盐酸多西环素缓释片体内外相关性研究

盐酸多西环素缓释片体内外相关性研究
王丽瑶;王永禄;李学明;徐璐;张夕瑶
【摘要】目的考察盐酸多西环素缓释片的体外释放度与其在犬体内吸收的相关性.方法采用紫外分光光度法在268nm波长处检测并计算盐酸多西环素缓释片10h 的累积释放度；采用高效液相色谱法检测beagle犬(n=6)口服盐酸多西环素缓释片48h内的血药浓度,以Wagner-Nelson法计算其体内吸收分数fa,考察fa与体外溶出速率ft的相关性.结果盐酸多西环素缓释片8h的累积释放度＞90％；犬体内的fa值在6h达最高值；盐酸多西环素缓释片体内吸收分数fa与体外释放速率ft的关系式为:fa=0.8586f+23.712(r=0.975,P＜0.01).结论盐酸多西环素缓释片体外释放与在犬体内吸收的相关性良好.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2013(038)010
【总页数】5页(P765-768,775)
【关键词】盐酸多西环素;缓释片;Wagner-Nelson法;体内外相关性
【作者】王丽瑶;王永禄;李学明;徐璐;张夕瑶
【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,合肥230036;南京工业大学药学院,南京211816;南京工业大学药学院,南京211816;南京工业大学药学院,南京211816;南京工业大学药学院,南京211816
【正文语种】中文
【中图分类】R978
多西环素属于第二代四环素，是一种快速抑菌剂，具有高效、长效、广谱的优点，临床主要用于敏感的革兰阳性菌和革兰阴性菌所引起的各种常见炎症[1]。

治疗干
眼症是多西环素最新的一个临床应用[2]。

随着电脑的普及、学习任务的加重和人
口老龄化等因素，干眼症已逐渐成为一种常见多发的慢性疾病，并呈低龄化发展的趋势，目前还无法彻底治愈。

干眼症症状若长期无法缓解，可导致视力受损[3]。

多西环素对导致干眼症的基质金属蛋白酶3、9及白细胞介素1有明显的抑制作用，且起效迅速、刺激性低，对干眼症的治疗有较好的疗效[2]。

我们以羟丙甲纤维素(HPMC)为亲水凝胶骨架材料，研制了盐酸多西环素缓释片。

将多西环素制成缓释片可有效改善药物浓度峰谷波动，保持平稳持久的有效血药浓度，减少给药次数及毒副作用，提高患者的顺应性。

本文考察了盐酸多西环素缓释片的体外释放度与其在犬体内吸收的相关性，以期为该制剂的质量控制和临床应用提供参考依据。

1 仪器与试药
1.1 仪器
LC-20AT岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；BP211D电子天平(德国赛多利斯
公司)；HGC-24A型24孔干式加热氮吹仪(北京万诚博达科贸有限公司)；TG16-
W微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；ZRS-8G智能溶出试验仪(天
津大学无线电厂)；TU-1901双光束紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任
公司)。

1.2 试药
盐酸多西环素原料药(河南中帅医药有限公司，批号：D2*******)；盐酸多西环
素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：0485-9901)；盐酸多西环素缓释片(南京工业大学药剂研究室自制，批号20110328，规格：每片40mg)；美他环素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130487-200302)；甲醇、乙腈为色谱
纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物
健康成年beagle犬6只，雌雄各半，体重11.4±0.61kg，普通级，购于上海市新冈实验动物场，动物合格证号为SCXK(沪)2010-0015。

受试前经体格检查及肝、肾功能检查均正常。

2 方法与结果
2.1 盐酸多西环素缓释片的制备及体外释放度测定
2.1.1 盐酸多西环素缓释片的制备
称取处方量的主药盐酸多西环素和辅料乳糖、羧丙基甲基纤维素(HPMC)、微晶纤维素(MCC)，过100目筛，充分混匀后加入PVP-无水乙醇(10%)溶液作为粘合剂制备湿软材，过24目筛制湿颗粒，于50℃干燥，颗粒干燥后过24目筛整粒，最后加入硬脂酸镁充分混匀，压片，即得。

2.1.2 体外释放度测定
照中国药典2010附录XD释放度测定第一法[4]，采用溶出测定法第一法装置(转
篮法)，测定盐酸多西环素缓释片的释放度，溶出温度(37±0.5)℃，转速100r/min，释放介质为经过脱气处理的0.01mol/L盐酸溶液900mL。

取盐酸多西环素缓释片6片分别置转蓝中，分别于0.5、1、2、3、4、6、8和10h取样(补充同温等量介质)，经0.45μm滤膜过滤，续滤液作为样品溶液，照分光光度法(中国药典2010
年版第二部附录IV A)，在268nm处分别测定其吸收度值，计算累计释放量。

盐
酸多西环素缓释片的累积释放度曲线见图1。

实验结果表明，盐酸多西环素缓释片8h的累积释放度已经超过90%。

2.2 盐酸多西环素缓释片体内分析方法的建立
2.2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18柱(150mm×4.6mm, 5μm)；预柱：DIKMA(C18,
10mm×4.0mm)；流动相：水-乙腈-70%高氯酸(70 : 30 : 0.25, V/V/V)；检测波长：350nm；流速：1.0mL/min；柱温：25 ℃。

2.2.2 血浆样品处理方法
取血浆样品400μL，置10mL离心管中，加入内标美他环素溶液100μL(5
μg/mL)，再依次加入6%抗坏血酸溶液100μL、亚硫酸钠缓冲液1mL(取亚硫酸钠25.2g、磷酸二氢钠二水物36.3g，加蒸馏水使溶解并稀释至l00mL)、乙酸乙脂
6mL，涡旋1min，于4000r/min离心10min，移出上层有机相，加入0.02%的抗坏血酸甲醇溶液100μL，于40℃氮气下吹干，残渣加入流动相800μL，正己烷4mL，涡旋30s，移除上层有机相，取下层溶液经0.45μm滤膜过滤，取20μL进样分析。

2.2.3 方法专属性考察
取按2.2.2项下方法预处理后的空白血浆、空白血浆加药样品和给药后血浆样品各20μL进样分析，考察空白血浆中内源性物质对盐酸多西环素含量测定的影响。

空白血浆、空白血浆加样及犬给药后血浆样品色谱图如图2所示，结果可见内标美
他环素的保留时间为8.6min，盐酸多西环素的保留时间为10.0min，分离度及峰型均良好，血浆中内源性物质对盐酸多西环素和内标色谱峰无干扰，结果表明该方法专属性较好，能够满足生物样品测定要求。

2.2.4 对照品溶液和内标溶液的制备
盐酸多西环素储备液的制备取盐酸多西环素标准品20mg，精密称定，置50mL
量瓶中，加0.01mol/L的HCl溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含盐
酸多西环素400μg的储备液A。

精密量取2.5mL储备液A，置25mL容量瓶中，用0.01mol/L的HCl溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含盐酸多西环素40μg 的储备液B。

分别精密量取0.125、0.25、0.625、1.25、2.5、5.0mL的储备液B，
置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0和20.0μg/mL的盐酸多西环素系列溶液。

美他环素内标溶液的配制取美他环素25mg，精密称定，置50mL量瓶中，用
0.01mol/L的HCl溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含美他环素500μg的储
备液，精密量取1mL储备液，置100mL量瓶中，用0.01mol/L的HCl溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含美他环素5μg的内标溶液。

2.2.5 标准曲线的建立
分别取2.2.4项下配制的盐酸多西环素系列梯度浓度溶液100μL，置1mL塑料离
心管中，加入空白血浆300μL，涡旋30s，制成血药浓度分别为0.125、0.25、0.625、1.25、2.5和5.0μg/mL的样品，按“2.2.2”项下血浆样品处理方法操作，精密量取20μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录样品峰与内标峰的峰面积As、Ai，以峰面积之比A=As/Ai为纵坐标，血药浓度C为横坐标，进行线性回归，得到回归方程为A=0.5193C+0.2425，R2=0.9965。

结果表明，盐酸多西环素在0.125～5μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度实验
按“2.2.5”项下方法制备浓度分别为0.125、1.25和5μg/mL的盐酸多西环素溶液，作为低、中、高浓度样品，于一日内每隔2h进样测定，重复测定5次，计算日内精密度；连续测定5d，计算日间精密度。

结果日内RSD分别为4.49%、
1.81%和1.13%；日间RSD分别为4.21%、3.11%和1.52%，说明样品分析的精密度良好，符合生物样品测定要求，方法可行。

2.2.7 回收率实验(1) 萃取回收率
精密吸取“2.2.4”项下制备的不同浓度盐酸多西环素系列溶液适量，加入美他环
素内标液100μL(5μg/mL)，配制成(5.0μg/mL)、中(1.25μg/mL)、低
(0.125μg/mL)3种不同浓度的盐酸多西环素溶液，取上清液20μL进样分析，记
录样品与内标的峰面积之比A1；另取空白血浆300μL，精密加入“2.2.4”项下制备的不同浓度盐酸多西环素系列溶液适量，配制成制备成取高(5.0μg/mL)、中(1.25μg/mL)、低(0.125μg/mL)3种不同浓度的盐酸多西环素血浆样品溶液，按“2.2.2”项下血浆样品处理方法操作，记录样品与内标的峰面积之比A2，以
A2/A1之比计算萃取回收率。

结果，高、中、低3种浓度的平均萃取回收率分别
为62.3%、67.1%和68.4%，RSD分别为7.83%、5.67%和1.42%，结果表明此方法的萃取回收率能够满足样品测定要求，方法可行。

(2) 方法回收率
取空白血浆300μL，精密加入“2.2.4”项下制备的不同浓度盐酸多西环素系列溶
液适量，配制成高(5μg/mL)、中(1.25μg/mL)、低(0.125μg/mL)3种不同浓度的盐酸多西环素血浆样品溶液，按“2.2.2”项下血浆样品处理方法操作，记录样品
峰与内标峰的面积As、Ai，以A=As/Ai代入回归方程计算盐酸多西环素的测定浓度，以测定浓度与配制浓度之比计算方法回收率。

结果，高、中、低3种浓度的
平均方法回收率分别为101.1%、100.9%和101.2%，RSD分别为1.43%、1.15%和1.47%，结果表明此方法的回收率良好，方法准确。

2.2.8 最低检测浓度考察
取空白血浆300μL，加入不同浓度的盐酸多西环素系列溶液适量，配制成不同浓
度的含药血浆样品溶液，按“2.2.2”项下血浆样品处理方法操作，测定各浓度样
品的峰高和噪音峰高(基线峰高)，取信噪比S/N(即样品与噪音峰高之比)为3，得
到最低检测浓度为75ng/mL。

2.3 盐酸多西环素动物体内药动学研究
6条健康成年beagle犬，给药前禁食12h。

口服给予盐酸多西环素缓释片1片，采血，分别于给药前及给药后的0.5、1、2、3、4、6、8、12、24和48h前肢
头静脉采血3mL，置肝素化试管中，3000r/min离心10min，分离血浆，置-20℃保存备用。

检测时自冰箱中取出冷冻的待测血浆样品，37℃水浴中完全解冻后按“2.2.2”项下血浆样品处理方法操作，记录样品峰与内标峰的面积As、Ai，以
A=As/Ai代入回归方程计算盐酸多西环素的血药浓度。

盐酸多西环素在犬体内的
药-时曲线见图3。

采用3P97药动学软件计算药动学参数，所得血药浓度数据分别按一、二、三室模型拟合，在权重为1、1/C、1/C2条件下判断房室模型，拟合优度以AIC值最小
作为判断标准，在房室模型判定的基础上计算药动学参数。

拟合结果显示，盐酸多西环素在犬体内均符合一室模型，所得药动学参数结果见表1。

表1 盐酸多西环素在比格犬体内的药动学参数(X(——)X±SD, n=6)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of doxycycline hydrochloride in beagles (means ± SD, n=6)
2.4 盐酸多西环素缓释片体内外相关性考察
根据3P97药动学软件拟合结果，在确定了模型和权重的基础上选用合适的方法计算体内吸收分数。

以体内吸收分数(fa)对其相应时间的体外累计释放百分率(ft)作线性回归，得到回归方程，判断两者是否具有相关性。

盐酸多西环素犬体内药动学特性符合一室模型。

因此可采用Wagner-Nelson法
计算其体内吸收分数，计算公式为：
按上述公式计算0～6h间相应时间点的累积吸收百分数fa，结果见表2。

表2 盐酸多西环素体内吸收分数(fa)与体外累计释放百分率(ft)Tab.2 fa(%) and ft (%) of doxycycline hydrochloride
以t时间点的fa为纵坐标，ft为横坐标，进行线性回归，得回归方程为：
fa=0.8586ft＋23.712(r=0.975，P<0.01)。

结果可见，盐酸多西环素缓释片体外释放与体内吸收的相关性良好。

3 讨论
本文参照有关文献[5]建立了比格犬血浆中盐酸多西环素HPLC的检测方法，结果犬血浆中药物的日内与日间精密度相对标准偏差小于10%，最低检测限为
75ng/mL，标准曲线的线性相关系数r=0.9982。

实验结果表明该方法简单快捷，专属性高，不受内源性物质的干扰，可用于批量检测血浆样品含量。

盐酸多西环素在生物药剂学分类系统中属于Ⅰ型药物(高溶解性，高通透性)，Ⅰ型药物具有体外溶出与体内吸收相关性良好的特性[6]。

本文中盐酸多西环素缓释片体外溶出度与体内生物利用度相关性良好，因此可以根据盐酸多西环素缓释片体外释放度结果来判断和预测药物在体内的吸收规律，提示体外释放度实验可以应用于盐酸多西环素缓释片处方的筛选与优化。

参考文献
[1]Psomas K C, Brun M, Causse A, et al.Efficacy of ceftriaxone and doxycycline in the treatment of early syphilis[J].Med Maladies Infect, 2012, 42(1): 15-19.
[2]Michael A.Lemp.Advances in Understanding and Managing Dry Eye Disease[J].Am J Ophthalmol, 2008,146(3): 350-356.
[3]Sahai A, Malik P.Dry eye prevalence and attributable risk factors in a hospital-based population[J].Indian J phthalmol,2005, 53 (2): 87-91. [4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].2010年版.北京: 化学工业出版社，2010: 附录87.
[5]Castro L J, Sahagún A M, Diez M J, et al.Pharmacokinetics of doxycycline in sheep after intravenous and oral administration[J].Veterinary Journal,
2009, 180: 389-395.
[6]Parvin Z M, Mohammad B J, Mandana A, et al.Biopharmaceutical classification of drugs using intrinsic dissolution rate (IDR) and rat intestinal permeability[J].Eur J Pharm Biopharm, 2009, 73: 102-106.。