限制性内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。

限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等，1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。

了解限制性内切酶的用法先要知道什么是识别位点和切割类型。大多数的Ⅱ型限制性内切酶，都能识别4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。这样的序列称为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点的共同特点是具有双重旋转对称的结构形式，就是指这些核苷酸对的顺序是呈回文结构的。例如： EcoRI 识别GAATTC。切割类型分为粘性末端和平末端。粘性末端是两条链上的断裂位置是交错的，但又对称的围绕着一个对称轴排列。平末端是指两条链的断裂位置是一个对称的结构。平末端的DNA片段不容易重新环化。

按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，传统上将限制性内切酶分为四大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则远远不止四类。

Ⅰ型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研究中很有意义，但其不能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因而不具备实用性。Ⅱ型限制性内切酶能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列；只有当镁离子存在时，它们才有切割活性。Ⅲ型限制性内切酶也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA 链，并且要求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割。这类酶很少能达到完全切割。

了解限制性内切酶的用法先要知道什么是识别位点和切割类型。大多数的Ⅱ型限制性内切酶，都能识别4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。这样的序列称为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点的共同特点是具有双重旋转对称的结构形式，就是指这些核苷酸对的顺序是呈回文结构的。例如： EcoRI 识别GAATTC。切割类型分为粘性末端和平末端。粘性末端是两条链上的断裂位置是交错的，但又对称的围绕着一个对称轴排列。平末端是指两条链的断裂位置是一个对称的结构。平末端的DNA片段不容易重新环化。

使用限制性内切酶的条件是只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺苷甲硫氨酸的存在。限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一个 5' -磷酸基。

限制性内切酶命名是由属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如果一种寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系，以罗马数字表示。

限制性内切酶中有很多相似的酶。具有相同的序列特异性和切割位点的限制酶称为同裂酶。识别相同序列，但切割位点不同的酶，例如 SmaⅠ（CCC/GGG）和 XmaⅠ（C/CCGGG），称为新裂酶。虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。

影响限制性内切酶活性的因素。DNA样品纯度的影响，DNA制剂中可能抑制限制性核酸内切酶活性的物质:蛋白质、酚、氯仿、酒精乙二胺四乙酸（EDTA）十二烷基硫酸钠（SDS）高浓度的盐离子等。提高限制性内切核酸酶对低浓低纯度DNA制剂反应效率的方法有1、纯化DNA；2、增加核酸内切酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些；3、扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被响应地稀释；4、延长酶催化反应的保温时间。DNA的甲基化也会影响酶的活性。DNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。但是大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37℃。DNA分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高的可达20倍。限制性核酸内切酶的反应缓冲液Tris-Cl：使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大数限制酶来说，最佳pH = 7.4。MgCl2：保证酶活性的正常发挥。NaCl 或 KCl：保证酶活性的正常发挥。β-巯基乙醇：防止限制酶的氧化，保持酶的稳定性（但也可能有利于潜在污染杂质的稳定性）。牛血清白蛋白（BSA）：对某些限制酶是必需的，它是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。

酶的星号活性在极端的条件下（如高 pH 和低离子强度下），限制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列，这种改变的特异性称为星号活