生物化学实验指导

放入比色槽。 (2)在 585nm 处，调第 1 支比色皿透光度为 100%T，依次测出其他几支比色皿的 T%。 不合格的需反复剔除极端值，或重新配对，直至有 2 个以上的比色皿合格。
二、结果及讨论
【参考范围】 1、波长的检测：在 529nm ± 1nm 处有最大吸收值为合格。 2、杂光的检测：T% ≤ 5%为合格。 3、比色皿配套：Tmax % – Tmin% ≤ 0. 5% 为合格比色皿配套。 【注意事项】 1、722 型分光光度计的使用方法：选定检测波长，置调节模式为透光率 T，将某一盛装参比介质 的空白比色皿置于光路，打开遮光板，调 0%T，盖上遮光板调 100%T，再将盛装待测液体的比色皿置 于光路，测出 T 值，或置调节模式为吸光度 A，即可测出 A 值。注意每次测定均需重新调 0%T、100%T。 2、在杂光检测中，用于调 0%T 的黑纸片应完好无孔洞，否则会导致假合格现象。 3、使用比色皿时，其盛装液体不能超过总体积的 2/3，也不宜少于 1/2，且在检测前必须用擦镜纸 将比色皿外的液体擦拭干净。
糖标准溶液管：第 2、3 号管。注意稀释后要混匀。
2 号管
3 号管
110mmol/L 葡萄糖液（μl）
100
50
D.W.（μl）
50
50
葡萄糖液浓度（mmol/L）
பைடு நூலகம்
73.33
55
2、再将第 2、3 号管分别取 50μl，加 D.W.50μl 依次作等倍稀释（各 4 管），得到 8 种较低浓度的
葡萄糖标准溶液，稀释方法见下图：
实验一 分光光度计性能检测
【实验目的】 1、掌握分光光度计的性能检测，包括波长检测、杂光检测以及比色皿配对。 2、掌握分光光度计的使用方法。 【实验原理】 1、波长检测：⑴可见光区域的黄光波段比较狭窄，适用于光度计波长的粗测；⑵镨钕滤光片在
529nm±1～2nm 处有较好的吸收峰，适用于光度计波长的细测。 2、杂光检测：镨钕滤光片在 585nm 处吸光度 A 最大，透光率 T 最小，所产生的透光与杂光成正
据
Xi
=
Ai AS
×XS
计算出样本中TP浓度Xi。
n
n
∑( xi )2
∑ s =
xi2 −
i =1
i =1
n
n −1
∑ ，
x
=
1 n
n i=1
xi
，CV＝
s x
×100
％
三、结果及讨论
【参考范围】 一般要求批内 CV＜5％。
【注意事项】 1、为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应时间，准 确读数。 2、严格遵守“五同一短”的原则，尽量减少人为误差。
各 1.5 ml 摇匀，37℃水浴 10 分钟后，用 0.5cm 的比色皿，505nm，B 管（蒸馏水 D.W.＋试剂）调零，
测各管吸光度
A1
A2
C1=5.56
C2
A3
A4
A5
Add1=1
Add2=2
C3
C4
C5
1mmol/LVc 的干扰值 E
E1
E2
其中，
E1
=
C4 − C3 add1
E2
=
C5 − C3 add2
实验六 方法学评价试验（4）——对比试验
100的稀释已制备二含量测定1打开空气泵调空气压为04kgcm004mpa2打开测定开关及燃气压开关适当调大煤气量3点火调节火焰呈淡蓝色开关2用去离子水调零的标准读数4测样品读刻度5计算标准读数测定读数浓度血清5测nammolna标准读数测定读数浓度血清三结果及结果分析参考范围血清钠135145mmoll
5
1mmol/LVc 的平均干扰
值 EE
EE = E1 + E2 ，有 E>0 的舍去，注意分母随其变化。 2
三、结果及讨论
【参考范围】 在血糖测定的医学决定水平 2.8、6.7、8.9mmol/L 时，偏差（Bais）应小于 0.56mmol/L。 【注意事项】 1、可疑干扰物浓度 可加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，有时可能达到病 理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在 0.42~0.9mmol/L 之间。 2、凡可疑干扰物都应做，此处仅是举例示范。 3、无论是方法特异性或是受干扰，都影响到测定结果的正确性，影响的程度与分析物的浓度无关， 但与非分析物的两有关，所以产生的误差都是恒定系统误差，常以偏差 Bias 作为统计量。Bias 指所有 测定值系统性地偏差真值，表示系统误差的大小。在干扰试验中，偏差等于干扰样品测定值与基础样品 测定值之差。 4、分析物浓度应选择医学决定水平，血糖测定的医学决定水平为 2.8、6.7、8.9mmol/L。 5、纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的 10%，避免将血清稀释过度，引起误差的改变或 消失。
比，因此可用其透光率表示杂光的大小。 3、比色皿配对：一套比色皿之间的材质、厚薄、色泽、空白吸收等应该一致，误差小于 0.5%才能
配套使用。 【试剂与器材】 1、镨钕滤光片、白纸条、黑纸片、蒸馏水等； 2、722 型分光光度计、比色皿。 【操作步骤】 一、操作 1、波长检测 (1)粗测：调仪器波长旋纽至 580nm 处，打开遮光板，在比色槽中光路经过处放一白纸条，观察是
10 10 10 10 10 10
10 10 10 10 10
酶试剂（ml）
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
混匀，37℃水浴 15 分钟，取出冷却至室温，在 505nm 处用 0.5cm 的比色皿，B 管调零，测各管吸光度
吸光度 A
0
标准液浓度 C
取量 加酶试剂
吸光度 Glu 加 入 后 值 实测浓度C= （A / A1 ） ×C1 回收率 R
空白 B
标准 S 原 血 清 基础血清T1 回1 T2
回2 T3
回3 T4
T0
各 20 μl
各 3 ml
摇匀，37℃水浴 10 分钟后，B 管调零，测各管吸光度
A1
A2
A3
A4
A5
A6
add1=1.11 add2=3.33 add3=11.
0 110 73．33 55 36.67 27.5 18．33 13．75 9.17 6.88 4.58 3.44
（mmol/L）
二、绘制 A-C 曲线
2
在坐标纸上，以吸光度 A 为纵坐标，葡萄糖浓度 C 为横坐标绘制 A-C 曲线。 三、结果及讨论
【参考范围】 该方法的线性可达 22.24 mmol/L。 【注意事项】 1、Glu 标准液的加入量必须十分准确，应用计量性能准确度很高的微量进样器加样。准确加量是 最主要的技术关键。这对于后面所有需要微量加样的定量实验均是如此。 2、标准管系列中每管平行做 3 管取平均值。 3、造成线性变窄的原因为试剂配制中组分投料不足。试剂配制后组分稳定性差。 4、有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指定的高限， 但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这往往是样品中的介质效应引起的，值得注意。
一、样品的处理（已制备）
1、基础血清管 = 原血清 0.9ml+蒸馏水 0.1ml 2、回收管 = 原血清 0.9ml+相应的 Glu 标准液
回1 = 原血清 0.9ml+ 11.1mmol/L的Glu标准液 0.1ml 回2 = 原血清 0.9ml+33.3mmol/L的Glu标准液 0.1ml 回3 = 原血清 0.9ml+111mmol/L的Glu标准液 0.1ml 二、操作与计算
1
C1=5.5 C2
C3
C4
C5
C6
6
R1
R2
R3
其中，
R1
=
C4 − C3 add1
R2
=
C5 − C3 add2
R3
=
C6 − C3 add3
平均回收率 RR
RR = R1 + R2 + R3 ，有 R< 0 的舍去，注意分母随其变化。 3
三、结果及讨论
4
【参考范围】 回收率：100%±5% 【注意事项】 1、分析物浓度应选择医学决定水平，血糖测定的医学决定水平为 2.8、6.7、8.9mmol/L。 2、纯标准溶液的加入体积不得超过血清样品的 10%，避免将血清稀释过度，引起误差的改变或消 失。
实验三 方法学评价试验（2）——重复性试验
【实验目的】
1、掌握批内重复性试验的原理及操作方法。
2、了解双缩脲法测定总蛋白 TP 的操作方法。
【实验原理】
“五同一短”：同一方法、同一人、同一器材、同一实验室、同一测定条件（标本、标准品和试剂相
同，温度、湿度、pH 等相同）下，短期内重复测定。指标用批内 CV 来评价。
否有均匀的黄光。 (2)细测：调波长至 529nm 处，打开遮光板，调 0%T，盖上遮光板以空气调 100%T，将镨钕滤光片
插入光路，测出 A 值。再在 529nm 附近每隔 1～2nm，各测其 A 值。 2、杂光检测 (1)调波长为 585nm，盖上遮光板，用黑纸挡住比色皿光路，调 0%T。 (2)盖上遮光板，用空气作空白调 100%T。 (3)插入镨钕滤光片，盖上遮光板，测出 585nm 时的 T%，即为杂光水平。 3、比色皿配套 (1)选取几支大小、材质、色泽相同的比色皿，洗净，装入占比色皿体积 2/3 的蒸馏水(D.W.)，擦干，
的线性范围要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。
【试剂与器材】
1、蒸馏水，Glu 标准液，GOD-POD 法酶试剂。
2、722 型分光光度计，比色皿。
【操作步骤】
一、样品的处理与测定
1、原始的葡萄糖标准溶液浓度为 110mmol/L，设为第 1 号管，将其稀释后得到 2 种高浓度的葡萄
法测定并得到各自浓度。
回收浓度=分析标本测得浓度－基础标本测得浓度
加入浓度=
标准液量(ml ) 病人样品量(ml )+ 标准液量(ml
)
×
标准液浓度
回收浓度 回收率（%）=
× 100
加入浓度
【试剂与器材】
1、 血清，蒸馏水，Glu 标准液，GOD-POD 法酶试剂。 2、 722 型分光光度计，比色皿。 【操作步骤】
3
实验四、方法学评价试验（3）——回收试验
【实验目的】
1、掌握回收试验的原理及操作方法。 2、掌握 GOD-POD 法测 Glu 的原理。 【实验原理】
回收是指候选方法准确测定加入常规分析标本的纯分析物的能力，用回收率表示。将被测物标准液
加入病人标本中，成为分析标本；原病人标本中加入等量的无被测物的溶剂作基础标本；然后用候选方
管号
24
6 8 10
3 5 7 9 11
浓度（mmol/L） 73.33 36.67 18.33 9.17 4.58
55 27.5 13.75 6.88 3.44
3、取 12 支试管，其中设有空白管（B）。按下表操作：
试管编号
B1
2
3
4
5
6
7
8 9 10 11
D.W.（µl）
10
葡萄糖标准液（µl）
实验五 方法学评价试验（4）—— 干扰试验
【实验目的】 1、掌握干扰试验的原理及操作方法。 2、熟悉 GOD-POD 法测 Glu 的原理。 【实验原理】 干扰试验是用来检测候选方法的恒定系统误差。干扰物浓度不同，误差大小也不同。本实验将干扰 物质维生素C（VC）配成一定浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标本加入相同量 的无干扰物质的溶剂作为基础样本；然后用候选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物 质产生的干扰所引起的误差，即干扰值。 干扰值=分析标本测得值－基础标本测得值 【试剂与器材】 1、血清、蒸馏水、Glu 标准液、GOD-POD 法酶试剂； 2、722 型分光光度计、比色皿。 【操作步骤】 一、样品的处理（已制备） 1、基础血清管 = 原血清 0.9ml+蒸馏水(D.W.)0.1ml 2、干扰管 = 原血清 0.9ml+相应的维生素 C 干扰液 0.1ml
干1 = 原血清 0.9ml+10 mmol/LVC干扰液 0.1ml 干2 = 原血清 0.9ml+20mmol/L VC干扰液 0.1ml 二、操作与计算
取量 加酶试剂
吸光度 Glu 加入后值 实测浓度C= （A / A1 ）
×C1
空白 B
标准 S
原血清T0
基础血清T1
干1 T2
干2 T3
各 10 μl
【试剂与器材】
1、双缩脲试剂、蛋白质标准液；
2、722 型分光光度计。
【操作步骤】
一、操作：采用双缩脲法，设置标准和空白，同一标本用对比法测定 10 份（n＝10）。按加样：试 剂比=50μl：2.5ml，37℃水浴 10min，540nm，测定出TP标准液的吸光度As和样本的吸光度Ai。
二、计算：
1
实验二 方法学评价试验（1）——线性范围试验
【实验目的】
1、掌握线性范围试验的原理及方法。 2、掌握葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）法测定葡萄糖（Glu）。
3、熟悉分光光度计的使用。
【实验原理】
使用不同浓度的葡萄糖标准溶液，用 GOD-POD 法试剂测定各自的吸光度，以标准浓度为横坐标， 以其对应的吸光度为纵坐标，在方格纸上作图，即可绘制出一条直线，即剂量反应曲线。一般测定方法