细胞转染技术ppt课件
细胞转染技术 PPT
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 பைடு நூலகம்G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。目前G418 的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛 选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的 厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在 筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如 下：
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出 蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转 染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长 了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛 选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下 降，所以每2~3天都要更换一次含有G418的筛选液。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
细胞转染技术原理及应用
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome ）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH ；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH ），胸苷激酶（TK ）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表： 转染方法 原理 应用特点磷酸钙法 磷酸钙DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用DEAE-右旋糖苷法 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染 相对简便、结果可重复 但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清 电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广但细胞致死率高，DNA 和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等逆转录病毒 特定宿主细胞 但携带基因不能太大细胞需处分裂期 需考虑安全因素腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染 特定宿主细胞可用于难转染的细胞 需考虑安全因素 阳离子脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清。
细胞转染
1、转染前一天，3.0×105-8.0×105 个/ml细胞接种于 35mm底部含有盖玻片的培养皿培养，加入1mlRPMI 1640 含血清，使其在24小时内使细胞汇合达到40-70%(汇合过 分，转染后不利筛选细胞)； 2、转染液制备：在1.5mlEP管中制备以下两液:A液：用无 血清培养基稀释4μg DNA，终量250μL；B液：用250μL无 血清培养基稀释10μl脂质体试剂，轻轻混匀，室温放置5 分钟（注意：无血清中不含双抗，因为抗生素会在穿透的 细胞中积累毒素）； 3、混合A、B液，轻轻混匀，室温放置30分钟，以便形成 DNA / 脂质体复合物；
【实验用品】
1、仪器和用品：37℃、5%CO2的加湿培养箱、35mm的 细胞培养皿、 载玻片、盖玻片、弯头镊子。 2、材料：呈指数生长的真核细胞HO-8910PM(贴壁细胞)。 3、试剂 1）RPMI 1640含血清培养基 2）质粒载体DNA带GFP(绿色荧光蛋白)基因。 3）转染试剂：阳离子试剂脂质体2000。 4）RPMI 1640无血清培养基不含青霉素、链霉素。
4．转染准备：用2mL无血清培养液漂洗两次细胞，再加 入1mL无血清培养液（注意：转染时切勿加血清，血清对 转染效率有很大影响）； 5．将500μl DNA / 脂质体 复合物加到含有细胞和培养基的 培养皿中，来回轻柔摇晃细胞培养板，37℃温箱温育6～ 24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养； 6．转染24h后，取出盖玻片盖在载玻片上，使用荧光显微 镜观察计数表达绿色荧光蛋白的细胞，在明场中观察计数 同一视野中的总细胞数，计算转染效率。 转染细胞率=荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%
实验八
脂质体介导转染实验
转染的原理
转染的原理转染是生物学实验中常用的一种技术，它是指将外源DNA或RNA引入到细胞内的过程。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
本文将从转染的原理入手，介绍转染技术的基本概念、原理和常见方法。
转染的基本概念。
转染是指将外源核酸（DNA或RNA）引入到细胞内，并使其稳定地表达或转录的过程。
通过转染技术，可以实现对细胞内基因的敲除、过表达或靶向修饰，从而研究基因功能、调控细胞信号通路、开发新药物等。
转染的原理。
转染的原理主要包括细胞膜通透性增加、核酸与细胞膜的相互作用、内吞作用和核酸的释放等过程。
在转染过程中，外源核酸首先需要穿过细胞膜，进入到细胞内部。
然后，外源核酸需要与细胞内的生物分子发生相互作用，从而实现其稳定的表达或转录。
最后，外源核酸需要在细胞内定位到特定的细胞器或亚细胞结构，发挥其功能。
常见的转染方法。
目前，常见的转染方法包括化学法、生物物理法和病毒载体法等。
化学法是指利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）改变细胞膜的通透性，使外源核酸能够进入到细胞内。
生物物理法是指利用物理手段（如电穿孔、微注射等）将外源核酸导入到细胞内。
病毒载体法是指利用病毒载体将外源核酸传递到细胞内，并实现其表达或转录。
转染技术的应用。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因工程领域，转染技术被用于敲除或过表达特定基因，从而研究基因功能和调控信号通路。
在细胞生物学领域，转染技术被用于标记细胞器、跟踪蛋白质定位和研究细胞信号转导等。
在药物研发领域，转染技术被用于筛选潜在的药物靶点、评估药物毒性和研究药物的作用机制等。
结语。
总之，转染技术是一种重要的生物学实验技术，它在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
通过对转染的原理和常见方法的了解，可以更好地应用转染技术进行科研工作，推动生命科学领域的发展和进步。
《细胞转染技术》PPT课件
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6
磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染 和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然 后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉 淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用 摄人DNA。
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Байду номын сангаас
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脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的 脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中间，这种脂质双 层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细 胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。
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此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒 进入细胞的一般过程。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于 各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率， 但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应 用受限制。
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
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实验室用到的转染方法
脂质体介导法
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细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞 为例：
转染前一天，将细胞铺到培养皿中， 加入有血清无双抗的培养基（15ml）； 24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml； 将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
细胞转染Cell Transfection
细胞培养
• HeLa， HepG-2， NIH /3T3 细胞培养于含 10% 新生小牛血清的 DMEM 高糖培养液， 37 C ， 5% CO2， 90% 相对湿度培养箱中 . 在解冻小鼠 ES 细胞前， 先培养饲养层细胞 C57BL， 待长满后， 用 含 10 ug /mL 的mitomycin C处理 2 ~ 2. 51h， 用 37 C 预热的 PBS 漂洗两次， 加普通培养液过夜培养 . 第二天， 解冻小鼠 ES 细胞， 在含 10% 胎牛血清7 . 175 X 109 pmoI /L LIF饲养层上培养 .
•
转染试剂
细胞状态 转染方法
载体构建
•
细胞培养物 细胞密度 血清
抗生素
氮磷比 DNA质量
1． 转染试剂
• 不同细胞系转染效率通常不同， 但细胞系的选择通常是根据实验 的需要， 因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合 的转染试剂。 每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株 列表和文献， 通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。 当然， 最适合的是高效、 低毒、 方便、 廉价的转染试剂。
• 小鼠 ES 细胞， 用 冰预冷的 PBS 将处于对数生长期的细胞重悬为 1 X 107 个 /mL， 取 0. 8 mL 细胞悬液与 25 ug 线性化的 Target Vector 混合， 加到 4 mm 电击池， 冰上放置 5 min (对照组室温放置） • 用 电压 240 V,电阻 ,电容 500 uF 和 950 uF 分别进行电穿孔转染， 电击 后冰上放置 5 mi n (对照组室温放置） • 将细胞转移到装有预热培养液的 15 mL 离心管中 ， 轻轻吸打均匀后， 将 细胞悬液平均分到 6 个装有预热培养液（ 含 7 . 175 X109 pmoI /L LIF）铺 好饲养层的 10 cm 培养皿中 ， 摇匀， 常规条件培养 • 24 h后换新鲜培养液， 电击后 48 h,加250ug /mL G418 及 2 umoI /L gancycIovir 进行选择， 每天更换选择培养液
细胞生物学技术课件GFP细胞转染实验讲义
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳 定表达
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载体名称：pEYFP-C1 载体类型：哺乳动物细胞表达载体
载体大小：4.7kb 载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells） 细菌抗性：卡纳（kan） 真核筛选标记：新霉素（Neomycin） 5' 测序引物：EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1) 3' 测序引物：EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1) 载体描述：encodes an enhanced yellow-green variant of the Aequorea victorioiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected.
Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or "holes" in the cell membrane, to allow the uptake of material.
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
细胞转染技术
细胞转染细胞转染转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点是，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
常用转染方法一、脂质体转染法阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。
脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。
由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。
二、电穿孔转染法电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔转染法。
当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议使用电穿孔法转染。
一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。
现在针对电穿孔转染会引起大量细胞死亡而开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。
三、病毒感染对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。
细胞转染PPT课件
稳定转染子的选择
• 成功完成稳定转染需要高效DNA输送和筛选获得DNA的细胞的 方法。
• 筛选稳定表达转染DNA的细胞的最可靠方法之一是在用于转 染的DNA重组体或共转染至细胞的独立载体中加入选择标记 物，然后经过短暂的恢复期后，在细胞中应用适当的选择压 力。当共转染载体上表达选择标记物时，携带目的基因的载 体与携带选择标记物的载体的摩尔比应在5:1至10:1范围内， 以确保包含选择标记物的细胞也含有目的基因。
2019/8/2
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。
没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
3、物理方法：将核酸直接导入细胞质或细胞核内。 显微注射、激光介导的转染
阳离子脂质体介导的输送
• 特殊设计的阳离子脂质体(如LipofectamineR转染试剂)可促进 DNA和siRNA进入细胞。基本结构包括带正电荷的头基和一个或 两个碳氢链。
• 采用阳离子脂质体试剂时，带负电荷的DNA与带正电荷的脂质 体自发结合，形成DNA-阳离子脂质体试剂复合物。一般认为， 转染复合物通过内吞作用进入细胞。
• 低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造 成影响。
• 稳定性：一些病毒具有遗传不稳定性，会迅速重排基因 组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产 生不利影响。
• 选择性：病毒载体应包含选择标记物，如特定的抗生素抗 性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。
SUCCESS
THANK YOU
细胞转染PPT课件
蛋白转染
Adherent cell lines
3T3 L1 A549 BHK-21 CaSki CHO CV-1 HEK-293
60-80% 80% 30-40% 80-90% 80-90% 50% 45-55%
HeLa HepaRG MCF-7 MLE-15 NIH-3T3 RAW 264.7 Si Ha
• Release
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技术原理
蛋白转染
PULSin™: cationic amphiphilic-based formulation
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操作步骤
蛋白转染
For 24-well plate:
细胞融合度：70-80%
1 稀释蛋白：1µg of protein/100µl Hepes 2 加 4 µl PULSin™ 3 孵育 15 min
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细胞转染难易比较
体外转染
Adherent > Suspension
Problem: Membrane
E.g.:
THP1, Jurkat…
Fast dividing cell > non dividing cell
Problem: Access to the nucleus
E.g.:
k562gapdh788thp1gapdh818sirna转染转染第32页共73页原代细胞的高效沉默24wellplatebrancheddnaassay20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm96人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞82sirna转染转染第33页共73页interferin优势低浓度sirna甚至pmol级别就能达到高效的基因沉默在反向操作转染中的效率高sirna转染转染第34页共73页sirna转染竞争对手lipofectamine2000invitrogenolgofectamineinvitrogenhiperfectqiagensilentfectbioradlargestsirnatransfectionmarketdangerousoutsiderhiperfectsirna转染转染第35页共73页nterferinvslipofectamine2000interferinlipofectamine2000sirna浓度nmsirna降低成本20100nmsirna40nm血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul1050pmol0515ul价格第36页共73页nterferinvsoligofectamineinterferinoligofectaminesirna浓度nmsirna100nmsirna血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上一般操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul60pmol3ul价格第37页共73页nterferinvshiperfectsilentfectinterferinhiperfectsilentfectsirna浓度nmsirna5nmsirna10nmsirna细胞融合度305050805090基因沉默效率高见表见表见表细胞毒性无细胞毒性细胞毒性较小细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol84ng13ul375ng3ul价格
1. 细胞转染技术
慢病毒载体——介绍
慢病毒（Lentiviruses）属于逆转录病毒科。 慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运 输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中 复制。这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。
HIV（Human immunodeficiency virus） EIAV（Equine infectious anemia virus） FIV（Feline immunodeficiency virus） SIV（Simian immunodeficiency virus） 其中研究最多最为透彻的是HIV。
DOSPA
阳离子脂质体转染
阳离子脂质体转染——原理
1. Formation of Lipoplexes
2. Get into the cell
3. Get into the nuclear
Lipoplexes的形成
Lipoplexes的形成
FIGURE: Electron microscopy of DNA-liposome complexes. (A-E) Complexes prepared from a constant amount of DNA (3.5 μg/mL) and a gradually increasing amount of cationic liposomes. LiposometoLDNA'ratios (in terms of positive to negative charges) are (A) 0.2, (B) 0.4, (C) 0.6, (D) 1.0, and (E) 1.5. Note the aggregated (B-D) versus fused (E) complexes. Scale bar represents 0.5 μm.(1993, Hezi Gershon)
细胞转染技术课件
研究基因功能
基因表达调控
通过转染特定基因，研究其在细胞内的表达调控机制，有助于深入 了解基因的功能和作用。
基因敲除与敲入
利用转染技术将特定基因敲除或敲入细胞中，以探究基因对细胞生 长、分化等过程的影响。
表观遗传学研究
通过转染特定因子或抑制剂，研究表观遗传修饰对基因表达的调控作 用。
与合作。
降低对细胞的毒性
寻找低毒性的转染试剂
研发和选用对细胞毒性更低的转染试剂，减轻对细胞的损伤。
控制转染条件
优化转染条件，如降低转染浓度、减少转染时间等，以减轻对细胞的毒性。
细胞株的选择
选用对转染更具有耐受性的细胞株，降低转染过程中的毒性。
发展新型的转染技术与方法
非病毒载体转染技术
研究和发展非病毒载体转染技术，如纳米材料、基因 编辑技术等，以实现更高效、安全的基因转移。
体内转染技术
探索和发展体内转染技术，提高基因治疗在临床应用 中的效果和安全性。
跨物种转染技术
研究和发展跨物种转染技术，拓宽基因功能研究和基 因治疗的应用范围。
CHAPTER 06
案例分析：某基因的功能研 究
研究背景与目的
某基因在肿瘤发生发展中的重要作用
近年来，研究发现某基因在多种肿瘤中高表达，可能与肿瘤的发生、发展、转移等过程 密切相关。
提高转染效率的方法
预处理细胞
通过药物处理、电穿孔等方式预处理细胞，可以提高细胞膜的通 透性，有利于转染试剂进入细胞。
共转染
同时转染多个基因或质粒，可以提高转染效率和基因表达水平。
筛选稳定转染细胞株
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳定表达目的基因的细胞 株，可以长期保存和应用。
细胞转染简介PPT教案
样，电泳图谱不一样。
B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载
体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是
不同的 。
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C. 插入法(单酶单切点)或替代法 (双酶双位点)酶切，一般来说用 3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片 段的大小,方向,切后并电泳分 析,以确定是否得到预期的olyA尾设计共同引物 → 将所用 mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA 计 算 机 克 隆 － 即 利 用 GenBank 信息，利用不同种属同源性设计 引物，尝试获取未知基因片段， 这有赖于各种计算机软件的应用。
➢ (1)基础培养基
➢ (2)胎牛血清
➢ (3)添加剂
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➢ 5 转染方案
➢ 一般原则：建立一套适当的转
染方案；首先从一种标准方案 开始，然后通过改变试剂/DNA
的配比和复合物的剂量进行优 化。
➢ （1）转染复合物的制备
➢ （2）转染试剂/DNA配比（负
载比）
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Hale Waihona Puke ➢ （3）转染复合物的加入
➢ 6 时间进度
➢ 一般原则提示：要确保最终结 果的成功；建立一个合适的时 间进度进行转染实验以保证您 所需要的目的蛋白能得到最佳 表达。
➢ （1）转染的开始 ➢ （2）培养基更第3换8页/共40页
➢ （3）时间测定
谢谢指导！
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➢ 【主要应用】:瞬时转染 稳定 转染
➢ 【特点】：使用方法简单，可 携带大片段DNA，通用于各种 类型的裸露DNA或RNA，能转 染各种类型的细胞，没有免疫 原性。虽在体外基因转染中有 很高的效率，但第22页在/共40体页 内，能被 血清清除，并在肺组织内累积，
细胞转染实验
细胞转染实验1．实验目的学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。
了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。
2．实验原理Transfect上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。
电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。
但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。
本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。
3. 实验材料与器材1）材料293T细胞MyoD表达质粒和EGFP表达质粒DMEM培养基链霉素/青霉素（双抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸盐缓冲溶液）胰酶/EDTA消化液转染试剂（TransFast）2）器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯废液缸血球计数板涡旋振荡器恒温水浴箱台式离心机35mm培养皿转染管15ml离心管观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD4. 实验步骤细胞传代(1) 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
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3 载体DNA
对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正 常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定 细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。
（1）载体完整性 （2）载体制备物
4 组织培养试剂
一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的 培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。
转染的影响因素
细胞
（1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率）
2 交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有 可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程 这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞 所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过 镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培 养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导人细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
实验室用到的转染方法
脂质体介导法
细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞 为例：
电穿孔法 基因枪法 逆转录病毒
腺病毒
DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近 细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于 瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。
此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒 进入细胞的一般过程。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于 各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率， 但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应 用受限制。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因 此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长 短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问 题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)
（1）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进
人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
未整合
稳定转染
为获得稳定表达 外源基因的单细 胞克隆
整合
随细胞分裂而稀 释至丢失48－72 小时
随宿主细胞本身 基因组一样复制， 转录，翻译，并 被稳定遗传
抗生素抗性
抗生素抗性
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
DEAE一 葡聚糖法
磷酸钙法
人工 脂质体法
显微 注射法
细胞转染技术
一 ：转染的简介 二 ：转染的分类 三： 转染的方法
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并 使核酸在细胞内维持其生物功能。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治 疗研究。
二 、转达持续时间
筛选办法
瞬时转染 快速分析
转染前一天，将细胞铺到培养皿中， 加入有血清无双抗的培养基（15ml）； 24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml； 将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取
40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培养 基稀释，室温放置5min； 5min后将质粒和Lipofectamine 2000混合在一起，室 温放置20min后加入培养皿中，4h后换上完全培养基 48h培养； 注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；
(1)基础培养基 (2)胎牛血清 (3)添加剂