成骨细胞培养

成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，

OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate

PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，

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成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过

程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。

成骨细胞鉴定：

活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。

Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。

碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，

按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。

阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。

? 茜素红染液

操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用

1×PBS冲洗 1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。

2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。

3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。

4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

用4周龄大鼠，用全骨髓贴壁法取得原代细胞，消化传代，用第3代培养至80-90%融合后，胰酶消化，接种在事先明胶包被的六孔板中，当细胞生长达接近80-90%时，使用cyagen的成骨诱导培养液诱导，每2-3天换液，诱导28天后，吸去六孔板中培养基，用PBS冲洗，加入4%中性甲醛固定30min，再次用PBS冲洗，加入茜素红染4min，PBS冲洗后观察。

骨科手术中获得成

人松质骨，经PBS 或者D-Hanks 液冲洗数次后剪成1 ～3 mm3 左

℃人骨髓梯度离心法提取成骨细胞和破骨细胞