蛋白质熔球态结构的形成及其加工特性研究进展

蛋白质熔球态结构的形成及其加工特性研究进展

高健;李祥鹏;石彦国;王冰;刘琳琳;张娜

【摘要】球蛋白在经过一定条件处理时会形成熔球态蛋白质,本文对蛋白质折叠与去折叠过程中熔球态的诱导方法和捕获技术进行综述,并系统阐述了熔球态蛋白加工性质相比于天然状态蛋白质的改善程度,对于提升相关产品的技术水平提供了理论依据和实践价值.

【期刊名称】《食品工业科技》

【年(卷),期】2019(040)009

【总页数】6页(P351-356)

【关键词】球蛋白;熔球态;折叠;结构;功能

【作者】高健;李祥鹏;石彦国;王冰;刘琳琳;张娜

【作者单位】哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076;哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨150076

【正文语种】中文

【中图分类】TS201.2

蛋白质是食品中重要的组分之一,是衡量食品营养价值的重要目标,其氨基酸残基线性链折叠成具有生物活性的复杂的空间立体三维结构,结构上的特点对加工特性具有重要的作用。Ohgushi等[1]和Wada首次发现并证明，马细胞色素C在低pH 或者变性剂存在的条件下,在折叠与去折叠的过程中形成一种新的结构状态,并将其命名为“熔球态”,熔球态结构具有与天然态相似的二级结构与特性粘度,但是缺少由侧链产生的特定的三级结构,蛋白质分子的半径比天然状态大10%～30%,结构中存在的松散堆积的疏水核心,使得疏水表面积比天然态有所增加[2-3]。有研究发现蛋白质的熔球态结构具有更加良好的溶解性、乳化性、起泡性、凝胶性、酶消化能力及抗氧化活性[4-5],可应用于食品产品中,因此,对熔球态蛋白质进行相关研究具有深远的意义。本文对蛋白质折叠与去折叠过程中的熔球态的结构特点进行讨论,并将系统阐述部分球蛋白熔球态的诱导方法,指出熔球态蛋白的加工特性与部分功能性。

1 蛋白质折叠与去折叠过程中的中间态

图1 Ptitsyn提出的“框架模型”Fig.1 “Framework model” proposed by Ptitsyn

早期的研究认为蛋白质折叠与去折叠的过程中不存在中间态,是一种“突变”过程,通常用二态模型表示。但Levinthal悖论中提出,多肽链中可能存在大量的天然构象,蛋白质必须通过一系列中间体折叠途径然后形成天然结构[6],Ptitsyn[7]在此基础上提出的“框架模型”进一步证明蛋白质折叠至少包括三个阶段(图1),第一阶段:在展开的链中形成波动二级结构,构成该结构的键主要是肽链的氢键;第二阶段:将之前的存在波动的二级结构与二级结构合并为中间球状结构,构成该结构的主要的力是疏水相互作用;第三阶段:将中间结构调整到最终的特定天然三级结构,这个阶段主要的力为范德华力。Kuwajima等人与Ikeguchi等人通过圆二色谱(CD)测量α-乳

白蛋白的去折叠中间态和盐酸胍诱导的α-乳白蛋白重折叠动力学的瞬时折叠中间态表现出相同的状态[8-9],而且有多项研究证明α-乳白蛋白[10-12]和脱辅基肌红蛋白[13-14]的去折叠过程中观察到的熔球态与各自重新折叠过程中形成的熔球态极为相似。并且在萨楚尔夫等人研究β-乳球蛋白重折叠的动力学特征中发现,蛋白质折叠和去折叠过程与二态模型描述的过程并不相符,蛋白质折叠与去折叠过程是经历许多中间态的构象渐变过程[15],熔球态是蛋白质折叠与去折叠构象渐变过程的一种中间态[16]。Cleland等[17]在研究牛碳酸酐酶B重折叠过程发现,去除复性剂或降低复性剂浓度后,变性蛋白从伸展态迅速卷曲形成第一中间态,即熔球态,在这种状态下,蛋白的疏水基团暴露于蛋白的表面,这一过程约在数百毫秒内就完成了,之后熔球态蛋白表面的疏水性残基向蛋白内部折叠形成疏水核心,即转变为第二中间态,这一过程相对缓慢,大约为数百秒。不论是变性还是复性的过程,熔球态蛋白过渡到其下一个状态的速度都相对缓慢,整个过程受到动力学的控制。

2 熔球态蛋白的结构特点

球形蛋白质的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,三级结构是氢键、离子键、二硫键等力的作用下,在二级结构的基础上进一步折叠卷曲形成复杂紧密的接近球形或椭球形的三维空间分子结构。球蛋白结构具有如下特点:a.都含有二硫键、游离巯基,以保证该蛋白质的高级结构的稳定(部分球蛋白中二硫键与巯基数量如表1所示);b.含有胱氨酸和半胱氨酸残基的蛋白质混合物能发生巯基-二硫键交换反应及巯基氧化反应,巯基-二硫键交换反应通常导致蛋白质分子的稳定性降低。经过变性条件处理后,疏水基团暴露,如在极端碱性或酸性pH条件下,球蛋白部分展开,增加分子内带电侧链基团之间的排斥,形成更为柔韧的结构,即熔球态结构蛋白[18]。

表1 部分球蛋白二硫键与巯基的数量Table 1 The number of partial globulin disulfide bonds and sulfhydryl groups来源种类-S-S-数量(个)-SH数量(个)大

豆7S11S22002蛋卵清蛋白14乳β-乳球蛋白21α-乳白蛋白40血清白蛋白171αs2-酪蛋白10κ-酪蛋白10

表征熔球态结构的常规技术包括:

a.检测蛋白质二级和三级结构的圆二色谱。如Vassilenko等[19]通过分析天然状态和pH诱导的九种蛋白质的熔球态的远紫外CD光谱得出熔球态下蛋白质的二级结构接近于天然状态。Kumari等[20]发现在pH为2.0时使用十二烷基硫酸钠对丝氨酸蛋白酶进行诱导处理可以得到一个具有与天然状态二级结构相似,含有大量的疏水表面且没有刚性的三级结构的中间状态。

b.检测蛋白质粒径、分子大小的流体力学技术如粘度测量和分子排阻色谱。蛋白质的粒径,分子大小,粘度等指标也反映出了蛋白质的紧密性,熔球态结构的蛋白质结构是紧凑的,近似于天然态的蛋白质。如Dolgikh等[21]通过测定牛乳和人乳中的α-乳白蛋白在酸、温度处理下的熔球态以及完全变性呈展开态的特性黏度发现,酸处理或热处理的α-乳白蛋白熔球态的特性黏度在3～4 cm3/g,与天然态(3.1～3.4 cm3/g)非常接近;而去折叠态是6.1～6.6 cm3/g。Dar等[22]用尿素诱导绵羊血清白蛋白形成熔球态蛋白,通过动态光散射法测得绵羊血清白蛋白天然态、熔球态和完全变性态的流体力学半径分别为3.60、6.73、11.00 nm。

c.检测蛋白质松散疏水基团的形成的疏水染料(ANS)结合实验。熔球态蛋白具有一定柔性,内部的一些非极性基团暴露在溶剂中,从而表现出疏水表面积比天然状态蛋白质更大。ANS是一种荧光疏水染料,用于监测折叠和展开过程中蛋白质疏水表面的暴露情况[23-24]。它对蛋白质中间状态的亲和力高于天然或完全未折叠状态的蛋白质[2,25-26]。Dave等[27]在研究碱性条件诱导茎菠萝蛋白酶发现ANS荧光在pH7～9时没有变化,但在pH10.0时突然出现三倍的峰值,随着pH的进一步升高消除了酶与ANS的结合,这些结果表明在pH10.0条件下茎菠萝蛋白酶中存在大量溶剂可及的疏水表面,证实在pH10.0下出现茎菠萝蛋白酶的熔球态结构。