药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物抗乙酰胆碱酯酶活性研究

物次生代谢产物进行转化， � 还能独立产生丰富的次生 基上， 每个平板放置 4 块， 然后置 2 8 培养箱中倒置 ， ， 3 7d � 代谢产物 是天然产物的重要来源 是具有高度开发价 培养 取切口处新长出的菌丝 ， 及时转接至新 值的新型生物资源� 近十年来植物内生菌及其活性代 谢产物已成为微生物学研究的一大热点［6 - 8］�为了得 到具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的次级代谢产物 ， 本文 b ia pu l c her r im a ) � 对 4 种 植 物 一 品 红 ( Eu phor 半夏 ( Pinel l ia t er nat e) � 细辛 ( M anc hu r ian W il dging er )� 狼毒 鲜的 PDA 培养基上培养， 待菌落出现后， 根据菌落形 态� 颜色的差异以及长出时间的不同， 分别挑取各菌落 边缘菌丝转接于分离培养基平板上进行再培养� 培养 数日后 ， 观察记录菌落的形态� 对获得的菌株进行纯 化培养， 经菌株 编号后， 转至 PDA 斜面 培养基上， 于
收稿日期 : 2 0 1 1- 0 4 - 0 8 0 4) 年教师培养计划 ( 编号 : Q20 0 9 9 76 - ) ， 作者简介 : 杨中铎 ( 1 男， 博士 ， 副教授 ， 硕士研究生导师 ， 主 要研 究方向为 天 然 药 物研 究 与 开 发 � E - m ail : ang hongdu o @ 1 2 6 .c om
� 6 9�
������������������������������பைடு நூலகம்������������������
［ 7］ 刘超祥， 高雪芹， 蒋继宏， 等 . 杉木根皮的 化学成分 研究［ J ］ .林 产 化学与工业， 20 0 9 ， 29 ( 1) : 1 00 -1 02. ［ 8］ 李林玺 .白沙蒿化学成分研究［ D］ .开封 : 河南大学， 2 0 0 7. ［ 9 ］ 安琪 ， ［J ］ .天然 产 杨春娟 ， 宋洋 ， 等 .无梗 五加果化学 成分的研 究 2 0 0 8， 2 0 ( 5 ) : 76 5 - 76 9. 物研究与开发 ， ［ 1 0］ J acqu es R .I sot opic m u l t ipl et s in t he c ar b on - 1 3 NM R spect r a ofani � l ine der i vat ives and nec l eosides w i t h par t ial deu t er at ed am ino Am . Chem .Soc.， 1 9 87 ， 1 09 (2 ): 3 1 6 - 3 2 1.
201 1年第 3 9 卷第 4 期 V ol .3 9， No .4， 201 1
�������������������������������������������������
［1 ］ 病" �对于该病的治疗， 目前最有效的手段是乙酰
( Ac etl t hiochol ine iodide， ATCI ， sigm a 公司) � 其余所用 试剂均为分析纯 � 2 方法 2 .1 待测样品的制备 2 .1.1 内生真菌的分离和纯化
201 1 年第 3 9 卷第 4 期 中 医 药 学 报 V ol .3 � 9， No .4， 201 1 Ac t a C hinese M ed ic ine and Phar m ac ol o g
版社， 1 9 75 : 9 . ［ 3 ］ 内蒙古自治区革命委员会卫生局 .内蒙古中草药［ M］ .内蒙 古 : 内 蒙古自治区人民出版社 ， 1 9 72 : 1 46 . ［ 4］ 黄泰康 ， � 现代本 草纲 目 � . 北京 : 中 国 丁志尊 ， 赵守训 . 上卷［M］ 20 0 1 :1 6 84 - 1 6 85. 医药科技出版社 ， ［ 5］ 朱有昌 ， M］ .哈尔滨 : 黑龙江 科学 吴德成 ， 李景富 .东北药用植物［ 技术出版社， 1 9 89 :1 1 76 - 1 1 77. 杂志， 2 0 0 5， 40 ( 9) : 6 57 - 6 59.
［ 6 ］ 许旭东， 杨峻山 .毛獐芽菜中 口山酮化学 成分研究［ � J ］.中国药 学 gr ou ps: ef f ec tofint r a - and int er m ol ecu l ar h dr ogen. B onding［ J ］ .J .
� � � � � � C� � � � C A P ( L. ) K .( ) �
q20男博士副教授硕士研究生导师主要研究方向为天然药物研究与开发mailanghongdu126comalheimerdisease简称ad老年痴呆中最常见疾病属中枢神经系统渐进发展的致死性神经原发性退行病变随着世界人口老龄化进程的加快ad将成为继心脑血管疾病癌症和艾滋病之后又一严重威胁人类健康和生存质量的世纪ol39no42011actachinesemedicineandpharmacolog对于该病的治疗目前最有效的手段是乙酰胆碱酯酶抑制剂的使用2320世纪90年代后期在合成来源和植物来源的乙酰胆碱酯酶ache抑制剂开发的同时日本的科技工作者开始筛选微生物来源的ache抑制剂iaw等首先报道从淡紫灰链霉菌中分离的ache抑制剂mura等报道了从青霉和曲霉中分离的一组化合物arisugacins和territrems对ache有抑制作用这些研究结果都证明从微生物中寻找ache抑制剂是一条可行且环保高效的方法内生真菌endophticfungi具有丰富的生物多样性不仅能够参与植物次生代谢产物的合成以及对植物次生代谢产物进行转化还能独立产生丰富的次生代谢产物是天然产物的重要来源是具有高度开发价值的新型生物资源近十年来植物内生菌及其活性代谢产物已成为微生物学研究的一大热点为了得到具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的次级代谢产物本文种植物一品红euphorbiapulcherrimapinelliaternate细辛manchurianstellerachamaejasmelinn的内生真菌进行分离并检测其代谢产物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用旨在为开发治疗老年痴呆的新药奠定基础材料11实验材料209年10月从甘肃临洮采集生长在野外的健康无病虫害的一品红euphorbiapulcherrimapinelliaternatemanchurian狼毒stellerachamaejasmelinn植株备以上植物由兰州理工大学生命科学与工程学院杨林副教授鉴定12培养基分离培养基
� LI U Yu - j ie， W AN G Qiu - hong ， YU X iao - dong ， Y AN G b ing - ou ， KU AN G H ai - xu e � � � � � � � � � � � � � � � � � � � (� K� � � � � L� C M M (H C M )， � � � � � � M� � � � � � � � � � E� � � � � � ，H � � � K � L CM M B ，H 1 50 0 40 ，C ) � � � � � � � � � A :O b j ect ive: To st ud t he chem icalc onst it u ent s of F ( L.) Kit am . f orant i - inf ect ive par t s. M et hods: W � it h m acr opor ou s r esin c ol u m n chr om at og r aph ， sil ica gel c ol u mn c hr om at ogr aph ， O DS col u m n chr om at og r aph ， H PLC � and ot herc hr om at ogr aph separ at ion and pu r if icat ion m et hods， acc or ding t o ph s ical and chem ic al pr oper t ies and spect r al dat at o ident if t he c om pou nd st r uc t ur e. R esu l t s: Seven non - f l av onoids w er e ident if ied as m angif er in ( 1) ; � Di - n - b u tl pht hal at e ( 2 ) ; Diisob � u� tl pht hal at e ( 3 ) ; A - acetl - phenol - - D - gl uc oside ( 4 ) ; 4 - ( 1- h dr ox et h l ) phenol - 1- O - - D - g l uc oside ( 5 ) ; Sc opol in ( 6 ) ; and adenos ine ( 7 ) . Conc l u sion: Com pou nds 1 t o 7 ar e f ir stisol at ed f r om Fil if ol iu m and F ( L.) Kit am . w hich f ur t herc l ar if ies t he m at er ialb asis ofFil if ol iu m s ib ir icu m ( L.) Kit am . f orant i - inf ect iv e par t s. K :F ( L.) Kit am . ; Ant i - inf ec t ion ; St r u ct ur e ident if ic at ion �������������������������������������������������
致死性神经原发性退行病变� 随着世界人口老龄化进 AD 将成为继心脑血管疾病� 程的加快 ， 癌症和艾滋病 之后 又一 严 重 威 胁 人类 健 康 和 生 存质 量 的"世 纪
�7 0 �
中 医 药 学 报 � Ac t a Chine se M ed ic ine and Phar m ac ol og
药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物 抗乙酰胆碱酯酶活性研究
杨中铎， 周静怡， 杨明俊
( 兰州理工大学生命科学与工程学院， 甘肃 兰州 73 0 0 50 ) 摘 要: 目的: 从 4 种植物的内生真菌中筛选对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性的提取物� 方法: 用组织块 法分离 4 种植物中的内生真菌 ; 对分离出的纯内生菌用液体培养基发酵培养， 用等体积乙酸乙酯和水饱 和正丁醇萃取发酵液并用乙醇对菌丝体进行索氏提取， 得到各组分提取物; 用改良的 El l m an 法测定提 取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性 �结果: 共分离出 5 3 株内生真菌， 其中有 7 种内生真菌萃取物有不同程 度的抑制乙酰胆碱酯酶活性， 其中以 XX - 1 0 的正丁醇组份的抑酶活性最强� 结论: 药用植物中存在丰 富的内生真菌， 其代谢产物具 有一定的抗乙酰胆碱酯酶活性， 可作为筛选 乙酰胆碱酯酶抑 制剂的新 � 资源 关键词 : 内生真菌; 分离; 次级代谢产物; 乙酰胆碱酯酶抑制剂 中图分类号 : R 2 84.2 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 2 - 23 9 2 ( 2 0 11 ) 0 4 - 0 0 6 9- 0 3 � � s disease，简称 AD) 是 阿尔茨海默病 ( Alheim er 修回日期 : 20 1 1- 0 5 - 21 老年痴呆中最常见疾病 ， 属中枢神经系统渐进发展的 基金项目 : 国家自然科 学基金 ( 编 号: 2 0 80 2 0 3 1) ; 兰州 理工大 学优秀 青
胆碱酯酶抑制剂的使用 � 20 世纪 90 年代后期 ， 在合成来源和植物来源的 乙酰胆碱酯酶 ( AChE) 抑制剂开发的同时 ， 日本的科 技工作者开始筛选微生物来源的 AChE 抑制剂， Iaw a
［2 ， 3］
等首先报道从淡紫 灰链霉菌中 分离的 AChE 抑制剂 取四种植物的球茎� 茎� 叶及花， 用无菌水冲洗干 ［4］ cc l ophos t in ， O m � ur a 等报道了从青霉和曲 � m 的 霉中分离 净� 用解剖刀将球茎切成 0 .5cm 0 .5cm 0 .5 c 的一组化合物 ar isu gac ins 和 t er r it r em� s 对 AChE 有抑制 小块， 将茎切成 1cm 的小段， 叶片 和花切成 0 .5 cm 作用［5］， 这些研究结果都证明从 微生物中寻找 AChE 抑制剂是一条可行且环保高效的方法� ic f u ngi) 具有丰富的生物多样 内生真菌( Endoph t 性， 不仅能够参与植物次生代谢产物的合成以及对植 0 .5 cm 的 小 片� 在无 菌 条 件 下 将切 好 的 材 料 置 于 75 % 乙醇消毒 3 m in 后再用 0 .1% 升汞溶液 处理� 球 茎 2 m in� 茎 1.5m in� 叶和花各 1m in� 无菌水冲洗 3 次， 切去边缘， 接入含硫酸链霉素( 2 0 0 U /m L) 的分离培养
( St el � l er a cham aej asm e � Linn ) 的内生真菌进行分 离， 并 2 8 培养箱中培养 5 7 d， 然后放入 4 冰箱中保存� 检测其代谢产物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用 ， 旨在为 表面消毒最后 1次冲洗后的无菌水， 取少量涂布于含 � � 28 开发治疗老年痴呆的新药奠定基础 链霉素 ( 2 0 0 U /m L) 的分 离培养基上 ， 1 材料 观察是否有真菌长出 � 1.1 实验材料 2 0 0 9 年 10 月从甘肃临洮采集生长 2 .1.2 次生代谢物提取液的制备 b ia pu l c her r i在野外的健康无病虫害的一品红 ( Eu phor m a ) �半 夏 ( Pinel l ia t er nat e ) �细 辛 ( M anc hu r ian 恒 温培养，