201109-调制叶绿素荧光原理及PAM荧光仪应用
叶绿素荧光原理及理论
叶绿素荧光原理及理论
叶绿素荧光原理及理论
叶绿素荧光原理及理论
叶绿素荧光原理及理论
第二部分：脉冲调制荧光参数测定原理及意义
叶绿素荧光原理及理论
一：叶绿素荧光的五个基本参数
FO； FM； FS； FM’； FO’
叶绿素荧光原理及理论
FO ：最小荧光（或基础荧光等）；充分暗适应的光合机构全部 PS
● ФPSII（ Ф II）+ ФNPQ + Ф NO = 1 ФPSII：实际光化学效率
（光化学量子产额）
ФNPQ：包括天线耗散和反应
中心的失活
ФNO：非光诱导的淬灭
叶绿素荧光原理及理论
● 表示光合电子传递去向的荧光参数：
Je(PSII) =0.5 × α× ФPSⅡ × PFD；单位时间内通过PSII的全部电子流
1 荧光参数在文献中常见的出现形式
Sakamoto W, Takahashi Y. The Plant Cell, 2003(15), 2843-2855
叶绿素荧光原理及理论
●：33% ○：78% ▼：100%
图示：不同展开程度的大豆叶片荧光参数Fv/Fm的日变化
叶绿素荧光原理及理论
Jiang CD et al. EEB 2006
叶绿素荧光原理及理论
5 盐击过程中电子传递过程的研究
盐击
21% O2
▲: 净光合速率 ■: PSII实际光
化学效率
2% O2
盐击
盐击过程中光合速率（Pn， ▲）和PSII光量子效率（ΦPSII，■）的变化
叶绿素荧光原理及理论
◆ ：21% O2 ■ ：2％ O2
A: 气孔导度（Gs） B：光化学猝灭系数（qP） C：光能捕获效率（Fv’/Fm’） D: 非光化学猝灭系数（NPQ）
09-调制叶绿素荧光原理及pam荧光仪应用
Fm
Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm Y=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’
qP=(Fm’-F)/(Fm’-Fo’) qN=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo) NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’
NPQ
Fv
Fm’
ΔF
qP
F
Fo
Fo’
SP
ML
AL
SP AL ML
光化学淬灭可以被一种短饱和脉冲光（0.2－1 s）暂时完全抑制， 剩余的荧光淬灭就是非光化学淬灭
ΦPS II=Yield=(Fm’-Fs)/Fm’=ΔF/Fm’=qP·Fv’/Fm’ : 任一光照状态下PS II的实际量子产量（实际光合能 力、实际光合效率） 不需暗适应，不需测定Fo’，适合野外调查
常用叶绿素荧光参数
光化学淬灭 qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’) （基于“沼泽模
0.1 μE/m²s
100 μE/m²s
乙醇提取物
(F) (D)
(P)
P+D+F=1
F = 1- P - D
任一状态下的荧光产量是将最大荧光（Fm）淬灭的结果
光化学和非光化学荧光淬灭
光强与叶绿素荧光的关系
Fm
测量光
饱和光
叶绿素荧光
Fo
1
2000
光强 µmol m-2 s -1
E=P + D + F = 1 （能量守恒定律） 打开饱和脉冲时：P=0, F=Fm, D=Dm, Dm=1－Fm 假设在打开饱和脉冲的短暂时间内，D/F的比值保持不变
能量转换和保护性的调节机制（如热耗散）不足以将植物吸收的光能 完全消耗掉。也就是说，入射光强超过了植物能接受的程度。这时， 植物可能已经受到损伤，或者（尽管还未受到损伤）继续照光的话植 物将要受到损伤。Y（NO）是光损伤的重要指标。
叶绿素荧光原理与应用
主要与类囊体膜上和间质中的一些反应
过程包括碳代谢之间的相互作用有关。
测定与分析
荧光测定和猝灭分析需要几种不同的光源： 1. 检 测 光 （ 调 制 光 ） ― 绿 光 ： 光 强 PPFD 小 于 10μmol· m-2· s-1，用于测Fo。 2. 作用光― 通常用白光，用于推动光合作用的光 化学反应，光强可因实验目的不同而变化。 3. 饱 和 脉 冲 光 ― 通 常 用 白 光 ， 光 强 PPFD 大 于 3000μmol· m-2· s-1，确保QA全部还原，用于测Fm 和Fm'。 4. 弱远红光（或暗）―以便 PSI 推动 QA 氧化，测 Fo'前使用。
Fm’― 光下最大荧光，在光适应状态下全部 PSII 中心都关闭时的荧光强度， qp=0，qN≥O。Fm' 受非 光化学猝灭的影响，而不受光化学猝灭的影响。 Fo’― 光下最小荧光，在光适应状态下全部 PSII 中心都开放时的荧光强度，qp=1，qN≥0。为了使照 光后所有的 PSII 中心都迅速开放，一般在照光后和 测定前应用一束远红光（波长大于 680nm，使用的 波长735nm，几秒钟）。 Fv― 黑 暗 中 最 大 可 变 （ variable） 荧 光 强 度 ， Fv=Fm-Fo。 Fv’―光下最大可变荧光强度， Fv'=Fm'-Fo'。
叶绿素荧光诱导动力学
当一片经过充分暗适应的叶片从黑
暗中转入光下后，叶片的荧光产额 会随时间发生规律性的变化，即 kautsky效应，典型荧光诱导动力学 曲线上几个特征性的点分别被命名 为O、I、D、P、S、M和T
叶绿素荧光诱导动力学曲线
在照光的第一秒钟内，荧光水平从O上 升到P,这一段被称为快相； 在接下来的几分钟内，荧光水平从P下 降到T，这一段被称为慢相。 快相与 PSII 的原初过程有关，慢相则
叶绿素荧光原理与PHYTO-PAM的应用-自来水厂
PAM测量的荧光曲线——饱和Fm =(Fm-Fo)/Fm : PS II的最大光化学量子产量 • 高等植物一般在0.8－0.84之间 • 当植物或藻类受到胁迫（Stress）时，Fv/Fm显著下 降! • ΦPS II=(Fm’-Fs)/Fm’=ΔF/Fm’=qP·Fv’/Fm’ : PS II光化学能量转换的有效量子产量， PS II有效 光化学量子产量 • 不需暗适应，不需测定Fo’，适合野外调查
PhytoWin的7个功能窗——5 Settings：仪器参数设置窗
PhytoWin的7个功能窗——6 Reference：显示/测量蓝藻、绿藻和硅/甲 藻的参考图谱
PhytoWin的7个功能窗——7 Delta F：基于可变荧光的特殊测量模式， 可以测量“光合有效叶绿素”
开始测量时
结束测量时
叶绿素荧光参数
• qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’) :光化学淬灭 • 即由光合作用引起的荧光淬灭，反映了光合活性的高低
• 非光化学淬灭
• qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo) • NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1 ，不需测定Fo’，适合野外 调查 • qN或NPQ反映了植物耗散过剩光能为热的能力，反映了植 物的光保护能力
谢 谢!
walz@ zg_han@
叶绿素荧光原理 与PHYTO-PAM的应用
泽泉科技有限公司
光系统与光合作用 基本过程
光合作用作为地球上最重要的化学反应，主 要在绿色植物叶肉细胞的叶绿体内进行
光合作用过程
光反应
暗反应
光合膜的结构
PS II
Cytb6/f
PS I
叶绿素荧光介绍范文
叶绿素荧光介绍范文叶绿素荧光是指在光合作用过程中，叶绿素分子吸收光能后，发生激发态跃迁并发出荧光的现象。
叶绿素荧光是一种非常重要的生物物理过程，具有广泛的应用价值。
本文将介绍叶绿素荧光的原理、测量方法以及在科研和实际应用中的应用。
叶绿素是植物和一些藻类的主要光合色素，通过吸收可见光谱范围内的光能完成光合作用。
当叶绿素分子吸收光子能量后，电子被激发到高能态，形成激发态叶绿素分子。
受到环境因素的影响，一部分激发态叶绿素分子会通过非辐射跃迁和辐射跃迁的方式返回基态状态，释放出荧光能量。
透过测量和分析叶绿素荧光信号的强度和特性，可以得到一系列与光合作用相关的参数，揭示植物光合效率、光能利用和生理状态等信息。
叶绿素荧光的测量方法主要有两大类，即暗态和光态测量。
暗态荧光测量是在暗室或在减光条件下进行的，可以获得植物的荧光最大强度（Fm）和基线荧光（Fo）。
光态荧光测量则是在光照条件下进行的，通过测量荧光上升曲线，可以得到植物的最大光能利用率（Fv/Fm）和各个光合参数的变化情况。
叶绿素荧光在科研领域中广泛应用于植物生理生态学、植物营养和环境生态等研究中。
首先，叶绿素荧光可用于评估植物的光合效率和光能利用率，解析光合系统的功能状态。
通过测量和分析叶绿素荧光信号，可以得到Fv/Fm、ΦPSII等参数来评估光合效率和光合系统的效能。
其次，叶绿素荧光还可用于评估植物的生理状态和逆境胁迫。
逆境条件（如高温、干旱、盐碱等）会导致光合机构和光合膜的破坏，进一步影响光合效率和荧光参数的变化。
通过测量叶绿素荧光，可以揭示植物在逆境下的应对机制和生理变化。
此外，叶绿素荧光还可以应用于植物的品种筛选和产量预测，帮助农业生产的改良和优化。
叶绿素荧光在实际应用中也具有广泛的价值。
例如，在植物病害与虫害防治中，叶绿素荧光可以作为一个快速而灵敏的指标来评估植物的抗病性和抗虫性。
通过监测植物的荧光参数，可以及早发现植物的应激状态并采取相应的防治措施。
分析叶绿素荧光的原理和应用
分析叶绿素荧光的原理和应用叶绿素荧光是一种十分常见的现象，它不仅仅是生命科学领域中的一个重要指标，同时还有广泛的应用前景。
本文将从原理、测量方法、应用方面进行分析，探究叶绿素荧光的作用和意义。
一、原理叶绿素荧光的产生是叶绿素分子吸收光子所产生的能量，在发生碰撞后的一部分能量导致光子发射出去发生荧光。
这种发射光谱是叶绿素基态发射峰的红外边，并且受到长波长（630 nm）和短波长（450-460 nm）激发的光谱区域。
其中，630 nm波长激光产生的荧光一般称为永久荧光（P叶绿素荧光），450 nm波长激光产生的荧光则通常称为瞬态荧光（R叶绿素荧光）。
叶绿素荧光的产生与叶绿素分子的光合作用有着密不可分的联系。
在光合作用中，叶绿体中的叶绿素会吸收光子，将其能量捕获并传递给其他分子，最后被转化为化学能。
但在某些情况下，能量被退回到叶绿素中，这样就会产生荧光发射。
因为荧光光谱的位置和形态与吸收光谱是相反的，所以通过荧光可以了解叶绿素分子的吸收和转移过程。
二、测量方法通过测量叶绿素荧光可以获取许多与光合作用有关的信息，包括叶绿素荧光发射的强度和发射峰的位置等。
测量叶绿素荧光的方法可以分为光谱测量和成像测量两种。
在光谱测量中，通常使用荧光光谱仪对样品进行测量。
通过选择合适波长的激发光及检测荧光的波长范围，可以获取不同波段的荧光光谱。
这种测量方法适用于对荧光分子光学特性的研究和对不同类型样品的快速分析。
成像测量则是通过显微成像技术实现的。
光学显微镜通常需要卷起样品和探针，然后将样品放在显微镜下面进行观察。
从这样的观察中可以光学地感知叶绿素荧光分布的空间分布和位置信息。
三、应用叶绿素荧光的应用非常广泛。
它可以用于控制光照条件和生长，了解植物的代谢和健康状态。
同时，还可以通过测量不同波段的荧光光谱和波长，对不同类型的样品进行研究和分析。
1. 光合作用研究光合作用是植物在光照下进行的复杂反应过程，荧光在这个过程中起着至关重要的作用。
调制叶绿素荧光仪原理简介
调制叶绿素荧光仪调制叶绿素荧光仪原理简介原理简介刘君华（河北先河环保科技股份有限公司，河北，石家庄，050035ljh51@）1）调制叶绿素荧光调制叶绿素荧光全称脉冲-振幅-调制（Pulse-Amplitude-Modulation,PAM）叶绿素荧光，我们国内一般简称调制叶绿素荧光，测量调制叶绿素荧光的仪器叫调制荧光仪，或叫PAM。
调制叶绿素荧光（PAM）是研究光合作用的强大工具，与光合放氧、气体交换并称为光合作用测量的三大技术。
由于其测量快速、简单、可靠、且测量过程对样品生长基本无影响，目前已成为光合作用领域发表文献最多的技术。
2）调制叶绿素荧光仪的工作原理1983年，WALZ 公司首席科学家，德国乌兹堡大学教授Ulrich Schreiber 博士利用调制技术和饱和脉冲技术，设计制造了全世界第一台脉冲振幅调制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）荧光仪——PAM-101/102/103。
所谓调制技术，就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包括背景光很强时。
正是由于调制技术的出现，才使得叶绿素荧光由传统的“黑匣子”（避免环境光）测量走向了野外环境光下测量，由生理学走向了生态学。
所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于1s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。
饱和脉冲（Saturation Pulse,SP）可被看作是光化光的一个特例。
光化光越强，PS II 释放的电子越多，PQ 处累积的电子越多，也就是说关闭态的电子门越多，F 越高。
当光化光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用）的强度时，就称之为饱和脉冲。
打开饱和脉冲时，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，F 达到最大值。
经过充分暗适应后，所有电子门均处于开放态，打开测量光得到Fo，此时给出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。
叶绿素荧光原理与应用
叶片荧光的暗－光适应曲线
荧光猝灭
荧光猝灭就是荧光产额降低。 荧光猝灭就是荧光产额降低 。 一切使荧光 产额低于其最大值的过程， 产额低于其最大值的过程 ， 都被称为荧光猝灭 过程。对于不同荧光猝灭组分的分辨， 过程 。 对于不同荧光猝灭组分的分辨 ， 能够提 供关于光合机构功能状态的重要资料。 供关于光合机构功能状态的重要资料。 荧光猝灭可分两类： 荧光猝灭可分两类： 光化学猝灭， 一 、光化学猝灭，即由光化学反应引起的 荧光产额的降低，它有赖于氧化态Q 的存在。 荧光产额的降低，它有赖于氧化态QA的存在。 非光化学猝灭，即由非光化学过程， 二 、非光化学猝灭， 即由非光化学过程 ， 例如热耗散过程引起的荧光产额的降低。 例如热耗散过程引起的荧光产额的降低 。 它是 植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。 植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。
Fm’―光下最大荧光，在光适应状态下全部PSII 中心都关闭时的荧光强度，qp=0，qN≥O。Fm' 受非 光化学猝灭的影响，而不受光化学猝灭的影响。 Fo’―光下最小荧光，在光适应状态下全部PSII 中心都开放时的荧光强度，qp=1，qN≥0。为了使照 光后所有的PSII中心都迅速开放，一般在照光后和 测定前应用一束远红光（波长大于680nm，使用的 波长735nm，几秒钟）。 Fv― 黑 暗 中 最 大 可 变 （ variable） 荧 光 强 度 ， Fv=Fm-Fo。 Fv’―光下最大可变荧光强度， Fv'=Fm'-Fo'。
叶绿素荧光诱导动力学
当一片经过充分暗适应的叶片从黑 暗中转入光下后， 暗中转入光下后，叶片的荧光产额 会随时间发生规律性的变化， 会随时间发生规律性的变化，即 kautsky效应 效应， kautsky效应，典型荧光诱导动力学 曲线上几个特征性的点分别被命名 为O、I、D、P、S、M和T
调制叶绿素荧光原理及PAM-2500荧光仪应用
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陆地环境应用 水环境应用
Terrestrial Applications Aquatic Applications
z 三角褐指藻（30篇）
z 褐藻（29篇）
z 角毛藻（16篇）
z 微囊藻（41篇）
z 海链藻（20篇）
z 聚球藻（39篇）
z 浒苔/石莼（28篇）
z 集胞藻（62篇）
z 紫菜（20篇）
z 原绿球藻（5篇）
z 龙须菜（13篇）
z 螺旋藻/节旋藻（19篇） z 珊瑚及共生藻（81篇）
z 鱼腥藻wwww（ww9..zz篇eeaall）oomm
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Innovation Award of ISPR
This award was given for the first time at PS07 in Glasgow. Recognizing the potential for insights from photosynthesis to contribute to progress in fields ranging from solar energy to global climate change, ISPR wishes to encourage its members to explore innovative practical applications of their results. The Award recognizes outstanding achievement in the transfer of photosynthesis research to the benefit of society at large, enhancing the visibility of the discipline in the process.
叶绿素荧光原理与应用
基本步骤
在植物对各种环境胁迫响应的分子机理研究中 ，为了获得未遭受任何环境胁迫的对照叶片的基本荧 光参数，首先需要让对照叶片经过一个充分的暗适应 过程。
首先，给一个经过充分暗适应的叶片照射检 测光，经过一小段时间（1~2min）荧光水平稳定后得 到荧光参数Fo。接着，给一个饱和脉冲光，一个脉冲 后 关 闭 ， 得 到 荧 光 参 数 Fm， 于 是 得 到 荧 光 参 数 Fv/Fm(Fv=Fm-Fo)，即潜在的PS II的光化学效率
Fv/Fo－ 是 Fv/Fm 的 另 一 种 表 达 方 式 ， Fv/Fo=(Fv/Fm)/(1-Fv/Fm)。Fv/Fo不是一个直接的效率 指标，但是它对效率的变化很敏感，一些处理引起的 Fv/Fo 变 化 的 幅 度 比 Fv/Fm 变 化 的 幅 度 大 得 多 ， 所 以 Fv/Fo在一些情况下是表达资料的好形式。
植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。
精品课件
非光化学猝灭涉及三个不同的机理： qE—— 依 赖 类 囊 体 膜 内 外 的 质 子 浓 度 差 ， 暗 弛 豫 的 半 时 间 t1/2<1min，快相。 qT——依赖状态1向状态2的转换，PS II的捕光复合体磷酸化 ，脱离PS II，从类囊体的基粒区迁移到间质片层区，从而减少 激发能向PS II的分配，增加激发能向PS I的分配，t1/2=8min， 中间相。它比qE和qI小得多，强光下qE和qI增加，而qT受抑制 。 qI——与光合作用的光抑制有关，可变荧光与最大荧光比值 的降低，t1/2=40min，慢相。关于这后一种非光化学猝灭，有三 种假说。假说一：这种非光化学荧光猝灭起源于PS II的反应中 心，部分PS II中心发生变化，虽然还能捕捉激发能，但不能进 行光化学反应，而把能量变成热。假说二：这种非光化学荧光 猝灭起源于PS II的天线色素，它通过非辐射能量耗散消耗激发 能，与叶黄素循环过程中生成的玉米黄素有关。假说三：这种 非光化学荧光猝灭与D1蛋白的精失品课活件 和降解有关
叶绿素荧光测量技术的研究和应用
叶绿素荧光测量技术的研究和应用第一章：引言叶绿素是植物中最重要的色素之一，它扮演着光合作用中接收光能并转化为化学能的关键角色。
叶绿素荧光测量技术是一种非常重要的研究工具，可以用来研究光合活性、光合效率、光抑制等重要生理过程，也可以应用于诊断植物生长状况、诊断植物病害等方面。
本文将介绍叶绿素荧光测量技术的原理、方法、应用和研究进展，旨在为植物生理生态学研究及相关领域的学者们提供参考。
第二章：叶绿素荧光的原理叶绿素的荧光是当叶绿体受到激发光后，叶绿素分子上的电子会被升级到一个比较高的能级，不过这些电子并不会一直停留在高能级状态，而是很快被释放出来，会转移到低能级的非辐射能量耗散通道或荧光激发态。
在荧光激发态下，叶绿素分子的电子还可以通过荧光发射过程重新下降到低能级，从而发出荧光。
因此，测量叶绿素荧光强度可以反映叶绿体光能利用效率和非光化学猝灭过程的变化。
第三章：叶绿素荧光测量技术方法目前，叶绿素荧光测量主要包括三种方法：PAM法、Fv/Fm法和OJIP法。
1. PAM法(Pulse-Amplitude-Modulation Fluorometry)PAM法是通过短脉冲的闪光激发来测量样品上的叶绿素荧光，可以实时监测光合作用中的叶绿体荧光动态变化。
PAM法可以提供多个参数，如【F_v/F_m、q_p、q_n、qL、NPQ、PC】等，可以用来评估光合效率、光能利用率、光合生产力、光保护等。
2. Fv/Fm法Fv/Fm法是一种基于暗态下叶绿素荧光的测量方法，只需在样品叶片完全暗闭的情况下进行测量，即可获得键值。
当输入一束光子时，最初的叶绿素荧光值 F_0 只能是基础荧光，接着用一个有效的光子流量激发叶绿体，此次荧光值F’m跟踪了激发过程并且在适当的时间点(约10-30毫秒)处被快速读出，此荧光值是定义为Maximal photosystem Ⅱ quantum yield Y(Ⅱ)或称 Fv/Fm(F )。
植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法
植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法植物体叶绿素荧光测定仪是一种用于测定植物叶片中叶绿素荧光信号的仪器。
它通过测量叶绿素荧光信号的强度和相关参数，可以评估植物的光合作用效率、生理状态以及环境胁迫的影响。
本文将介绍植物体叶绿素荧光测定仪的原理和使用方法。
一、原理植物体叶绿素荧光测定仪的原理基于叶绿素分子在光合作用中的光能吸收和释放过程。
植物在受到激发光照射后，部分能量被叶绿素分子吸收，电子从低能级跃迁至高能级，形成激发态叶绿素。
随后，叶绿素分子从激发态返回基态时，会释放出一部分能量以荧光的形式发射出来。
叶绿素荧光信号的强度和相关参数反映了植物叶片中光合作用的效率和状况。
1.准备工作：将叶绿素荧光测定仪放置在需要测量的植物叶片上方，并使光源与测定区域保持适当的距离。
2.调节参数：根据测定要求，设置合适的测量参数，如光强、光源波长和测量时间等。
3.激发光照射：打开仪器的光源开关，使光源照射到叶片上。
4.荧光信号采集：仪器上的探测器会收集叶绿素荧光信号，并将信号转换为电信号。
5.数据输出：荧光信号的强度和相关参数会显示在仪器上，并可以通过连接计算机等设备进行数据存储和分析。
二、使用方法使用植物体叶绿素荧光测定仪需要一些基本的步骤和操作注意事项，以确保测量结果的准确性和可靠性。
1.叶片准备：选择需要测量的叶片，并确保叶片表面干净无明显损伤。
2.仪器检查：检查仪器的电源和仪器的各个部件是否正常运转，并确保仪器处于稳定状态。
3.参数设置：根据测量要求，设置合适的测量参数，如光强度、测量时间和光源波长等。
4.光源照射：打开仪器的光源开关，使光源照射到叶片上，并确保光源与叶片的距离合适。
5.信号采集：观察仪器上的荧光信号显示，并等待一定时间以确保稳定性，然后进行荧光信号采集。
6.数据分析：根据测量所得的荧光信号强度和相关参数，结合预先设定的标准曲线或参考值进行数据分析和解释。
使用植物体叶绿素荧光测定仪时需要注意以下几点：1.保证测量环境的稳定性，避免光照强度和温度等因素对测量结果的影响。
[教育学]叶绿素荧光分析技术与应用
![[教育学]叶绿素荧光分析技术与应用](https://img.taocdn.com/s3/m/137dca75d1f34693dbef3e77.png)
光合电子传递的”Z图”
实用文档
荧光测量基础：
植物叶片所吸收的光能有3个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。 3个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两 个产量的下降。测量叶绿素荧光产量，可以获得光化学过程与热 耗散效率的变化信息。
热耗散
激发能
光化学反应 形成同化力
荧光
CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢
• 光合作用过程的各个步骤密切偶 联，因此任何一步的变化都会影 响到PS II从而引起荧光变化，也 就是说通过叶绿素荧光几乎可以 探测所有光合作用过程的变化
实用文档
尽管叶绿素荧光产量仅占叶片吸收光能问题的1－2%，但测量 却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此 荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时 测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。 叶绿素荧光测量是相对的，因为光线不可避免会有损失，因 此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括进一步计算 的许多参数。
打开饱和脉冲时，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为 了叶绿素荧光和热，F达到最大值。
经过充分暗适应后，所有电子门均处于开放态，打开测量光得到Fo，此时给 出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光 和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和Fo可以计算出PS II的最大量子 产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潜在最大光合能力。
所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于1 s）的强光关闭 所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。饱和 脉冲（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一个特例。光化光越强， PS II释放的电子越多，PQ处累积的电子越多，也就是说关闭态的电子门越多， F越高。当光化光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用）的强度时， 就称之为饱和脉冲。
叶绿素荧光理论概述
.55
.50
.45 .6 (C) .5
.4
.3
.2
.1 0 100 200 300
NaCl (mmol/L)
Ca2+ 对NaCl胁迫下杂交酸模 叶片PSII光化学反应的影响
●： ck ○： 8 mmol/L Ca2+
Ca2+ 对不同浓度NaCl胁迫 下杂交酸模叶片光化学猝灭 （qP），PSII反应中心光 能捕获效率（Fv’/Fm’）和 PSII光量子效率(ΦPSII, ) 的影响
荧光随时间变化的曲线称为 叶绿素荧光诱导动力学曲线
Fluorescence intensity Fluorescence intensity
5000 P
4000
3000
2000
1000 O
0 0
100
200
Time (s)
5000
A
B
P
4000
3000
T O
2000 T
1000
0 300 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
用连线激发式荧光仪测定的荧光诱导曲线
Relative fluorescence intensity
1.2
O
KJ I
P
1.0
c
.8
a()
.6
c'
b
.4
.2
b'
0.0 100 101 102 103 104 105 106 107
Time (s)
连续激发式荧光仪有：Handy PEA， PEA，Pocket PEA， PEA Senior, M-PEA 等
叶绿素仪测定原理
叶绿素仪测定原理小伙伴们！今天咱们来唠唠叶绿素仪的测定原理，这可是个很有趣的事儿呢。
咱先得知道叶绿素是个啥。
叶绿素啊，就像是植物的小太阳伞，它在植物的小世界里可起着超级重要的作用。
植物通过叶绿素来吸收阳光，然后进行光合作用，就像我们吃饭一样，这是植物获取能量的方式呢。
叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b等类型，它们就像植物体内的小魔法精灵，让植物变得绿油油的，充满生机。
那叶绿素仪是怎么知道叶绿素的含量的呢？其实啊，这里面有个很巧妙的小秘密。
叶绿素仪主要是利用叶绿素对特定波长的光有特殊的吸收和反射特性来工作的。
你可以想象叶绿素就像一个特别挑剔的小食客，它只对某些特定的光线感兴趣。
比如说，叶绿素对红光和蓝光的吸收就比较多，而对绿光的反射比较多，这就是为啥植物大多看起来是绿色的啦。
叶绿素仪呢，就会发射出特定波长的光到植物的叶片上。
这光就像是一个小小的探测器，去探索叶片里叶绿素的小天地。
当光照射到叶片上的时候，一部分光被叶绿素吸收了，就像被叶绿素这个小黑洞给吞进去了一样。
而剩下的光呢，就会被反射回来。
叶绿素仪就像一个特别聪明的小耳朵，它能接收到这些反射回来的光。
然后呢，根据反射光的强度和发射光的强度之间的关系，来计算出叶绿素的含量。
这就好比是你给了叶绿素仪一些小饼干（发射光），叶绿素吃了一部分（吸收光），然后叶绿素仪看看剩下的小饼干（反射光），就能算出叶绿素这个小馋猫到底吃了多少，从而知道叶绿素的含量啦。
你可能会想，这叶绿素仪可真够聪明的。
其实啊，它也有一些小脾气呢。
比如说，叶片的厚度、叶片表面的光滑程度这些因素都会对测定结果有一点点小影响。
就像你穿不同厚度的衣服，看起来会有点不一样。
叶片厚一点，可能光在里面走的路程就长一点，吸收和反射的情况就会和薄叶片有点差别。
但是呢，叶绿素仪也很努力地在克服这些小问题。
科学家们在设计叶绿素仪的时候，也会考虑到这些因素，尽量让测定结果更准确。
再说说叶绿素仪的测定原理在实际中的用处吧。
叶绿素荧光及分析技术
暗适应中荧光的增加由暗适应和光适应下叶片光化学淬灭由最大到最小引起的
（Fm-Fo和Fm’-Fo’）。 光适应中荧光量的降低由不产生光化学淬灭和达到最大光化学淬灭（Fm-Fm’和FoFo’）的光淬灭引起的。 在饱和脉冲光发射之前，在Fm’和Fo’之间的区域内，诱导曲线上荧光的水平为F’， 它表示PSⅡ反应中心的关闭程度。
JUNIOR PAM测量参数
continued
相对电子传递速率（Relative Electron Transport Rate, ETR ）
根据ETR=PAR•ETR-Factor•PPS2/PPPS•Y(Ⅱ)计算。
光合激发辐射 （Photosynthetic active radiation，PAR ）
JUNIOR PAM测量参数 相对荧光产量（Relative Fluorescence Yields）
暗适应下测定的参数
Fm：关闭所有PSⅡ反应中心的高光强脉冲激发的最大荧光值。
Fm= Fo + Fv。 Fo ：固定荧光或初始荧光产量，也称基础荧光。代表不参与
PS Ⅱ光化学反应的光能辐射部分，是PS Ⅱ反应中心处于完
•PAM技术与荧光淬灭的饱和脉冲分析结合是
目前测定植物光合作用的标准技术
叶绿素荧光仪工作原理
调制技术：用于激发荧光的测量光具有一定的调制
（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光， 因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包 括背景光很强时。
调制叶绿素荧光成像系统——M系列IMAGING-PAM
调制叶绿素荧光成像系统——M系列IMAGING-PAM2010.09.02安装保修至2011.09.02德方工程师：Oliver Meyerhoff E-mail: omeyerhoff@中方工程师：韩志国137******** E-mail: walz@1、操作步骤：⑴先开PAM主机，再启动程序连接；⑵如正常显微镜般通过目镜选择合适的视野，此时底灯开、CCD拉杆推入、荧光通道拉杆放在1或3位置；⑶将CCD拉杆拉出、荧光通道拉杆放在2位置，选择程序中的live video，即可看到黑白像，此图像不可保存，如想存，则点NIR（近红外）测量后再保存，所用的光为近红外线，但是与可见光效果相似；⑷目镜和通过CCD成的像的焦平面⑵略有不同，需要再次微调聚焦；⑸关闭底灯（看荧光时必须关闭可见光），选择荧光测量模式，即可开始测量，一般选择F或Ft；㈠image（第一个窗口）：⑴如果荧光太弱：①首先检查是否用对了颜色的光，一般来说，测量光的选择随藻的种类不同②然后调低Damping值至3（Damping值小，图像质量低，但成像速度快，所以调节阶段用较低的Damping值），再调高Gain值（Gain值升高，背景中的杂信号增多）；③如荧光仍看不到，则调高ML光强（但是ML光强越低越好）;⑵可通过右侧的add在画面中添加圆形、方形或多边形的区域，可显示该区域内的平均值；⑶点饱和光测量，然后保存数据，此数据中保存了所有的值，在分析时均可调出；⑷如果需要导出原始数据，可在report中直接将数据输出成excel格式。
㈡动力学曲线（第二个窗口）：⑴在image窗口中选定感兴趣区域（AOI）；⑵点start即可开始跑曲线，将显示所有选中区域的动力学曲线；⑶ΔFm’=0.5ΔFm则作出的图比较好，如果ΔFm’＞0.5ΔFm，则AL偏弱；如果ΔFm’＜0.5ΔFm，则AL偏强。
㈢快速光响应曲线（L-curve，第三个窗口）：⑴类似于phyto-PAM；⑵若成的图中峰靠前，则可将最大的光强调小，即在较低的光强范围内多设几个梯度；如果峰靠后，则将最大光强调大。
植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法
植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法【实验目的】⏹了解目前在光合作用研究中先进的叶绿素荧光技术，了解便携式叶绿素荧光仪测定植物光合作用叶绿素荧光参数的基本原理和仪器的使用方法。
⏹老师演示和学生分组利用便携式叶绿素荧光仪(PAM2100)测定实验植物的叶绿素荧光基本参数(Fo, Fm, Fv/Fm, Fm’, Fo’, Yield, ETR, PAR, qP, qN等)。
⏹了解荧光仪的广泛应用【实验原理】仪器介绍和工作原理叶绿素荧光（Chlorophyll Fluorescence）的产生⏹传统的光合作用测定是通过测量植物光合作用时CO2的消耗或干物质积累计算出来。
叶绿素荧光分析技术通过测量叶绿素荧光量准确获得光合作用量及相关的植物生长潜能数据。
⏹叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。
⏹本实验以调制式叶绿素荧光仪PAM-2100（W ALZ）为例，测定植物叶绿素荧光主要参数。
植物叶片的生长状况不同，所处位置的不同，光照不同，叶绿素荧光参数数值也会有所不同，所以不同叶片之间叶绿素荧光产量存在着一定的差异。
【实验内容与步骤】一、仪器使用步骤讲解1. 仪器安装连接将光纤和主控单元和叶夹2030-8相连接。
光纤的一端必须通过位于前面板的三孔光纤连接器连接到主控单元，光纤的另一端固定到叶夹2030-B上。
同时，叶夹2030-B还应通过LEAF CLIP插孔连接到主控单元。
2. 开机按“POWER ON”键打开内置电脑后，绿色指示灯开始闪烁，说明仪器工作正常。
随后在主控单元的显示器中会出现PAM-2100的表示。
从仪器启动到进入主控单元界面大概要40秒。
3. PAM-2100的键盘PAM-2100主控单元上有20个按键，现分别简要介绍主要按键的功能。
Esc：退出菜单或报告文件Edit：打开报告文件Pulse：打开/停止固定时间间隔的饱和脉冲Fm：叶片暗适应后打开饱和脉冲测量Fo、Fm和Fv/FmMenu：打开动力学窗口的主菜单Shift：该键只有和其它键结合时才能起作用＋：增加选定区的数值（参数）设置－：减少选定区的数值（参数）设置Store：存储记录的动力学曲线Com：打开命令菜单＜：指针左移＞：指针右移∧：指针上移∨：指针下移Act：打开光化光Yield：打开一个饱和脉冲以测定照光状态的光系统II有效量子产量△F/Fm′。
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Sucrose Cellulose ...
CO2
/zealquest
光合作用的测量方法
叶绿素荧光： PAM系列 系列 P700： DUAL-PAM-100 气体交换： GFS-3000，CI-340，PTM-48A ， ， 光合放氧：Firesting O2
Fv
∆F
对于对照组而言，如果达到稳态后的 在 的 ～ 之间 之间，则 对于对照组而言，如果达到稳态后的∆F在Fv的1/3～2/3之间，则 达到稳态后的 光化光强度比较适合。 Fm’过高，提高光化光强度； 过高，提高光化光强度；Fm’过低，降低光化光强度。 过高，提高光化光强度； 过低，降低光化光强度。
NPQ
Fv
Fm’ ∆F F qP
Fo
SP ML SP AL AL
Fo’
ML
光化学淬灭可以被一种短饱和脉冲光（0.2－ s）暂时完全抑制， 光化学淬灭可以被一种短饱和脉冲光（0.2－1 s）暂时完全抑制， 可以被一种短饱和脉冲光（0.2 剩余的荧光淬灭就是非光化学淬灭 剩余的荧光淬灭就是非光化学淬灭 /zealquest
常用叶绿素荧光参数
Y(NPQ)=1-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))：调节性能量耗散的量子产量 ： PS II处调节性能量耗散的量子产量。若Y(NPQ)较高，一方面表明植物 处调节性能量耗散的量子产量。 较高， 处调节性能量耗散的量子产量 较高 接受的光强过剩，另一方面则说明植物仍可以通过调节（ 接受的光强过剩，另一方面则说明植物仍可以通过调节（如将过剩光 能耗散为热）来保护自身。 （ 的重要指标。 能耗散为热）来保护自身。Y（NPQ）是光保护的重要指标。 ） 光保护的重要指标 Y(NO)=1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))：非调节性能量耗散的量子产量 ： PS II处非调节性能量耗散的量子产量。若 处非调节性能量耗散的量子产量。若Y(NO)较高，则表明光化学 处非调节性能量耗散的量子产量。若 较高，则表明光化学 能量转换和保护性的调节机制（如热耗散）不足以将植物吸收的光能 完全消耗掉。也就是说，入射光强超过了植物能接受的程度。这时， 植物可能已经受到损伤，或者（尽管还未受到损伤）继续照光的话植 物将要受到损伤。Y（ ）是光损伤的重要指标。 ）是光损伤 物将要受到损伤。 （NO）是光损伤的重要指标。
H2O O2 /zealquest
Thylakoid
/zealquest
P700
Chl-a fluorescence
O2
eH+
NADPH NADP+ ATP PCR Cycle
ADP
Pi Triose P
野外打开远红光测量Fo’不方便，因此便携式 野外打开远红光测量 不方便，因此便携式PAM荧光仪多不配远 不方便，因此便携式 荧光仪多不配远 红光，计算qP和 时用 代替Fo’即可。 时用Fo代替 红光，计算 和qN时用 代替 即可。
/zealquest
暗适应：Fv/Fm —— 最大光合效率 暗适应： 光适应：∆F/Fm’ —— 实际光合效率 光适应：
/zealquest
PAM测量的荧光曲线 测量的荧光曲线——饱和脉冲法 测量的荧光曲线 饱和脉冲法
Fm
Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm Y=∆F/Fm’=(Fm’-F)/Fm’ qP=(Fm’-F)/(Fm’-Fo’) qN=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo) NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’
丰富多彩的PAM荧光仪 丰富多彩的PAM荧光仪 PAM
/zealquest
PAM-2000/PAM-2100 ——全世界最畅销的叶绿素荧光仪 全世界最畅销的叶绿素荧光仪
► Fo, Fm, Fv/Fm, Fm’, Fo’, ∆F/Fm’, Fv’/Fm’, rETR, PAR, T等 等 ► 记录荧光诱导曲线的快相和慢相 ►淬灭分析，光响应曲线 淬灭分析，光响应曲线 ► 可独立操作（ 可独立操作（DA-2100），可连电脑操作 ），可连电脑操作 ► 仪器内设 个固定程序（“RUN”），可编辑 仪器内设10个固定程序（ 个固定程序（“ ），可编辑 ► 特别适合野外操作
常用叶绿素荧光参数
光化学淬灭 qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’) （基于“沼泽模型”） 基于“沼泽模型” qL=(Fm’-F)/(Fm’-Fo’)·Fo’/F=qP·Fo’/F （基于“湖泊模型”） 基于“湖泊模型” 即由光合作用引起的荧光淬灭， 即由光合作用引起的荧光淬灭，反映了光合活性的高低 非光化学淬灭 qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo) NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1 ，不需测定 ，不需测定Fo’，适合野 ， 外调查 qN或NPQ反映了植物耗散过剩光能为热的能力，反映了植 或 反映了植物耗散过剩光能为热的能力，反映了植 物的光保护能力
PS I
ATPase
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CO2固定过程 固定过程—Calvin循环 循环
CO2
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叶绿素荧光的产生
较高激发态
热
蓝 光
红 光
光 合 作 用
最低激发态
热 荧 光
基态
ΦPS II=Yield=(Fm’-Fs)/Fm’=∆F/Fm’=qP·Fv’/Fm’ : 任一光照状态下PS II的实际量子产量（实际光合能 任一光照状态下 的实际量子产量（实际光合能 力、实际光合效率） 不需暗适应，不需测定Fo’，适合野外调查 不需暗适应，不需测定 ，
/zealquest
/zealquest
常用叶绿素荧光参数
Fv/Fm =(Fm-Fo)/Fm : PS II的最大量子产量，反映了 的最大量子产量， 的最大量子产量 植物的潜在最大光合能力（光合效率） 植物的潜在最大光合能力（光合效率） 高等植物： 高等植物：0.8-0.84；绿藻：0.7-0.75； ；绿藻： ； 硅藻/甲藻：0.65-0.7；蓝藻/红藻：无固定值 硅藻 甲藻： ；蓝藻 红藻： 甲藻 红藻 当植物受到胁迫（Stress）时，Fv/Fm显著下降 显著下降! 当植物受到胁迫（ ） 显著下降
/zealqn曲线 曲线
Post-illumination是光化光关闭后的荧光瞬时上升现象， 是光化光关闭后的荧光瞬时上升现象， 它能够很好地通过PSII荧光反应围绕 荧光反应围绕PSI的循环电子传递， 它能够很好地通过 荧光反应围绕 的循环电子传递， 是得到国际公认的一项衡量循环电子传递速率的技术。 /zealquest
rETRmax
α
Ik
/zealquest
常用拟合方程
α P=Pm•(1-e-α•PAR/Pm)•e-β•PAR/Pm • • β Platt et al, J. Mar. Res., 1980, 38: 687-701
P=Pm•tanh(α•PAR/Pm) • α
/zealquest
(F) (D)
(P)
P+ D + F= 1
F = 1- P - D
任一状态下的荧光产量是将最大荧光（Fm）淬灭的结果 任一状态下的荧光产量是将最大荧光（Fm）淬灭的结果 荧光产量是将最大荧光（Fm
光化学和非光化学荧光淬灭 光化学和非光化学荧光淬灭 荧光
/zealquest
叶绿素荧光：植物吸收的一小部分光重新以光的形式发射出来
/zealquest
活体叶绿素荧光是光合作用的有效探针
叶片/微藻 叶绿体 叶片 微藻/叶绿体 微藻
5000 µE/m²s
乙醇提取物
100 µE/m²s 0.1 µE/m²s
光强与叶绿素荧光的关系
Fm
叶绿素荧光 测量光
饱和光
Fo
1 光强 µmol m-2 s -1 2000
/zealquest
E=P + D + F = 1 （能量守恒定律） 能量守恒定律） 打开饱和脉冲时： 打开饱和脉冲时：P=0, F=Fm, D=Dm, Dm=1－Fm － 假设在打开饱和脉冲的短暂时间内， 的比值保持不变， 假设在打开饱和脉冲的短暂时间内，D/F的比值保持不变， 的比值保持不变 则 D/F=Dm/Fm D=F • Dm/Fm=F • (1－Fm)/Fm － 因此， 的量子产量P可根据下式计算 因此，PS II的量子产量 可根据下式计算： 的量子产量 可根据下式计算： P=1－F－D － － =1－F－F • (1－Fm)/Fm － － － =(Fm－F)/Fm － =∆F/Fm
拟合参数的意义
P：光合速率，即相对电子传递速率rETR ：光合速率，即相对电子传递速率 Pm: 最大光合速率，即最大相对电子传递速率 最大光合速率，即最大相对电子传递速率rETRmax α：初始斜率，反映了光能的利用效率 初始斜率， β：光抑制参数 Ik=Pm/α ：半饱和光强，反映了样品对强光的耐受能力 α 半饱和光强，
Jassby & Platt, Limnol. Oceanogr., 1976, 21: 540-547
P=Pm•α•PAR/sqrt(Pm2+(α•PAR)2) α α
Smith, PNAS, 1936, 22: 504-511
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Y(II)+Y(NPQ)+Y(NO)=1
Kramer et al, Photosynth Res, 2004, 79:209-218.
/zealquest
常用叶绿素荧光参数
rETR =PAR·∆F/Fm’·0.84·0.5 : 相对电子传递速率 rETR随PAR的变化图即为光响应曲线，即使光化光 随 的变化图即为光响应曲线，即使光化光 的持续时间短至10 ，也可得出典型的光响应曲线， 的持续时间短至 s，也可得出典型的光响应曲线， 这被称为快速光曲线 快速光曲线（ 这被称为快速光曲线（Rapid Light Curves） ）