肺炎链球菌的检测与分型技术

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肺炎链球菌检测-菌落形态鉴定 Colony Morphology Test

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道传染病室
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
菌落形态鉴定
（Colony Morphology Test ）
试验开始前，请准备：
哥伦比亚血琼脂平板于室温下平衡至少20min。

试验步骤：
1.将疑似标本以三区划线方式接种于哥伦比亚血琼脂平板上。

℃2条件下培养18-20h。

2.35 5%CO
3.挑取疑似菌落，典型菌落形态：脐窝状，灰白色，半透明，草绿色溶菌环。

常见肺炎链球菌菌落形态：草绿色溶血环，灰白色、表面光滑、扁平的可疑菌落；或草绿色溶血环，中央塌陷、边缘隆起、呈脐窝状的可疑菌落；或草绿色溶血环，表面光滑、湿润有粘液的可疑菌落。

4.挑取单个疑似肺炎链球菌菌落，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，35℃条件下
培养18-20h。

5.进行其他肺炎链球菌特异性鉴定。

将菌落形态观察结果及时添加至
Streptococcus pneumoniae isolates data bank。

本手册仅供实验室内部使用 2011年第1
版。

肺炎链球菌研究现况及血清分型

04 肺炎链球菌的预防和控制
疫苗接种的重要性
疫苗接种是预防肺炎链球菌感染的最有效手段，通过接种疫苗可以显著降低肺炎链球菌的发病率和死亡率。
疫苗接种的策略因地区而异，但通常建议对高风险人群进行接种，如儿童、老年人、身体虚弱者以及免疫系统受损者。
目前已有多种肺炎链球菌疫苗，包括多糖疫苗和结合疫苗，这些疫苗可以针对不同血清型的肺炎链球菌提供保护。
感谢您的观看
探索肺炎链球菌的毒力因子
01
深入研究肺炎链球菌的毒力因子及其作用机制，为开发新型药
物和疫苗提供理论支持。
解析肺炎链球菌与宿主细胞的相互作用
02
研究肺炎链球菌如何与宿主细胞相互作用，导致感染和疾病的
发生，揭示其致病机制。
探索肺炎链球菌的耐药机制
03
研究肺炎链球菌对抗生素的耐药机制，为抗生素药物的研发提
详细描述
荚膜多糖是肺炎链球菌的主要抗原，不同血清型具有不同的荚膜多糖抗原，通过检测荚膜多糖抗原可以区分不同血清型。目前已经发现了超过90种不同的荚膜多糖抗原，对应不同的血清型。
分子分型方法
总结词
分子分型方法是一种基于肺炎链球菌基因组序列差异的分型方法，具有高分辨率和高重复性。
详细描述
分子分型方法通过比较肺炎链球菌基因组的序列差异，如单核苷酸多态性、插入序列、重复序列等，来确定不同菌株之间的差异。这种方法能够更精确地区分不同菌株，对于流行病学调查和疾病控制具有重要意义。
抵抗力
抵抗力较强，对一般消毒剂敏感，对青霉素等抗生素敏感。
肺炎链球菌的致病性
致病物质
荚膜、自溶酶、神经氨酸酶、表面蛋白等。
感染途径
主要通过呼吸道飞沫传播，也可通过接触污染物体表面或污染水源传播。

肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程

肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程1.引言肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原微生物，对于疾病的防控具有重要意义。

测定肺炎链球菌的活菌数含量是判断疾病传播性和临床治疗效果的重要指标。

本文档旨在规范肺炎链球菌活菌数含量的测定操作，确保测定结果的准确性和可靠性。

2.实验所需材料肺炎链球菌培养基冰箱分装管微量移液管、移液器和吸头显微镜细菌计数板和计数室3.实验步骤1.取一小瓶肺炎链球菌培养基放置于冰箱中冷藏，保持4℃。

2.取适量肺炎链球菌培养基，分装于无菌分装管中，避免反复冻融，可存放在-20℃的冰箱内长期保存。

3.取一支肺炎链球菌分离菌株，用无菌吸头取适量细菌液，接种于肺炎链球菌培养基中。

4.将接种好的培养基放置于恒温摇床中，在37℃恒温箱中培养24小时。

5.取培养好的细菌液，用无菌吸头吸取适量的细菌悬液，放置在显微镜片上。

6.用显微镜观察细菌悬液中的活菌，计数并记录。

7.将细菌计数板放置在计数室中，将观察到的活菌在计数板上记录。

4.实验注意事项所用材料必须无菌，以防止其他微生物的污染。

活菌的计数应在24小时内完成。

活菌数的检测应重复3次并取平均值。

实验环境应保持洁净，避免灰尘和其他污染物对实验结果造成干扰。

5.结果记录与分析根据实验步骤所得的数据，计算平均活菌数含量，并记录在实验数据表中。

通过对不同样本的活菌数进行比较和分析，可以了解肺炎链球菌的传播程度和感染风险。

6.结论本操作规程提供了一种测定肺炎链球菌活菌数含量的标准化方法，经过验证具备准确性和可靠性。

科学使用本操作规程可以为疾病的早期预防和传播控制提供重要的实验数据支持。

注意：本操作规程仅供参考，具体实施过程请根据实验条件和要求进行调整。

肺炎链球菌鉴定流程

肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。

准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。

该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。

形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。

链条的长度和排列模式可能因菌株而异。

荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。

荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。

血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。

肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。

生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。

胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。

尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。

分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。

PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。

抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。

通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。

鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。

2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。

3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。

4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。

5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。

6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。

7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。

肺炎链球菌分型技术-多位点序列分型

肺炎链球菌相关实验技术操作手册
多位点序列分型（Multi Locus Sequence Typing）
试验开始前，请准备：冰浴。扩增体系配制及样品添加过程需在冰浴上操作。将冷冻保存的试剂取出，室温放置融化后冰浴上备用； Taq 酶直接放置在冰浴上。 1.5%琼脂糖凝胶（含 DNA 染料 4µl/100ml）。试验步骤： 1. 待测样品的 DNA 制备；冷冻保存的 DNA 室温下自然融化后，冰浴放置备用。 2. 扩增体系配置（50µl/reaction）：
编写人:limachao@
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
4. 扩增产物验证：将扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶（含 DNA 染料 4µl/100ml）， 100V，电泳 40min；片段长度 600-800bp。 5. 产物纯化后，连同相应的测序引物送交测序公司测序（每个样品配 5µl 上、下游测序引物，引物浓度 10µM）。 6. 得到序列信息后，递交到相关网站进行序列比对，确定 ST ， /sql/singlelocus.asp ；将分型结果及时添加至 Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
Reference */misc/info.asp
编写人:limachao@
成分名称 10Xbuffer（含 MgCl2） dNTP（10mM） Primer F（20µM） Primer R（20µM） Taq（5U/µl） DNA H2O 体积（µl）3. 扩增条件：
步骤预变性循环-1 循环-2 循环-3 温度 94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 30 个循环延伸保存 72℃ 4℃ 5min 时间 3min 30s 30s 30s

肺炎链球菌研究现况及血清分型

WHO. Weekly Epidemiol Rec 2008;83:1–16
2000年，全球5岁以下儿童肺炎链球菌感染疾病负担估计
1.
1450万肺炎球菌感染病例，发病率为2331/10万。 – – 肺炎病例1380万（95.6%），占到所有肺炎病例（16000万）的 8.6%。脑膜炎病例（10.3万）0.7%，发病率估计为17/10万。
WHO对全球尚未普种/或即将有疫苗可预防疾病的分类
极高度优先肺炎链球菌性疾病疟疾* 霍乱登革热* 乙型脑炎高度优先人乳头瘤病毒感染中度优先甲型肝炎戊型肝炎* 流行性脑脊髓膜炎（B）* 腮腺炎
流行性脑脊髓膜炎（ACW135Y）风疹
狂犬病轮状病毒感染季节性流行性感冒
伤寒黄热病
水痘
5%
中国, 12%
3% 3% 3% 5% 4% 2%
印度
2%
中国尼日利亚
巴基斯坦
孟加拉
印度尼西亚
埃塞俄比亚
印度, 27%
34%
刚果
肯尼亚
菲律宾
其他
2000年全球5岁以下儿童肺炎球菌感染死亡病例数
国家（死亡病例数）
1. India (142 000) 2. Nigeria(86 000) 3. Ethiopia (57 000) 4. Congo (51 000) 5. Afghanistan (31 000) 6. China (30 000) 7. Pakistan (27 000) 8. Bangladesh (21 000) 9. Angola (20 000) 10.Uganda (19 000)
–
NPNM病例（53.8万） 3.7%
2. 82.6万死亡，5岁以下儿童死亡病例的11% （不包括HIV阳性儿童)。

肺炎链球菌检验

3
生物标记物发现
质谱技术可以发现与肺炎链球菌感染相关的生物标记物，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
生物信息学在肺炎链球菌检验中的应用
数据整合与分析
01
生物信息学可以对来自不同实验平台的数据进行整合和分析，
挖掘肺炎链球菌感染相关的生物标志物和药物靶点。
药物设计
02
基于生物信息学方法，可以预测和设计针对肺炎链球菌的新型
兼性厌氧菌
肺炎链球菌为兼性厌氧菌，在有氧或无氧环境下均能生长。
营养要求高
肺炎链球菌对营养要求较高，需要丰富的铁、维生素B等才
能正常生长。
肺炎链球菌的致病性
01
02
03
致病物质
肺炎链球菌主要通过产生毒素和酶致病，如荚膜多糖、溶血素等。
感染途径
感染主要通过呼吸道飞沫传播，也可通过接触污染物品传播。
设备和专业操作。
药敏试验
总结词
药敏试验用于检测肺炎链球菌对抗菌药物的敏感性和耐药性，指导临床合理用药。
详细描述
药敏试验通过在培养基上接种肺炎链球菌，并添加不同抗菌药物，观察细菌的生长情况，从而判断细菌对抗菌药物的敏感性和耐药性。药敏试验对于临床医生选择合适的抗菌药物具有重要意义，能够指导临床合理用药，提高治疗效果并减少耐药性的产生。
疾病类型
感染后可引起大叶肺炎、脑膜炎、中耳炎等多种疾病。
肺炎链球菌的流行病学
季节性流行
肺炎链球菌感染有明显的季节性，冬季和春季是高发季节。
人群易感性
儿童、老年人、身体虚弱者及免疫功能低下者易感。
地区分布
全球范围内均有肺炎链球菌感染的报道，但发病率和病死率存在地区差异。
02

肺炎链球菌检测讲解

国外感染情况
在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性中耳炎30-50％；在发展中国家，每年约有 500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50 万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）
2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约 0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1％的亚甲蓝试剂。
SP血清学分型步骤：
3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单位浓度。
4 用接种环挑取约10μL菌悬液放入载玻片上，再挑取同量的诊断血清（10μl）放入载玻片上，并与菌悬液搅拌混匀。
本地区耐药情况
对红霉素、四环素、复方新诺明、克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为严重，多重耐药发生率为75%，高于北京、上海、杭州地区。
SP培养呼吸道标本的运输和保存
尽快送检，要求2h内送到；
肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而且不适合4℃ 保存；
标本处理前检测是否合格。
痰标本合格的标准：
痰标本鳞状上皮细胞白血球细菌种类
合格
<=10/低倍 >=10
1-3种
不合格 >=25/低倍 <=10
>3种
培养特性
初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好； 18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，
保存挑选新鲜培养物置于保存管中，-76℃ 保存。
复活取出保存管自然平衡至室温，接种适合平板。
SP血清学分型：
肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手段。

肺炎链球菌的检测与分型技术

2020/11/14
41
The Ct value corresponding to the detection level of RT-
PCR and MRT-PCR for pneumococcal serotyping
Serotype
RT-PCT
MRT-PCR
Combined with other serotypes
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
2020/11/14
13
/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾病发病（发表的研究）
2020/11/14
8
沒有感染者
帶菌者
发病者
2020/11/14
9
肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障肺炎球菌菌血症
脑膜炎脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘膜纤毛防御系统
中耳炎鼻咽部移殖
腹膜炎关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
2020/11/14 Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: 10 ASM Press; 1994. p. 322-31
12A
19F
6C
12B
20
7A
12F
21
7B
13
22A

肺炎链球菌的分离和鉴定

精品PPT
1.肺炎链球菌的耐药机制
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-内酰胺类抗生素的作用靶位，改变后使PBP与青霉素G的结合力下降；
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于 1967年；
肺炎链球菌的分离和鉴定
卫生部北京医院
陈东科
精品PPT
概述
肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。
*d.不同菌株
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三、肺炎链球菌的药敏试验
K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液，在15分钟内接种完)作为接种液。
稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和 Etest法。
培养条件：为35℃ 、5％CO2培养20～24小时。质控菌株ATCC 49619。
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2）选择性分离培养基
培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
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3）培养环境 5～10％CO2、35℃培养24～48h。
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（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形
成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。
精品PPT
精品PPT
4.肺炎链球菌感染的治疗
青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗; 青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进
行治疗；如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉

肺炎链球菌的分离和鉴定

血琼脂培养基
将样本接种在含有血液和琼脂的培养基上，适宜的温度下培养，观察是否有肺炎链球菌的生长。
分离步骤
增菌
将采集的样本在适宜的温度和环境下进行增菌培养，使细菌增殖。
纯化
对单个菌落进行纯化培养，确保分离得到的菌株为纯培养物。
ABCD
分离
将增菌后的样本划线接种在选择性培养基上，使肺炎链球菌在培养基上形成单个菌落。
需要加强临床医生和微生物实验室之间的合作，提高肺炎链球菌的早期诊断和治疗效果。
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鉴定
通过形态学观察、生化试验和分子生物学方法对纯化的菌株进行鉴定，确认为肺炎链球菌。
04
鉴定方法
形态学鉴定
总结词
通过观察细菌的形态、染色特性及排列方式，初步判断是否为肺炎链球菌。
详细描述
在显微镜下观察细菌的形态，肺炎链球菌通常呈双排列或四排列，呈革兰氏阳性染色。
生化鉴定
要点一
总结词
通过细菌的生化反应来进一步确定是否为肺炎链球菌。
鉴定准确性
分子生物学鉴定和血清型鉴定的结果一致，表明实验鉴定方法的准确性较高。
临床意义
了解分离菌株的血清型和抗生素敏感性，对于指导临床合理用药、控制感染和预防疾病传播具有重要意义。
06
结论与展望
研究结论
01
肺炎链球菌是引起肺炎的重要病原菌，具有多重耐药性，给临床治疗带来挑战。
02
分离和鉴定肺炎链球菌的方法不断改进，包括传统的培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。
详细描述
肺炎链球菌是一种需氧或兼性厌氧的细菌，在培养基中生长迅速。在血琼脂平板上，肺炎链球菌形成中等大小、灰白色、半透明、圆形、凸起的菌落，表面光滑，周围有明显

肺炎链球菌的分离和鉴定[专家知识]

肺炎链球菌的分离和鉴定
行业精制
1
概述
肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。
行业精制
2
肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠
荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎病原学诊断有
重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
行业精制
4
一、生物学性状
行业精制
10
（2）分离培养
1）标本处理
及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
行业精制
11
2）选择性分离培养基
培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
行业精制
36
行业精制
37
行业精制
38
行业精制
39
4.乳胶凝集试验
结果准确、快速、特异性高。
行业精制
40
行业精制
41
行业精制
42
5. 荚膜肿胀试验
取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量
美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用油
镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明
显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链
行业精制

肺炎链球菌分型技术-多位点序列分型 MLST Typing

多位点序列分型（Multi Locus Sequence Typing）试验开始前，请准备：冰浴。

扩增体系配制及样品添加过程需在冰浴上操作。

将冷冻保存的试剂取出，室温放置融化后冰浴上备用；Taq酶直接放置在冰浴上。

1.5%琼脂糖凝胶（含DNA染料4µl/100ml）。

试验步骤：1.待测样品的DNA制备；冷冻保存的DNA室温下自然融化后，冰浴放置备用。

2.扩增体系配置（50µl/reaction）：成分名称体积（µl）10Xbuffer（含MgCl2） 5dNTP（10mM） 1Primer F（20µM） 0.5Primer R（20µM） 0.5Taq（5U/µl） 1DNA 5H2O 373.扩增条件：步骤温度时间预变性 94℃ 3min循环-1 94℃ 30s循环-2 56℃ 30s循环-3 72℃ 30s30个循环延伸 72℃ 5min保存4℃4.扩增产物验证：将扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶（含DNA染料4µl/100ml），100V，电泳40min；片段长度600-800bp。

5.产物纯化后，连同相应的测序引物送交测序公司测序（每个样品配5µl上、下游测序引物，引物浓度10µM）。

6.得到序列信息后，递交到相关网站进行序列比对，确定ST，/sql/singlelocus.asp；将分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。

Reference*/misc/info.asp。

肺炎链球菌鉴定流程

肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和败血症等严重感染。

其识别需要准确可靠的实验室检测。

以下是肺炎链球菌鉴定的综合流程：显微镜检查：将疑似标本制成涂片，革兰染色。

在显微镜下观察革兰阳性球菌，通常呈卵圆形或兰氏链球菌排列。

培养和形态学特征：疑似标本接种于适当的培养基上，如血琼脂平板。

培养 24-48 小时，观察菌落形态、溶血性（α、β、γ）。

α溶血菌落周围出现绿色透明晕环。

生化反应：进行生化反应，如 katalase 试验、optochin 敏感性试验。

Katalase 阳性菌产生气泡，optochin 敏感菌在含 optochin 的培养基上生长受抑制。

抗原检测：利用免疫学方法检测肺炎链球菌荚膜多糖 (CPS) 抗原。

常见的技术包括乳胶凝集试验和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。

不同血清型荚膜多糖抗原可用于区分不同的肺炎链球菌株。

分子检测：利用聚合酶链反应 (PCR) 等分子技术检测肺炎链球菌特异性基因。

PCR 可快速灵敏地检测出肺炎链球菌，即使在标本量少或菌载量低的情况下。

血清分型：根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同，将其分为 90 多种血清型。

血清分型对于流行病学调查和疫苗接种策略至关重要。

耐药性检测：检测肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性。

常见的抗生素包括青霉素、头孢菌素和宏观内酯类。

耐药性检测结果指导临床治疗方案的选择。

综合解读：结合上述检测结果，综合解读以确定疑似标本中是否含有肺炎链球菌。

准确的鉴定有助于指导患者的管理和控制肺炎链球菌感染的传播。

优势和局限性：肺炎链球菌的鉴定流程提供了准确可靠的结果。

综合方法提高了检测的灵敏性和特异性。

分子检测技术在标本量少或难以培养的情况下尤为有用。

培养时间和抗生素耐药性检测结果的等待时间可能是局限性。

肺炎链球菌的分离和鉴定

实用文档
（1）试管法:
取新鲜培养物分装于两支试管内（每支 1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液 0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。
实用文档
实用文档
（2）平皿法:
加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。
实用文档
实用文档
实用文档
实用文档
实用文档
实用文档
3.抗原结构
（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。
3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌与其他－溶血链球菌相区别；
4. 血清学鉴定特异性高； 5. 要注意对PRP和MDR的检测。
实用文档
谢谢！！！
实用文档
实用文档
实用文档
实用文档
实用文档
4.乳胶凝集试验
结果准确、快速、特异性高。
实用文档
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5. 荚膜肿胀试验
取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少
量美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用
油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限
明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎
链球菌的分型。
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2. 培养特点
（1）培养基

肺炎链球菌分型技术-荚膜肿胀分型

荚膜肿胀分型试验
（Quellung Typing）
试验开始前，请准备：
1%甲基兰溶液。

试验步骤：
1.用无菌棉签刮取新鲜培养的细菌，溶于0.85%的NaCl溶液中，配制3.0麦氏
单位菌悬液。

2.分别吸取分型血清和1%甲基兰溶液各5µl于载玻片上充分混合。

3.在步骤2的混合液中添加5µl步骤1的菌悬液，混合均匀。

4.盖上盖玻片，室温下静置3min。

5.100x油镜下观察试验结果。

尽量在半小时内观察结果，勿要使两个玻璃片间
的液体干燥。

如果镜下观察：荚膜涨起可见（菌体自身肿胀）、菌体周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，为阳性试验结果。

将血清分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。

利用荚膜肿胀法，采用丹麦Statens Serum Institut公司生产的Pneumotest Kit对肺
炎链球菌血清型/群进行鉴别，判定流程如下：。

肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理

肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理肺炎链球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）简称肺炎球菌，是1881年首次由巴斯德及G.M.Stembegr分别在法国和美国分离出来。

肺炎球菌菌体似矛头，呈短链状排列或成双排列的球菌，革兰氏阳性，绝大多数兼性厌氧，偶有专性厌氧，肺炎链球菌的主要致病物质是肺炎球菌溶血素和荚膜。

近年来，越来越多的国家和地区出现耐药性肺炎链球菌菌株的报道，严重威胁着肺链感染的临床治疗，已成为一个呛待解决的健康问题。

1、药敏试验1.1微量稀释法该法是美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的肺炎链球菌药敏试验的参考方法。

该法主要使用经过离子校正的M-H肉汤+2%～5%的溶血马血作为培养基的，然后将抗生素稀释后加人培养基中。

将在羊血平板上的菌落制备菌液，以0.5浊度分装微量板。

在35℃普通条件下培养24h后，人工判断结果。

具体MIC见NCCLS的判定标准。

1.2纸片扩散法NCCLS推荐使用的纸片法药敏试验，主要使用羊血平板，以0.5浊度的菌液接种平板。

对于临床分离株的药敏试验，CO2是必备的环境。

平板应于35℃条件下在5%的CO2中培养24h后进行测量，从正面量取。

抑菌环的大小和质控标准详见NCCLS的规定。

纸片扩散法的优点是简单方便，对非β-内酞胺药物的重复性、准确性均较高，但是在应用于青霉素和头抱类抗生素时准确性明显降低。

2、肺炎链球菌的耐药性检验目前有很多实验室在对血液、脑脊液等体液分离得到的肺炎链球菌耐药性测定时，只检测青霉素的耐药性。

事实证明，多重耐药和对三代头抱耐药的肺炎链球菌越来越多，因此，NCCLS已经明确要求，从脑膜炎者分离出来的肺炎链球菌必须做青霉素、头孢曲松或者头孢他啶的MIC，另外还应检测对万古霉素的耐药性。

对于中枢神经系统以外分离而来的肺链球菌，则首先应该选用苯唑西林来检测其是否对β-内酰胺类药物耐药。

若抑菌环>200mm，证明其对青霉素和β-内酞胺类药物敏感物耐药性；若抑菌环<19mm，则须进一步检测其对青霉素、头孢曲松或头孢他啶的耐药性。

肺炎链球菌检测

粘液性菌落
SP常见菌落
鉴定

Optochin（乙基羟化奎宁，奥普托新）敏感（生长抑制）试验：在涂布细菌的血琼脂平板上贴5μg的Optochin纸片，35℃有氧环境下过夜，出现≥14mm的抑菌环为敏感，草绿色链球菌仅小抑菌环或无抑菌环，肺炎链球菌有少数菌株不敏感。对疑似OP不敏感的肺炎链球菌可用胆汁溶菌试验鉴定。
本地耐药情况趋势：
广东地区儿童PRSP低于匈牙利、韩国、台湾，与香港接近，高于上海、北京，表明广州地区儿童鼻咽部肺炎链球菌对青霉素的耐药情况较为严重，且有上升趋势，可能与滥用抗生素，使细菌产生诱导性耐药有关，也可能由于青霉素不敏感克隆株在国内的传播和蔓延。
本地区耐药情况
大环内脂类抗生素的耐药情况较为严重，其中红霉素的耐药率达80.5%，且多数为高度耐药，其中59%的菌株MIC为256μg/ml，其耐药情况与杭州地区的红霉素的耐药率90.1%、74%的菌株MIC为256μg/ml比要低，大环内酯类抗生素的广泛使用可能是造成其耐药率增加的重要原因；
血清分型

丹麦Statens Serum Copenhagen公司产 pneumotest-kit 23价标准血清分型试剂盒；原理：荚膜肿胀试验；观察：相差显微镜观察最好，可以看到菌体周围有一无色宽厚的环状荚膜。
血清分型

我们的做法：以亚甲蓝染色，普通显微镜可以观察，菌体蓝色，周围有一圈着色较浅的宽的荚膜。
SP培养呼吸道标本的采集

5.儿童以支气管镜抽吸为佳，肺泡灌洗液也不错，或者用弯压舌板压舌，棉拭子伸入咽部取样（临床医生操作）； 6.其他的经人工气道吸引分泌物、穿刺取样、胃内取样均可以取得合格标本（临床医生操作）。