Thermobifidafusca产角质酶摇瓶发酵条件研究[1]

应用与环境生物学报　2005,11(5):608～610 C h in J A ppl Environ B iol=ISSN10062687X　2005210225Ther m obifida fusca产角质酶摇瓶发酵条件研究3毕凤珍1,2　师俊玲1,2　李寅1,2　陈坚1,233(江南大学1工业生物技术教育部重点实验室,2生物工程学院环境生物技术研究室　江苏无锡　214036)摘　要　研究了环境和营养条件等对嗜热放线菌Ther m obifida fusca W SH03211生长及产角质酶的影响;并考察了苹果角质对角质酶诱导效果,分析了该菌产角质酶的机理.摇瓶研究确定了角质酶发酵的最佳种子培养基组成为:90g L-1可溶性淀粉、5g L-1牛肉膏、5g L-1酵母膏、5g L-1NaCl、2g L-1K2HP O4和1%微量元素液,生物量最高达18.5g L-1,种龄取35～40h.最佳环境条件为:pH8.0、5%接种量、培养温度50℃.最佳发酵培养基组成为:1.5%乙醇、5g L-1蛋白胨、5g L-1酵母膏、2g L-1K2HP O4、5g L-1NaCl和1%微量元素液.发酵培养基中添加角质对角质酶合成与分泌有诱导作用,T.fusca的产酶机制为诱导型.采用上述最佳培养条件产角质酶为3.8U mL-1.图4表3参9关键词　嗜热放线菌;角质酶;发酵条件CLC　T Q92CUT I NASE PROD UCT I O N CO ND I T I O NS W I TH TH ERM OB IF I DA FUSCA3B I Fengzhen1,2,SH I Junling1,2,L I Yin1,2&CHE N J ian1,233(1Key L ab of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,2Lab of Environm ental B iotechnology,School of B iotechnology,Southern Yangtze U niversity,W uxi,214036,Jiangsu,China)Abstract　The conditi ons for the gr owth of Ther m obifida fusca W SH03211and cutinase p r oducti on were investigated,and the effect of cutin fr om app le cuticle on enzy me p r oducti on was studied.The op ti m u m culture conditi ons,90g L-1s oluble starch,5g L-1beef extract,5g L-1yeast extract,5g L-1NaCl,2g L-1K2HP O4,1%trace2ele ments s oluti on and pH8.0,were de2ter m ined.L iquid seed of35～40h was inoculated int o fer mentati on mediu m with5%inoculati on volu me.The high level of enzy me p r oducti on(3.8U mL-1in contrast t o for mer1.1U mL-1)was achieved with1.5%alcohol as carbon s ource.Fur2 ther more,4g L-1app le cutin p layed a key r ole in cutinase excreti on and higher cutin content showed no obvi ous effect.This study indicated the possibility that a little cutin could induce high activity of cutinase.Fig4,Tab3,Ref9Keywords　Ther m obifida fusca;cutinase;fer mentati on conditi onCLC　T Q92 角质酶是一种α/β水解酶,属于丝氨酸酯酶,能够降解高等植物表层的角质层.角质是高等植物表层的一种生物聚酯,其单体主要由十六碳、十八碳的羟基脂肪酸和环氧脂肪酸组成[1].苹果、番茄、黄瓜等的角质是其抵御致病菌侵袭的屏障.棉花的角质层是生长过程中表面油状物质硬化形成的,保护棉花免受雨水侵蚀,从而也成为棉纤维精练加工过程中需要去除的主要成分之一[2].角质酶的来源有微生物和花粉[3]两种,其中的微生物来源有真菌(主要为致病真菌)及部分细菌和少数放线菌.作为一种多功能酶,角质酶在生物催化、食品工业、农业化学品、清洁剂、纺织工业等领域均有着较广阔的应用价值[4～5].自上世纪80年代以来,国外有关茄病镰刀菌产角质酶[6]的研究报道较多,在以酿酒酵母、大肠杆菌等为宿主细胞利用基因工程技术在其中表达产酶基因方面也开展了许多研究[7];而国内尚无关于微生物发酵生产角质酶方面的研究报道.本文以嗜热放线菌(Ther m obifida fusca)为研究对象,初步研究了该菌生长和收稿日期:2004206229 接受日期:20042102093国家"863"计划(2003AA322050)资助　Supported by the State H igh Technol ogy Research and Devel opment Pr ogra m of China33通讯作者　Corres ponding author(E2mail:jchen@)发酵生产角质酶的营养与环境条件,为其在纺织行业、农副产品深加工等方面的应用提供一定的参考.1　材料与方法1.1　材料1.1.1　菌种 Ther m obifida fusca W SH03211.1.1.2　种子培养基(ρ/g L-1) 葡萄糖1,胰蛋白胨5,酵母膏5,NaCl5;pH7.4.1.1.3　斜面培养基(ρ/g L-1) 同种子培养基,加琼脂12.1.1.4　发酵培养基(ρ/g L-1) 可溶性淀粉1,胰蛋白胨5,酵母膏5,NaCl5,微量元素液10mL;pH7.4.1.2　方法1.2.1　生物量测定 发酵液于10000r/m in离心10m in,弃去上清液,将收集的细胞用去离子水洗两次,105℃下烘至2 h后称重,计算细胞干重〔ρ(DC W)/g L-1〕.1.2.2　酶活测定 参见文献[8].2　结果与讨论2.1　营养与环境条件对菌种生长的影响2.1.1　碳源种类及浓度对种子生长的影响 考察了葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精及可溶性淀粉、纤维素等不同碳源对种子生长的影响,结果表明,菌体在可溶性淀粉中生长情况最好.随着淀粉浓度的提高,生物量逐渐增大,淀粉80g L -1时细胞干重可达11g L -1;进一步提高碳源浓度时出现淀粉较难溶,且种子液静置后有淀粉析出,说明有部分淀粉未完全被利用,综合考虑将淀粉浓度选在80～90g L -1作为种子培养的合适浓度.2.1.2　氮源对种子生长的影响 在胰蛋白胨、牛肉膏、玉米浆和尿素、氯化铵、硫酸铵等氮源中,菌体在无机氮源培养液中生长缓慢,且最终生物量少于有机氮源.而利用牛肉膏则生长较迅速,生物量亦高于其他氮源,比原条件提高15%.故选择牛肉膏代替胰蛋白胨作为种子氮源.实验过程中发现添加微量Fe 2+、Zn 2+及K 2HP O 4对细胞的生长有较好的促进作用,培养时间可适当缩短2～3h .加入K 2HP O 4之后还原糖残留量比对照低6%,菌体生长情况亦好于没有添加的种子,K 2HP O 4高于5g L -1时生长情况不及对照.在种子培养基中加入K 2HP O 4(ρ≤3g L -1)及适量微量元素利于种子生长.2.1.3　温度对菌体生长的影响 为确定菌种合适的生长温度,实验考察了30℃、37℃、45℃、50℃、55℃几种不同的培养温度对种子生长的影响.当温度低于50℃时菌体长势微弱或生长非常缓慢(40℃);在50℃时还原糖残留较其他温度条件下要少,生物量比45℃、55℃时分别高出8%和26%.因而将温度选在50℃较利于菌体生长.2.1.4　初始pH 对菌体生长的影响 研究了液体种子培养基不同初始pH (6.0、7.0、7.4、8.0、8.4、9.0、10.0)对菌体生长的影响.结果(图12A )表明,pH 值低于7.0时菌丝体生长微弱(数据未显示);初始pH 值在7.0～9.0之间培养基中菌体干重为10g L -1左右;其中pH 为8.0时的菌体干重最大,达13g L -1,镜检时菌丝体饱满并分支较多,表明菌体生长较旺盛.由于T .fusca 为放线菌,故其最适pH 略偏碱性.图1　初始pH (A )和培养时间(B )对菌体生长的影响Fig .1　Effect of initial pH (A )and culture ti m e (B )on cell gr owth2.1.5　培养时间对菌体生长的影响 为确定合适的种龄,在以上种子基本培养条件下,得出种子生长过程曲线如图12B 所示,显示了48h 内菌体生长变化情况,由生长过程中生物量的变化可知,要获得健壮且数量众多的发酵种子,菌体培养到35～40h 左右是较理想的收获时间.图2　角质添加量对产酶的影响Fig .2　Effect of cutin on enzy me p r oducti on2.2　发酵条件对产酶的影响2.2.1　角质对产酶的影响 在病原菌侵入植物过程中,植物体表的角质层是病原菌必须突破的第一层障碍.研究证明,角质酶在决定病原菌致病性方面有重要意义.由这一致病机理启发,实验考察了从果蔬加工废弃果皮中粗提的苹果角质对角质酶诱导效果.图2结果显示,发酵培养基中无角质存在时,酶活不足0.01U mL -1;加入一定量的角质后酶活有明显提高,同等条件下可达0.4U mL -1.角质含量大于4g L -1时,诱导效果与4g L -1时接近,主要是因角质为不可溶性生物聚酯,细胞对其利用不同于可溶性的小分子物质.这使得产酶趋于稳定,不再随着粗角质含量的增加而增加.这说明利用少量诱导物获得高酶活有一定的潜力,此外产酶条件进一步优化有望使诱导效果和酶活提高更明显,在后期研究中均添加角质以促进产酶.图3　不同碳源条件下菌体产酶的情况Fig .3　Effect of different carbon s ources on cutinase excreti on2.2.2　碳源对酶活的影响 实验发现,淀粉浓度的提高不利于产酶(数据未列出),其原因在于淀粉在发酵体系中最终以葡萄糖形式被细胞利用,而葡萄糖对于角质酶分泌存在抑制作用[9].因此,考虑用其他发酵碳源取代淀粉(如乙醇等)以减轻抑制效应.图3结果表明,乙醇作为发酵培养基时产酶水平906　5期毕凤珍等:Ther m obifida fusca 产角质酶摇瓶发酵条件研究 要高于其他碳源,可减轻葡萄糖抑制效应,酶活可提高近2.5倍,而直接以葡萄糖作碳源时酶活仅0.15U mL -1.实验进一步考察了乙醇浓度对角质酶分泌的影响,结果表明,培养基中乙醇在φ=1%～1.5%时酶活力达3.5U mL -1,要高于其它浓度;随着乙醇浓度的进一步提高,菌体产酶逐渐降低.通过乙醇对酶活测定影响的对照实验证明其促进酶活力提高不是源于测定的干扰.对乙醇不同加入时间的考察结果显示,在发酵开始时加入对产酶和菌体生长均有利,到中后期加入乙醇产酶水平逐渐下降,故采用发酵初期加入.2.2.3　接种方式及接种量对酶活的影响 研究初始阶段接种方式是将高残糖(近30g L -1)的种子液直接接入发酵培养基,随着接种量的提高,酶活急剧下降,这与种子培养基中含一定量葡萄糖相关.葡萄糖的抑制效应影响菌体分泌角质酶(表1),考虑以收集菌体的接种方式减轻其抑制效应(图4亦采用此法),即吸取定量的对数期后期种子液于无菌离心管中,离心后用等体积发酵培养基洗涤后接种发酵.实验结果表明发现,这一接种方式可较好解决葡萄糖的负面影响,酶活比原条件下高出2.59U mL -1.表1　接种方式对细胞生长和产酶的影响Table 1　Effect of inoculati on way on cell gr owth and enzy me p r oducti on接种方式I noculati on way残糖Residual sugar(ρ/g L -1)角质酶酶活Cutinase(λ/U mL -1)细胞干重D ry cell weight〔ρ(DC W )/g L -1〕直接接种发酵Natural inoculation0h 120h 2.5740.203 1.03 3.5收集菌体接种发酵I noculati on with collected cells0h 120h0.3730.1003.622.73图4　接种量对产酶的影响Fig .4　Effect of inoculati on volume on enzy me p r oducti on表2　试验因素和水平Table 2　Fact ors and levels水平Level 因素Fact orA:碳源C s ource B:氮源N s ource C:pH1可溶性淀粉Soluble starch 牛肉膏Beef extract 7.42乙醇A lcohol 蛋白胨Pep t one 83乙酸钠Sodium acetate 玉米浆Corn syrup8.4表3　正交试验结果的极差分析Table 3　Range analysis of orthogonal test编号No .A B C 角质酶酶活Cutinase (λ/U mL -1)11130.882211 3.773312 1.294122 1.585223 3.386321 1.0571310.668232 3.559333 1.00K1 3.12 5.94 5.48K210.71 6.01 6.42K3 3.33 5.22 5.25k1 1.04 1.98 1.83k2 3.57 2.00 2.14k3 1.11 1.74 1.75R2.530.260.39图4显示的是接种量对产酶的影响,结果表明,接种量在φ=5%左右,细胞生长和产酶情况均良好,酶活可达3.8U mL -1.2.2.4　碳源、氮源及pH 值的综合影响 在上述实验基础上,为综合考察碳源、氮源及初始pH 值因素对产酶的影响,设计了正交试验,如表2.从表3实验结果可看出,碳源、氮源及pH 三个因素中碳源极差变化最大,其对产酶的影响最大,可直观看出A 2B 2C 2(即乙醇、蛋白胨、pH 8.0)是最佳水平组合,这一组合验证了前面碳源考察的实验结果.2.2.5　发酵培养基中添加棕榈酸对产酶的影响 162羟基棕榈酸是多种植物表皮中角质的主要单体成分,为考察棕榈酸对菌体产酶是否存在诱导作用,在发酵培养基中添加适量棕榈酸(棕榈酸在水中溶解度很低,常温下为7.2mg L -1).实验结果显示,棕榈酸对产酶不存在诱导作用,且使得细胞分泌角质酶明显减弱(相比无棕榈酸条件下酶活),仅达0.4U mL -1.本文对T .fusca 的营养条件和发酵产角质酶的条件作了一定研究,在国内关于微生物产角质酶方面属首次报道,对于影响该菌产酶的其他因素及相关酶学性质方面正在进一步研究中.References1　K olattukudy PE .Bi opolyester me mbranes of plants :cutin and suberin .Sci 2ence ,1980,208:990～10002　周文龙.酶在纺织中的应用.北京:中国纺织出版社,2002.140～1503　Jiang CJ (江昌俊).Puriflcati on of esterase in anthers and cutinase .J An 2hui Agri Univ (安徽农业大学学报),1996,23:90～934　CristinaMLC,Maria RAB,Joaqui m MS C .Cutinase:fr o m molecular level t o bi opr ocess devel opment .B iotechnol B ioeng ,1999,66:17～345　K olattukudy PE .Cutinase cleaning co mpositi ons .US Patent,4981611.19912012016　Ofir D,Shi m on G,Carl os G D.Potental use of cutinase in enzy matic scou 2ring of cott on fiber cuticle .Appl B ioche m &B iotechnol ,2002,102:277～2897　Theo V,Phili ppe D,Chris V,Cees S .Fr o m gene t o pr oduct in yeast:pr o 2ducti on of funal cutinase .Enzy m e &M icrobial Technol ,2000,26:812～8188　Sheryl F,G te J,Rajni HK .Purificati on of reco mbinant cutinase by extrac 2ti on in an aqueous t w o 2phase syste m facilitated by a fatty acid substrate .B iotechnol B ioeng ,2001,73:465～4759　FettWF,W ijey C,Moreau RA,Os man SF .Pr oducti on of cutinolytic ester 2ase by fila ment ous bacteria .Lett Appl M icr obiol ,2000,31:25～29016 应用与环境生物学报 C h in J A ppl Environ B iol 11卷。