图形图像处理

基于悬浮细胞的计数
摘要：悬浮细胞计数一直是细胞培养技术的重要工具。

从悬浮细胞图像的灰度特点出发,探索并实了适合悬浮细胞图像的计数方法:通过预处理,Canny边缘检测及形态学处理这三个步骤来完成分割,对分割结果采用种子点法进行区域计数,再针对所有含有种子点的区域,计算其内部灰度均值,用于区分区域是活细胞还是死细胞。

经实验证明,该计数方法误差小,速度快,很大程度上减少了细胞计数的工作量。

悬浮细胞的培养过程需要对活细胞计数，针对人工计数方法存在的缺陷,利用图像分析技术对拍摄的细胞图片进行处理,实现活细胞自动识别及计数。

要实现细胞识别,首先要对图像进行正确分割。

对于前景和背景对比度较小且细胞很稀疏的图像,采用背景拟合设定阈值进行分割;针对前景和背景对比度较大的图像,采用一种基于局部区域直方图的方法进行分割。

对分割后的图像进行链码跟踪并测量细胞参数,最终实现细胞识别及计数。

实验结果表明上述方法能快速有效地计算出活细胞个数。

关键词：悬浮细胞链码跟踪Canny边缘检测
目录
摘要 (1)
1、引言 (3)
2、数字图像处理 (4)
2.1数字图像处理概述 (4)
2.2数字图像处理的基本过程 (5)
2.3数字图像特征提取 (6)
3、悬浮细胞的分析系统设计 (7)
3.1 悬浮细胞的特点 (7)
3.2 细胞图像预处理 (7)
3.3细胞图像的去噪 (8)
3.4细胞的轮廓跟踪 (9)
3.5细胞参数的计算及细胞搜索 (9)
4、悬浮细胞的计数 (11)
4.1计算内部灰度均值 (11)
4.2计数实验及分析 (12)
5、小结 (13)
6、参考文献 (14)
一、引言
细胞培养技术是当今生命科学各研究领域的基础技术和基本技能,它广泛应用于细胞工程、基因工程和生物医学工程和干细胞研究等方面。

其中优生和抗衰老的研究,肿瘤、感染、创伤和器官移植等问题的研究,都与细胞培养技术相关。

细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞,用培养基制成细胞悬液,在体外适宜条件下,使细胞生长繁殖,并保留其一定的结构和功能特性的一种技术。

在细胞培养技术的研究中,为了观察悬液中细胞的繁殖情况,往往需要对所培养的悬浮细胞进行计数,并记录其中活细胞数及死细胞数,由此来计算出细胞成活率。

细胞成活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)*100% 。

在传统的医学实验室中,通常采用细胞计数板来计数,即在显微镜下用目测法来进行计数。

这种方法的缺陷在于不仅对计数处理速度慢而且常使得检验人员在长期工作中眼睛极易疲劳,进而造成计数错误。

为了克服目测法的缺陷,一部分学者开始利用计算机图像识别技术来实现细胞自动识别与计数,如血细胞计数,切片细胞计数,牛奶体细胞计数等,但这些细胞计数方法却难以对悬浮细胞进行精确计数。

因此,探索一种适合悬浮细胞的计数方法将是文章的主要任务。

二、数字图像处理
2.1数字图像处理概述
一幅图像可定义为一个二维函数厂(x，y)，其中二和y是空间坐标，而在任何一对空间坐标(x，y)上的幅值f称为该点图像的强度或灰度。

当x，y和幅值f为有限的、离散的数值时，称该图像为数字图像。

数字图像是由有限的元素组成的，每个元素都有一个特定的位置和幅值，这些元素成为图像元素、画面元素或像素。

数字图像处理是指借助数字计算机处理数字图像，以期得到某种预期的效果或从图像中提取有用的信息。

图像处理涉及的范畴或其他相关领域(例如，图像分析和计算机视觉)的界定并没有一致的看法。

从图像处理到计算机视觉这个连续的统一体内并没有明确的界限。

比较普遍的做法是把计算机处理抽象为低级、中级、高级三个层次：
低级处理涉及对图像进行加工以改善图像的视觉效果，或对图像数据进行压缩以利于图像的存储和传输。

典型的处理方法如:降低噪声的图像预处理，对比度增强和图像尖锐化等。

低级处理是以输入、输出都是图像为特点的处理。

中级处理主要指用某种特殊的手段提取、描述和分析图像中所包含的某些特征或特殊的信息，主要的目的是便于计算机对图像做进一步的分析和理解。

它涉及图像分割(把图像分为感兴趣的不同区域或目标物)以及对目标物的描述，以使其更适合计算机处理及对不同目
标的分类(识别)。

中级图像处理是以输入为图像，但输出是从这些图像中提取的特征数据(如边缘、轮廓及不同物体的标识等)为特点的。

高级处理涉及在图像分析中被识别物体的总体理解。

通过对图像内容的理解和对场景的解释，进而指导和规划行动。

2.2数字图像处理的基本过程
图像处理的一般过程下图所示。

图像处理过程从获取图像开始，可以根据实际需要有选择地进行低级、中级、高级图像处理。

可能得到满意的输出图像，也可能得到图像的特征数据信息。

图1 数字图像处理的基本过程
2.3数字图像特征提取
数字图像分析是图像处理的高级阶段，它所研究的是使用机器分析和识别周围物体的视觉图像，从而可得出结论性的判断lz1。

但是，人类视觉系统认识的图像如何才能让计算机系统也能认识呢?人们必须寻找出合适的算法，分析图像的特征，然后将其特征用数学形式表示出来并教会计算机也能懂得这些特征。

这样，计算机具有了认识或者叫识别图像的本领，这称之为图像模式识别，也叫图像识别。

要使计算机具有图像识别的本领，首先要得到图像的各种特征。

获得图像的特征，成为图像特征提取。

三、悬浮细胞的分析系统设计
3.1悬浮细胞的特点
在灰度方面由于细胞载玻板的厚度不均匀,会使得显微镜光学系统中的光线不均匀,进而造成显微图像中背景照度不均匀,一般情况下,整幅图像会出现中间亮,周围偏暗的情况。

活细胞为一个暗环,暗环上灰度低于暗环内的灰度及暗环外的背景灰度,而死细胞为一个暗圆,暗圆上灰度低于暗圆外的背景灰度,并且活细胞暗环内的灰度高于死细胞暗圆上的灰度。

其中白色圆圈圈住的细胞为活细胞,黑色圆圈圈住的细胞为死细胞。

由于死细胞为一个暗圆,暗圆上灰度低于暗圆外的背景灰度,所以死细胞的灰度与背景的灰度差异较大,较容易被准确识别出来。

而想要准确识别出活细胞的难度则较大,因为悬浮细胞整幅图像中间亮,周围偏暗,导致活细胞中暗环内的灰度并不绝对高于暗环外背景的灰度,两者的灰度差异并不明显。

因此,寻找一种适合的悬浮细胞识别方法(识别出活细胞和死细胞)将有利于细胞计数的进行。

3.2细胞图像预处理
由于光照、拍摄环境等各种因素的影响，我们所拍摄到细胞图像，不可避免地，在不同程度上受到噪声污染。

图像预处理的目的就是细胞改善图像质量，抑制噪声污染或增强某些对后续处理重要的图像特征。

通常的预处理方法分为:图像增强、图像滤波、图像复原等。

本文对细胞图像的预处理仅包括细胞图像的灰度化和图像去噪。

3.3细胞图像的去噪
为了使后继的处理取得更有效的结果，我们需要将噪声去除。

去除噪声的方法有多种，如邻域平均、中值滤波等。

中值滤波可以克服线性滤波器如均值滤波等带来的图像模糊细竹和边缘模糊现象，而几对抑制图像中的脉冲噪声有很好的效果。

鉴于以上特点，我们采用中值滤波器进行去噪。

原始灰度图像如下图，通过中值滤波后的图像效果如下所示。

比较两图像可知:由r 噪声的缘故，原始图像细胞背景模糊;虽然效果不是很明显，但去除噪声后的图像质量在一定程度上还是有所改善的。

图2去除噪声前的原始图像
图3 去除噪声厚的图像
3.4细胞的轮廓跟踪
本文采用链码法来实现细胞轮廓的跟踪，通常的细胞跟踪如下：利用链码跟踪区域边界:首先以边界点为中心，从检测始点开始按照顺时针方向检测各个邻点，并标记每个检测过的邻点，避兔币复检测，直至遇到区域的边界点为止。

这时，设置跟踪结束标态为FALSE，幸;若在临点忠没有找到边界点或下一边界点为跟踪起始点，设置跟踪结束标志为TRUE，程序结束时输出下一边界点的坐标，同时返回跟踪结束标志。

（２）从上到下，从左到右，逐行扫描，遍历搜索整幅图像，每当通过步骤（１）返回TRUE时，记录返回的边界链码，目标个数加１。

3.５细胞参数的计算及细胞搜索
通过区域轮廓跟踪就可以得到相应区域的链码表和线段表，有了链码表一与线段表就可以计算区域的各种特征参数。

通过链码表可以
计算区域的周长。

由线段表可以求出区域的面积:线段表中每条线段的左、右端点X 坐标相减再加1，即得这一条线段的长度，将所有线段长度相加即得整个区域的面积。

由链码及线段表还可以计算区域的形状因子即圆形度及区域的中心。

细胞的各种参数计算出来后就可以根据这些参数来确定细胞。

由细胞培养的知识可知悬浮细胞大都呈圆形，标准圆的形状因子为1，细胞的形状因子与1的差异越大，其形状与圆的差别就越大，因此可以利用细胞的形状因子去除一些长条形物质。

每个细胞都有一定的面积大小，本文结合细胞面积、形状因子来搜索细胞。

本文在细胞搜索过程中是结合细胞面积与细胞的圆形度来确定细胞的。

但细胞在生长时会逐渐变大，细胞的一些相应参数也会发生变化，如细胞的面积、周长会变大。

因此在搜索细胞时，对于不同时期拍摄的细胞图片，不能使用同一参数值来搜索，应根据具体情况调整参数值再进行搜索。

系统在再次搜索时可以根据实际需要调整细胞面积、细胞周长及圆形度等。

四、悬浮细胞的计数
细胞计数的常用方法有两种:一是链码跟踪法;二是种子点法。

对悬浮细胞图像进行计数,种子点法有两大优点是链码跟踪法无法比拟的:第一,种子点法的计数速度比链码跟踪法更快;第二,在细胞粘连的情况下,种子点法比链码跟踪法更容易获取各个粘连细胞的重心。

4.1计算内部灰度均值
种子点法有效统计出总的区域数,但是在区分区域为活细胞还是死细胞的准确性上仍不甚理想。

为了更为准确地区分活细胞与死细胞,须计算区域的内部灰度均值。

因为活细胞的暗环内灰度高于死细胞的暗圆上灰度,所以内部灰度均值高于某一阈值的为活细胞,低于这一阈值的为死细胞。

根据种子点的位置特点及悬浮细胞的统计特点,计算区域的内部灰度均值具体方法为：
（1）根据种子点的位置特点确定细胞重心。

因为距离值最大的那些点位于区域的中心,并且每个区域的距离最大点数量极少,而种子点是距离最大点中的一个,所以种子点的位置可以近似看作细胞的重心。

（2）根据悬浮细胞的统计特点确定细胞半径。

所处理的细大小比较均匀,99%以上的细胞半径不超过12个像素。

（3）计算得到细胞内部灰度均值，从(1)、(2)两个特点可以看出,每个区域可以被以种子点为中心,以12个像素为半径的圆形完全覆盖。

针对每个区域,计算以该区域的种子点为中心,以12个像素为半径
的圆形范围内的灰度均值。

计算所得到的灰度均值即为细胞内部灰度均值。

根据上面计算得到的灰度均值区分活细胞与死细胞,高于某一阈值的为活细胞,低于这一阈值的为死细胞,其中白色圆圈圈住的代表活细胞,黑色圆圈圈住的代表死细胞。

活细胞和死细胞都被搜索到了,并且正确地区分出了活细胞与死细胞。

4.2计数实验及分析
以100张分辨率为1280*1024的悬浮细胞图像作为计数样本,在WindowsXP系统下,CPU为1.70G,内存为256M,采用VC++进行编程,最长计数时间为17.36s,最短计数时间为15.47s,平均的计数时间为16.42s,远远小于人工计数时间,并且区分细胞与杂质的误差较小,最大相对误差为4.4%,最小相对误差为1.3%,平均误差为2.9%,区分活细胞与死细胞的误差就更小了,平均误差接近于0。

实践证明,本文采用的细胞计数方法不仅计数时间短而且相对误差小,取得了令人满意的结果。

五、结论
根据悬浮细胞图像在灰度方面的特点,探索适合悬浮细胞图像的计数方法,实现了悬浮细胞的自动识别与计数。

识别与计数过程,先采用中值滤波去除随机噪声,再用Canny边缘检测获取细胞的轮廓,通过膨胀、填充孔洞及腐蚀处理,闭合细胞边缘,至此,得到了比较理想的分割结果,接着用种子点法进行计数。

经实验得出,计数的平均时间短且平均误差小,克服了人工计数花费时间长、眼睛容易疲劳等缺点,取得了理想的结果。

但实验仍未完全消除误差,其主要原因在于细胞与杂质区分方面仍旧存在误差。

因为有些悬浮细胞位于图像的边缘区域,细胞只有一部分出现在图像中,出现的面积较小,容易错分为杂质;还有一些杂质经过分割处理后,其种子点距离值处于细胞的判定范围内,较容易错分为细胞。

此外,在消除分裂区域中的较小者时,有些粘连面积较大的细胞的种子点会被消除,导致漏数了部分粘连细胞。

因此,进一步剔除与细胞面积相近的杂质,降低边缘区域细胞及粘连面积较大的细胞的计数误差,将是后来研究的一种有益探索。

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六参考文献
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