。
(2)可溶性淀粉底物溶液（1%）：称取1 g可溶性淀粉，溶于80ml煮沸的Tris-HCl(pH6.5)缓冲液中，再煮沸10mins，冷却后定容至100ml。
葡萄糖标准液（1mg/ml）: 取烘箱烘干的葡萄糖0.1g加入到100ml容量瓶中，定容至100ml。
2酶活测定（1）葡萄糖标准曲线的绘制取7支试管编号，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml的葡萄糖标准液（1 mg/ml），用ddH20补加至2ml，再加入2ml DNS，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，定容至20ml，用第一支试管调零，测定在540 nm处的吸光值。
以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）DNS法取2个试管，分别为对照管和样品管。
将两试管中各加入Tris缓冲液800 μl 和底物溶液100 μl，37℃水浴保温5min，然后在对照管中加入灭活的纯化酶液（沸水浴煮沸10min）100 μl，样品管中加入纯化酶液100 μl，立即混匀计时，在37℃水浴中准确反应30min后加入等体积的DNS(1ml)终止反应，沸水浴显色5min，冷却后，定容至10ml，在540nm分光光度计测定吸光值，每个样品重复三次，取平均值。
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。
2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。
单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。
dns法测定淀粉酶活力原理
dns法测定淀粉酶活力原理1. 什么是淀粉酶？淀粉酶，顾名思义，就是一种能把淀粉分解成糖的“高手”。
想想看，咱们吃的米饭、面条，这些淀粉类的食物，都得靠淀粉酶来“打工”。
它们在咱们的口腔、胃肠道里忙得不可开交，帮助消化，让身体能顺利吸收营养。
简单来说，淀粉酶就像是餐桌上的“翻译”，把复杂的淀粉变成了身体能理解的“语言”。
2. DNS法到底是啥？好啦，说到DNS法，那可就有趣了！DNS全名是“3,5二硝基水杨酸”，听起来像个化学实验室里的秘密武器，其实它是用来测量淀粉酶活力的“神器”。
这个方法就像一位魔术师，能在你面前变出色彩缤纷的结果。
说白了，就是利用化学反应来判断淀粉酶工作得怎样。
2.1 原理大揭秘来，咱们把话题稍微深入一点。
DNS法的基本原理是这样的：当淀粉被淀粉酶分解成麦芽糖时，DNS就会参与反应，形成一种颜色鲜艳的化合物。
这种颜色的深浅，直接反映了淀粉酶的活性。
想象一下，就像画画，颜料越多，颜色越深，说明画得越好。
反之，颜色淡了，那就说明活性不够，工作效率下降了。
2.2 测量过程接下来，我们来说说具体的测量过程。
首先，咱们得准备一些样品，像是唾液、食品加工液等，里面可不乏淀粉酶。
然后，将这些样品与淀粉混合，接着再加入DNS试剂。
嘿！这一步可不能马虎，搅拌均匀后，放进水浴锅里加热。
这个加热的过程就像是给淀粉酶加点“热情”，让它们更卖力地工作。
最后，冷却后把溶液放入分光光度计里测量。
只要稍微动动手指，就能看到结果，真是太神奇了！3. DNS法的优势与应用当然，DNS法可不是光在实验室里“打发时间”，它在许多领域都有广泛的应用。
比如，在食品工业中，厂家可以用这个方法来检测淀粉酶的活性，确保产品的质量。
想象一下，消费者吃到的每一口都能放心，这可是一件多么重要的事儿啊！3.1 研究的重要性不仅如此，科学研究也离不开它。
许多研究者通过DNS法，能深入了解淀粉酶的特性、活性变化等。
这就好比侦探破案，层层深入，挖掘真相。
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生物学研究中关于糖测定中常用 的方法
菲林试剂滴定——还原糖，常量分析 DNS比色法——还原糖，微量分析 蒽酮比色法——总糖，微量分析
配制系列浓度稀释液的方法
线性稀释——稀释液的浓度梯度是相同的 （0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；
对数稀释（倍数稀释）——系列溶液的浓 度比是一常数，取决于稀释梯度——2倍稀 释（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍 稀释（1、1/10、1/100、 1/1000……）；
调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续 排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4， 1/5……）。
α-淀粉酶酶活力测定的原理
底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反 应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原 糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生 成量（如DNS法），从而计算出酶活力单 位。
计算公式：根据标准曲线计算。
3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 配制说明
21g 氢氧化钠（先加入溶解）；
182g 酒石酸钾钠（同上）；
6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加 热完全溶于上述溶液中；
5g 重蒸苯酚（冷却后加入）；
5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）；
完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越 长越稳定。
酶 活 力 测 定 步 骤 （ 流 程 ）
蒸馏水 （mL）
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量 （mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂 （mL）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。
预留发酵液酶活力测定 需要稀释倍数
10、100、1000、10000、 50000…… 对照设置1个就可以，10或100倍； 按照DNS方法测定。
引自： 朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城， 袁厚积编著．生物化学实验．上海：上海 科学技术出版社，1981．
标准曲线法
取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液， 在选定波长处（通常为λ max），用同样厚 度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（ OD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标 作图，得到一通过坐标原点的直线－标准曲 线（工作曲线）。 理想的标准曲线满足以下条件： 1、至少5个点，一般不超过7个点； 2、2个以上重复值； 3、重复值误差小于5%； 4、点与线的垂直距总和最小； 注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测 定范围）
1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉 （105℃烘干2hr）溶于100mL 0.2mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中（一般需要 密封121.3 ℃ 灭菌处理20min）。用时注意酶 污染。
标准曲线制作相关试剂加入表
试剂
管号 123456
标准麦芽糖溶液
（mL）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0Leabharlann DNS试剂测定还原糖的原理
淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝 基水杨酸，其反应如下：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。 用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色 法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量， 以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的 麦芽糖的量表示酶活力。
利用DNS法测定α-淀粉酶活力 的方法
目的要求
了解生物学研究中针对糖含量测定的常用 方法及相关原理。 掌握一般标准曲线制作的意义及要求。 掌握DNS比色法测定α-淀粉酶活力的原理 、方法及操作步骤。 掌握利用EXCEL分析工具库数据分析—— 回归分析，得到回归方程及相关分析结果 。
糖的测定方法
大致可分为三类： 1.物理法——旋光法、折光法、比重法； 2.物理化学法——点位法、极普法、光度 法、色谱法； 3.化学方法——斐林氏法、高锰酸钾法、 碘量法、铁氰化钾法、DNS比色法、蒽酮 比色法、咔唑比色法
利用Excel中相关统计分析工具，完成回 归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。
相关试剂（第一种）
标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取 1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至 1000mL。
0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：称取 柠檬酸（C6H8O7·H2O ）5.78g，柠檬酸 钠（Na3C6H5O7·2H2O）21.32g ，用 蒸馏水溶解并定容至1000mL。
理想标准曲线的特点
过原点的直线； 斜率为1（45°）； 浓度为待测物质浓 度的一半～二倍； OD值在0.05～0.8之 间（最好控制在0.2 ～0.6）。
mg/ml
麦芽糖标准曲线的制作
取6支干净的具塞刻度25mL比色管，编号， 按下表中加入相关试剂；
混匀后，置沸水浴中煮沸5min。取出后流 水冷却，加蒸馏水定容至25mL。以1号管 作为空白调零点，在540nm波长下比色 测定光密度。以麦芽糖含量（mg）为横坐 标，吸光度（OD）为纵坐标，绘制标准曲 线。——沸水浴时不要加塞！
1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉 （105℃烘干2hr）溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中（一 般需要密封121.3 ℃ 灭菌处理20min）。
相关试剂（第二种）
标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦 芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
0.2mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液： 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g， 柠檬酸（C6H8O7·H2O ）7.74g，先在烧杯中 用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中定容至 1000mL。
酶活力测定（DNS比色法）
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦 芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。
注意：去除β-淀粉酶的干扰（ β-淀粉酶不热耐， 在70℃15min钝化 ）——植物材料来源需要注 意。本此实验中忽略不计。
检测的原理：
酶解的产物之一——麦芽糖具有还原性，可以使 试剂中的3，5-二硝基水杨酸还原，形成红色的 物质，在540nm下有吸收峰，并和浓度呈一定 线性关系。