高效毛细管电泳分离氨基酸PPT课件
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一是采用了25~100µm 内径的毛细管,； 二是采用了高达数千伏的电压。
第2页/共17页
高效毛细管电泳的优势
• 侧面/横截面比的增大使产生的热量能够较快散发，大 大减小了温度效应，使电场电压可以很高。
• 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小， 柱长增加。
• 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔 板数高达105～106板/米，毛细管凝胶电泳可以达到 107。
• 请举出两种常用的色谱定量的方法。(十二）
• 查阅文献，请举一毛细管电泳具体应用的实例。(九)
• 若在本实验的缓冲液中分别加入十二烷基三甲基溴化铵（阳 离子表面活性剂），或十二烷基磺酸钠（阴离子表面活性
剂），请推测电渗流的大小和方向以及样品的出峰顺序会产 生何种变化，为什么。(七)
• 若在本实验的缓冲液中加入有机溶剂甲醇，请推测电渗流会 产生何种变化，为什么。
第13页/共17页
4 姚老师的课题E的高效性和HPLC固定相具有高选择性的特点； • 分类：开管柱、填充柱、整体柱；
第14页/共17页
5 习题
• 请用电渗的原理确定推测本实验中两个样品的出峰顺序。 （四）
• 请以本实验为例列举两种色谱定性方法。(十)
• 微量：进样量只需1～50nl。 • 快速：几十秒到几十分钟就能完成分离。
第3页/共17页
高效毛细管电泳的应用
环境
食品
手性分离
应用
生物医药
高新技术 研究
石油化工
第4页/共17页
2.1 电渗现象electroosmosis
✓当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种定域电荷，因静 电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成高出溶液本体 的“自由”离子，即形成双电层，二者之间存在电位差。
人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；
第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖。
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和 技术叫电泳法或电泳技术。
按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；
简称EOF）。
迁移的离子或带电 基团。
第5页/共17页
2.2 高效毛细管电泳中的电渗流
以毛细管空管电泳为例，在高电场的作用下，管 壁硅醇基电离，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移 动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，受液体黏度的 阻力作用，引起柱中的溶液整体向负极移动，形成电渗 流。
第6页/共17页
2.3 HPLC与HPCE的流形比较
• HPLC压力驱动：溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中 心处的速度为平均速度的2倍。
• HPCE电场驱动：电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式 流动，谱带展宽较小，分离效率高。
第7页/共17页
2.4 高效毛细管电泳电渗流的作用
• 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；
• 若提高本实验的缓冲液中的磷酸二氢钠的浓度，请推测电渗
流会产生何种变化，并且此变化会对样品的检测产生何种影
响？(五)
第15页/共17页
• 请解释下列名词：电泳、电渗（双电层、定域电荷）、淌度。(第六组) • 若将本实验的缓冲液改成壳聚糖－乙酸缓冲液（壳聚糖在电解液中带正
电），请推测电渗流和出峰顺序会产生何种变化？(第八组) • 请简述样品在毛细管电泳中的分离原理。 • 查阅文献，请简述毛细管电泳中样品的分离会受到那些因素的影响及如何
• （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；
• 基于各被测物净电荷与质量比存在差异。不同离子表面 电荷密度的差异使其以不同的速度在电解质中移动，最
后达到分离。
第8页/共17页
3.1 高效毛细管电泳仪
✓电压：0～30kV； ✓分离柱为毛细管空管，内径100µm； ✓紫外检测器，检测波长280nm； ✓缓冲液：5mM NaH2PO4缓冲液（pH3.0）； ✓样品：色氨酸(0. 50g/L)、酪氨酸(饱和)的混合稀盐酸溶液。
影响（2～3点即可）。(一) • 查阅文献，请简述毛细管整体柱(电色谱)的制柱方法（1种即可）(11)。
壳聚糖
第16页/共17页
感谢您的观看！
第17页/共17页
✓在液体两端施加电压时，由于定域电荷无法移动，而双电层中的“自
由”离子在电泳过程中通过碰撞等作用给溶剂分子施加单向推力，使
之同向运动，并通过粘滞阻力带动周围溶剂运动，从而发生液体相对
于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现
象。
定域电荷：牢固结
✓ 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosm合电在场ot固的ic体作f表用lo面下w，不在能，
• 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
ν+ =ν电渗流 + ν电泳 ν- =ν电渗流 – ν电泳 一致ν；0 =ν电渗流
阳离子运动方向与电渗流一致； 阴离子运动方向与电渗流相反；
中性粒子运动方向与电渗流
• （1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；
• （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性；
第9页/共17页
3.2 毛细管的结构
毛细管是CE分离的心 脏。理想的毛细管必须是电 绝缘、紫外/可见光透明且富 有弹性的，目前可以使用的 有玻璃、熔融石英或聚四氟 乙烯塑料等。毛细管内径一 般为10 ～100μm，其截面 结构图标意图如图17.23所示。
第10页/共17页
3.3 紫外吸收装置
检测窗口制作：浓硫酸接触法、灼烧法和刀片刮除法
传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法 与其他分析相比。
第1页/共17页
1.3 高效毛细管电泳分析
1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细 管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生 了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新 的分离分析技术——高效毛细管电泳（HPCE）。 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：
高效毛细管电泳的应用食品环境生物医药石油化工手性分离高新技术研究应用21电渗现象electroosmosis当固体与液体接触时固体表面由于某种原因带一种定域电荷因静电引力使其周围液体带有相反电荷在液固界面形成高出溶液本体的自由离子即形成双电层二者之间存在电位差
1.2 经典电泳分析
1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在 两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将
第11页/共17页
3.4 示例
• 该例中管壁定域电荷呈电正性，电渗流方向为负极流向正极。 • 出峰顺序为：负离子——中性粒子——正离子； • 带相同电性情况下，荷质比较大的离子先出峰。
第12页/共17页
3.5 分离度计算
RS
2(t2 t1) W2 W1
Rs——分离度； t1,t2——保留时间，出峰时间； W1,W2——峰宽。
第2页/共17页
高效毛细管电泳的优势
• 侧面/横截面比的增大使产生的热量能够较快散发，大 大减小了温度效应，使电场电压可以很高。
• 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小， 柱长增加。
• 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔 板数高达105～106板/米，毛细管凝胶电泳可以达到 107。
• 请举出两种常用的色谱定量的方法。(十二）
• 查阅文献，请举一毛细管电泳具体应用的实例。(九)
• 若在本实验的缓冲液中分别加入十二烷基三甲基溴化铵（阳 离子表面活性剂），或十二烷基磺酸钠（阴离子表面活性
剂），请推测电渗流的大小和方向以及样品的出峰顺序会产 生何种变化，为什么。(七)
• 若在本实验的缓冲液中加入有机溶剂甲醇，请推测电渗流会 产生何种变化，为什么。
第13页/共17页
4 姚老师的课题E的高效性和HPLC固定相具有高选择性的特点； • 分类：开管柱、填充柱、整体柱；
第14页/共17页
5 习题
• 请用电渗的原理确定推测本实验中两个样品的出峰顺序。 （四）
• 请以本实验为例列举两种色谱定性方法。(十)
• 微量：进样量只需1～50nl。 • 快速：几十秒到几十分钟就能完成分离。
第3页/共17页
高效毛细管电泳的应用
环境
食品
手性分离
应用
生物医药
高新技术 研究
石油化工
第4页/共17页
2.1 电渗现象electroosmosis
✓当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种定域电荷，因静 电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成高出溶液本体 的“自由”离子，即形成双电层，二者之间存在电位差。
人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；
第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖。
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和 技术叫电泳法或电泳技术。
按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；
简称EOF）。
迁移的离子或带电 基团。
第5页/共17页
2.2 高效毛细管电泳中的电渗流
以毛细管空管电泳为例，在高电场的作用下，管 壁硅醇基电离，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移 动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，受液体黏度的 阻力作用，引起柱中的溶液整体向负极移动，形成电渗 流。
第6页/共17页
2.3 HPLC与HPCE的流形比较
• HPLC压力驱动：溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中 心处的速度为平均速度的2倍。
• HPCE电场驱动：电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式 流动，谱带展宽较小，分离效率高。
第7页/共17页
2.4 高效毛细管电泳电渗流的作用
• 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；
• 若提高本实验的缓冲液中的磷酸二氢钠的浓度，请推测电渗
流会产生何种变化，并且此变化会对样品的检测产生何种影
响？(五)
第15页/共17页
• 请解释下列名词：电泳、电渗（双电层、定域电荷）、淌度。(第六组) • 若将本实验的缓冲液改成壳聚糖－乙酸缓冲液（壳聚糖在电解液中带正
电），请推测电渗流和出峰顺序会产生何种变化？(第八组) • 请简述样品在毛细管电泳中的分离原理。 • 查阅文献，请简述毛细管电泳中样品的分离会受到那些因素的影响及如何
• （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；
• 基于各被测物净电荷与质量比存在差异。不同离子表面 电荷密度的差异使其以不同的速度在电解质中移动，最
后达到分离。
第8页/共17页
3.1 高效毛细管电泳仪
✓电压：0～30kV； ✓分离柱为毛细管空管，内径100µm； ✓紫外检测器，检测波长280nm； ✓缓冲液：5mM NaH2PO4缓冲液（pH3.0）； ✓样品：色氨酸(0. 50g/L)、酪氨酸(饱和)的混合稀盐酸溶液。
影响（2～3点即可）。(一) • 查阅文献，请简述毛细管整体柱(电色谱)的制柱方法（1种即可）(11)。
壳聚糖
第16页/共17页
感谢您的观看！
第17页/共17页
✓在液体两端施加电压时，由于定域电荷无法移动，而双电层中的“自
由”离子在电泳过程中通过碰撞等作用给溶剂分子施加单向推力，使
之同向运动，并通过粘滞阻力带动周围溶剂运动，从而发生液体相对
于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现
象。
定域电荷：牢固结
✓ 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosm合电在场ot固的ic体作f表用lo面下w，不在能，
• 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
ν+ =ν电渗流 + ν电泳 ν- =ν电渗流 – ν电泳 一致ν；0 =ν电渗流
阳离子运动方向与电渗流一致； 阴离子运动方向与电渗流相反；
中性粒子运动方向与电渗流
• （1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；
• （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性；
第9页/共17页
3.2 毛细管的结构
毛细管是CE分离的心 脏。理想的毛细管必须是电 绝缘、紫外/可见光透明且富 有弹性的，目前可以使用的 有玻璃、熔融石英或聚四氟 乙烯塑料等。毛细管内径一 般为10 ～100μm，其截面 结构图标意图如图17.23所示。
第10页/共17页
3.3 紫外吸收装置
检测窗口制作：浓硫酸接触法、灼烧法和刀片刮除法
传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法 与其他分析相比。
第1页/共17页
1.3 高效毛细管电泳分析
1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细 管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生 了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新 的分离分析技术——高效毛细管电泳（HPCE）。 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：
高效毛细管电泳的应用食品环境生物医药石油化工手性分离高新技术研究应用21电渗现象electroosmosis当固体与液体接触时固体表面由于某种原因带一种定域电荷因静电引力使其周围液体带有相反电荷在液固界面形成高出溶液本体的自由离子即形成双电层二者之间存在电位差
1.2 经典电泳分析
1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在 两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将
第11页/共17页
3.4 示例
• 该例中管壁定域电荷呈电正性，电渗流方向为负极流向正极。 • 出峰顺序为：负离子——中性粒子——正离子； • 带相同电性情况下，荷质比较大的离子先出峰。
第12页/共17页
3.5 分离度计算
RS
2(t2 t1) W2 W1
Rs——分离度； t1,t2——保留时间，出峰时间； W1,W2——峰宽。