植物提取物化学成分分析相关技术

植物提取物化学成分分析相关技术
引言
饲用抗生素对我国畜牧业的发展做出了巨大的贡献，其应用已有多年的历史。

但抗生素的滥用导致了细菌产生耐药性、药物残留和食品安全等一系列问题的出现。

目前，国家已出台相应政策禁止抗生素在饲料添加剂领域的使用。

随着抗生素逐步退出饲料添加剂市场，绿色的新型饲料添加剂已成为主流趋势。

在2019年颁布的《天然植物饲料原料通用要求》中明确了可饲用天然植物作为饲料原料或添加剂使用的加工方式和标准，促进了可饲用天然植物在饲料加工中的应用。

植物提取物就是以天然植物为原料，经过物理和或化学提取分离过程，定向获取和浓缩植物中的某一种或多种有效活性成分，而不改变其有效成分结构形成的产品。

饲用植物提取物具有天然、绿色、毒副作用小等优点，在饲料工业中日益受到重视。

饲料营养活性物质是指饲料原料天然存在的或饲料中营养物质在饲料加工过程中及在动物体内消化代谢过程中产生的，具有诸如促进肠道健康、维持理想的免疫平衡和氧化平衡、节基因表达等特殊营养调控或保健功能的超微量成分，根据化学分类方法可将其分为多酚类、寡糖类等。

由于饲用植物提取物中的活性成分对植物提取物发挥各项功能起到了重要作用。

天然植物成分天然植物成分组成极为复杂，且植物的产地、采集时间等都会影响植物提取物的有效成分含量，从而影响功效。

为了确保饲料添加剂的安全性和稳定性，需确立植物提取物中活性成分的检测方法，而这一直是饲料添加剂质量标准的技术问题。

目前，生物医药领域多采用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱、气相色谱－质谱联用(GC⁃MS)技术或液相色谱－质谱联用(LC⁃MS)技术，并结合主成分分析(PCA)法建立的模型对植物中活性成分进行综合评价以及聚类分析。

LC⁃MS/MS因其效率高、精密度高等优势已成为植物中成分的主流鉴定技术，但传统的后期质谱数据处理过程耗时费力且可视化程度较差。

分子网络(MN)是近年来发展起来的一种可视化计算策略，其原理与PCA法相比，具有操作简便、高效快捷、可视化程度高、数据兼容性强等特点。

本文将分析植物提取物中的活性成分及前人分析方法，并基于LC⁃MS/MS技术结合MN对植物提取物成分定性及定量分析进行相关研究的综述，为植物性饲料添加剂的成分鉴定及质量控制提供思路和参考。

一植物提取物中主要活性成分
（一）多酚
多酚广泛存在于各种植物，由于其对人类和动物具有抗氧化、抗炎、提高免
疫力、调控脂质代谢等各项生理而引起科研工作者的广泛关注。

多酚按照结构分为类黄酮和非类黄酮化合物（芪、酚酸和木酚素等）两大类，前者包括花色苷、黄酮醇和黄烷酮等，后者包括咖啡酸、阿魏酸、绿原酸等小分子酚酸以及白藜芦醇等。

对多酚的测定基本是追随中草药的测定方法。

随着测定技术的发展，对多酚的定性测定已从最初的紫外－可见光到指纹图谱，再到最新的DNA图谱；对多酚的定量测定也从植物提取物总量测定发展到了靶向或非靶向化合物的含量测定。

薛宏坤等用紫外－可见光谱扫描葡萄皮色素的粗提物样品溶液，发现在280、520、330nm波长处均有吸收峰，说明样品中的主要活性成分为花色苷类，利用液相色谱－质谱联用对分离所得的花色苷类进行结构鉴定，得出3种糖苷。

钟迪颖通过傅里叶红外光谱分析仪和高效液相色谱串联质谱对紫花苜蓿花朵中的花色苷进行了鉴定，共得到13种花色苷单体，包含9种花色苷和4种花色苷衍生物。

杨炜琪等采用超高效液相色谱－四级杆／静电场轨道阱高分辨质谱串联质谱(UHPLC⁃Q⁃OrbitrapHRMS/MS)在线快速分离鉴定降香中的黄酮类化学成分，鉴定出了27个主要色谱峰。

刘红兵等利用液相－固相萃取－核磁共振／质谱联合应用技术成功鉴定出了牛至植物中的咖啡酸三聚体类化合物。

陈燕飞等采用薄层色谱法对冬葵子的化学成分进行了定性检测，从中分离鉴定出了阿魏酸。

张国升等采用气相色谱－质谱联用技术测定和鉴定了芦根中阿魏酸的含量和结构。

潘明飞等采用红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁H谱、C谱对获得的金银花绿原酸进行了化学结构鉴定。

闫仲丽等采用质谱法定量分析了果浆保健品中白藜芦醇的含量。

（二）多糖类
植物多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、调节肠道等多种生物功能，能够改善动物生长性能，提高机体免疫力，改善肠道健康。

多糖的结构与功能存在着密切的关系，不同的分子结构和不同的分子质量都会影响到多糖的生物活性，因此十分有必要对多糖结构进行鉴定。

李胜男等采用凝胶渗透色谱法测定了肉桂的相对分子质量，采用柱前衍生高效液相色谱法测定了肉桂中性多糖的单糖组分，通过甲基化法和核磁共振法测定了其单糖的连接方式，结果发现，肉桂的主要单糖为葡萄糖，单糖有3种连接方式。

朱静坚等采用高效液相色谱法测定了白术单糖的衍生物，得到指纹图谱，通过白术多糖指纹图谱鉴别出了5个共有峰，分别为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。

（三）植物精油
植物精油具有部分替抗、减抗的功能，因而引起了饲料行业的极大关注。

目前已有产品投入市场，针对植物精油的定性、定量研究工作也成为精油产品品控
的关键。

Santerre等比较了经典气相色谱技术和超临界流体色谱技术对柠檬精油定性、定量结果的差异，获得了相类似的结果。

Li等采用气质联用技术对山苍子精油的化学成分进行了鉴定和定量分析，含量最高的3种化学成分分别为反式柠檬醛、顺式柠檬醛和d-柠檬烯。

Sonmezdag等通过气质联用技术对开心果油中的挥发性成分进行了测定，各物质检出浓度为0.07~2.26mg/kg,检出限和定量限均能满足检测要求。

Napolitano等通过液质联用技术对榛子中的油脂类进行了测定，约82种油脂被检测出，某些油脂是第1次被检出。

（四）有机酸
有机酸包括有柠檬酸、乳酸、抗坏血酸、绿原酸等，植物中的有机酸一般都与钾、钠、钙等结合成盐，有些与生物碱结合成盐。

许金华等采用高效液相色谱法测定了五味子中柠檬酸的含量，结果显示4种五味子中柠檬酸的平均含量分别为172.8、127.1、126.5和117.9mg/g。

王彦平等建立了应用高效液相色谱法同时测定青贮饲料桑中乳酸、乙酸和丙酸含量的方法，测定结果显示乳酸、乙酸和丙酸在一定浓度下具有良好的线性关系，3种物质检出限为4.928~9.489mg/L,该方法适用于青贮饲料桑中有机酸的定量检测。

（五）生物碱
生物碱是一类含氮碱性有机物，是某些饲用植物提取物中的有效成分。

代珊等通过超高效液相色谱－串联质谱(UPLC⁃MS/MS)法测定不同附子炮制品中乌头碱、新乌头碱等14种生物碱的含量，采用化学计量学分析不同附子炮制品的差异，结果表明，各生物碱在各自浓度范围内线性关系良好。

钱茂升等结合柱色谱法和紫外分光光度法，以盐酸小檗碱为对照品，黄连下脚料为供试品，在波长229nm处测定黄连下脚料中生物碱的吸光度，依据盐酸小檗碱对照品吸光度与浓度之间的定量关系，计算出了黄连下脚料中生物碱的含量。

王昊天等应用高效液相色谱法对31批不同产地的苦参所含的4种生物碱（槐定碱、苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱）的含量进行了测定，并建立了指纹图谱。

目前，LC⁃MS/MS因其效率高、精密度高等优势已成为植物中成分的主流鉴定技术，但传统的后期质谱数据处理过程耗时费力且可视化程度较差。

分子网络(MN)是近年来发展起来的一种可视化计算策略，其原理与PCA法相比，具有操作简便、高效快捷、可视化程度高、数据兼容性强等特点。

下面将基于LC⁃MS/MS技术结合MN对植物提取物成分定性及定量分析进行相关研究的综述，为植物性饲料添加剂的成分鉴定及质量控制提供思路和参考。

二、MN的建立和可视化分析
（一）MN的建立
MN是一种串联质谱(MS/MS)的数据处理法，最初是Watrous等[28]将其应用到微生物领域，随后应用在海洋生物、真菌、天然植物等天然产物领域，近年来已广泛应用于代谢组学和药物研发等方面。

其主要原理是：结构类似的化合物在相同的质谱分离条件下，会产生相似的二级质谱碎片离子。

计算机对这些碎片离子进行相似度计算，根据相似度得分将二级质谱数据分为不同的簇，并整合成
1张可视化的MN图。

在这个可视化的图谱中，每1个节点代表1个化合物的二级质谱图，节点的不同颜色则代表了化合物的不同来源；节点间有连线代表2个二级质谱图之间有相关性，根据连线的粗细可以判断其相关性的大小。

基于MS/MS的MN可在不知道样品成分组成的前提下，对来自样品的大量质谱数据进行聚类和可视化分析，并且该技术对于各种质谱仪器（如Waters、Agilent等）采集的数据都是兼容的。

(二)全球天然产物社会分子网络( GNPS) 平台的介绍及可视化分析
GNPS数据库是一个开源的质谱数据共享的知识平台，为全球的科研工作者提供了大量共享的以及鉴定的MS/MS数据，推动了对于未知化合物探索的工作进程。

为了方便使用MN,GNPS自2014年正式开放使用，该平台每月的访问量可达到30万次。

GNPS数据库已经收录了22644个化合物和235850个谱图，这些化合物和谱图主要来自于第三方数据库(MassBank、HMDB、Re⁃Spect、NIST 等）以及全球多个科研机构采集的质谱图资料。

除鉴定已知化合物、类似物和MN 自动分析的功能外，GNPS数据库还可以对不同来源的二级质谱数据进行存储及更新，而且GNPS通过借助加利福尼亚圣地哥分校(UCSD)计算质谱中心(CCMS)的计算基础设施，提供了分析数据集并将其与所有公开可用数据进行比较的能力。

MN的可视化可以通过GNPS平台在线得到，也可将数据导入Cytoscape软件进行可视化分析。

（三）LC⁃MS/MS结合MN在植物提取物化学成分定性分析中的
应用
植物提取物是一个复杂体系，往往包含多种化合物。

MN根据二级质谱碎片离子的相似度大小将植物提取物中的化合物分成不同的簇并整合成1张可视化网络图谱，通过分析已知化合物的质谱图可以对其他未知物进行快速解析，对于植物提取物的成分鉴定具有重要意义。

MN的建立一般分为如下几个部分：1)制备植物提取物；2)将待测样品溶液进行质谱进样分析，采集数据；3)将原始的二级质谱数据用ProteoWiz⁃ard软件进行格式转化，转化为.mzXML格式；4)将数
据上传至GNPS分析平台进行MN分析，采用Cytoscape软件构建网络可视化；
5)通过GNPS在线分析MN,MN图中可直观显示提取物中的化合物与标准品的结构相似度，比较相关节点之间质谱数据的异同，从而可以得出与已知化合物结构相似的化合物或者其他未知化合物。

DeOliveira等采用LCMS/MS技术结合MN对Adenocalymmaimperatoris⁃maximilianii(Wawra)L.G.Lohmann提取物进行成分鉴别，共鉴定出63个化合物，多为黄酮苷类化合物，还首次从该植物中指认出了含有异戊二烯基的黄酮类化合物。

Cheng等采用柱后衍生化的高效液相色谱－紫外－荧光(HPLC⁃UV⁃FLD)联用技术，对具有抗氧化活性的山茶乙酸乙酯萃取物的具体活性成分进行筛选，采用超高效液相色谱－四级杆飞行时间质谱联用技术(UPLC⁃QTOF⁃MS/MS)和MN方法从萃取物中分离得到一种新型抗氧化剂冲山茶苷(okicamelliaside)。

Yang等通过高分辨LC⁃MS/MS结合MN辅助分析，从废弃肉桂叶水提物中鉴定得到101个化合物，其中酚酸、萜及其苷类为主要成分，并在肉桂叶中首次发现了内酯、木脂素和黄烷醇类化合物，利用2,2′-联氮－双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)法和铁离子还原／抗氧化能力(FRAP)法结合MN分析发现了1个抗氧化成分。

目前UPLC⁃QTOF⁃MS/MS结合MN技术已应用于牡丹果实提取物、银杏叶提取物、番石榴叶提取物、问荆提取物、红毛丹种子提取物等植物提取物的化学成分分析。

此外，采用MN可以对不同批次样品中的化学成分进行可视化分析，直观显示不同来源样品中化学成分的差异，有研究使用MN技术比较了2种亲缘关系较近的大戟属植物Pithyusa和Cupanii中的二萜类化合物，并发现了抗基孔肯雅病毒(chikungunyavirus)复制的新化合物。

LC⁃MS/MS技术结合MN在植物提取物化学成分鉴别方面发挥着独特的作用，可高效、准确地对植物中活性成分进行定性分析，利于阐明其活性成分与功效之间的关系，并可结合网络药理学等工具从分子水平研究其作用靶点，为其药效物质基础的研究奠定基础。

（四）LC⁃MS/MS结合MN在植物中活性成分定量分析中的应用
由于天然植物的品种、产地、采集时间、炮制加工方式等不同会影响饲用植物添加剂的功效，远不能满足商品化饲料添加剂的要求，给其质量控制的研究带来巨大困难。

一般情况下，LC⁃MS/MS可以实现对不同来源植物提取物中的化学成分快速鉴别，但对其进行定量分析始终是一个难题。

对此，Winnikoff等提出了MN定量的新策略，即基于串联质谱原点跟踪引擎(TOrTE)的MN定量分析方法，可对提取物中的特定化学成分进行相对或绝对定量。

MN的定量分析步骤如图3所示：1)采集植物提取物的质谱数据；2)将每个节点的原始质谱数据通过TOrTE转化为“cluster_in⁃fo.txt”文件；3)进行格式转化，将质谱数据文件转化为
“.mzXML”格式；4)使用ProteoWizard软件提取每个节点的色谱峰，计算其对应面积之后保存在注释表中；5)通过Cytoscape将计算得到的各峰面积映射在饼状图中。

其中，1个节点代表1种化学成分，节点的颜色代表化学成分的来源，每个节点中各颜色所占面积大小代表某个化学成分在不同来源样品中的相对含量。

非靶向LC⁃MS可以对不同来源植物的提取物中的化学成分快速鉴别，同时可以结合MN对目标成分进行定量分析。

Winnikoff等利用LC⁃MS/MS技术收集到20种海洋蓝细菌粗提物的质谱数据，通过MN将质谱数据整合到1个可视化图谱中，采用基于TOrTE的MN定量方法对海洋蓝细菌(Okeaniahirsuta)中含量最高的鞘丝藻酰胺C进行了定量研究，结果发现，1mg海洋蓝细菌至少能产生鞘丝藻酰胺C的量为0.024mg,占海洋蓝细菌干重的2.4%。

基于TOrTE策略的MN定量方法不仅可以直观地分析不同来源提取物中化学成分的差异，而且可以分析不同来源提取物中化学成分的相对或绝对含量。

将MN应用于饲料添加剂中有效成分的含量测定，以及不同来源饲用植物提取物的成分差异性检测，对饲用植物提取物的质量控制提供安全稳定的数据支撑。

三、小结与展望
目前“全面禁抗”已成为大势所趋。

饲用植物提取物成为“替抗”产品已经凸显其优势，例如苜蓿提取物、紫苏籽提取物、杜仲提取物等已被列入饲料添加剂品种目录。

但饲用植物提取物如何发挥药效还需回归到其用法用量上。

因此，制定规范的含量测定方法及质量控制标准具有重要的意义。

近年来，LC⁃MS/MS 技术因其分离性能强、准确度高等特点，已成为中草药成分分析的主流技术；MN 则通过计算质谱数据之间相似度大小，将所有数据整合到1张可视化网络图谱中，可直观显示化学成分之间的相似度大小及结构类型，也可以对不同来源样品中的成分进行聚类及可视化差异分析。

将LC⁃MS/MS技术与MN结合，实现了饲用植物提取物中活性成分的快速定性定量分析，可为饲用植物提取物的成分分析及质量控制标准规范化提供重要的参考。