桃红四物汤通过JAK2

网络出版时间：２０２３－０７－２５１１：５６：０４　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０７２４．１３４４．０５０
桃红四物汤通过ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路对肺纤维化模型大鼠凋亡及ＥＭＴ的影响
欧慧萍１，２
，吴趋荟１，袁　多２，林　辉２，何聪睿１，李　妲１，范伏元１
（１．湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙　４１０００７；２．湖南中医药高等专科学校，湖南株洲　４１２０１２）
收稿日期：２０２３－０３－１８，修回日期：２０２３－０６－１１
基金项目：湖南省自然科学基金资助项目（Ｎｏ２０２３ＪＪ６０２４３）；湖南省
教育厅科学研究项目（
Ｎｏ１９Ｃ１４４６）；湖南省中医药科研计划重点项目（Ｎｏ２０２１０３８）；湖南省教育厅青年项目（Ｎｏ２０Ｂ４４２）
作者简介：欧慧萍（
１９９０－），女，博士生，讲师，研究方向：中医药防治风湿呼吸系统疾病，Ｅ ｍａｉ１：３７３４５９３３２＠ｑｑ．ｃｏｍ；范伏元（１９６２－），男，教授，主任医师，研究方向：中医药防治呼吸系统疾病，通信作者，Ｅ ｍａｉ１：ｆｆｙ０２３＠１６３．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０１０５５
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０８－１５７７－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８９ ５；Ｒ３２９ ２５；Ｒ３４５ ５７；Ｒ５６３ １３
摘要：目的　探索桃红四物汤通过酪氨酸激酶２／信号传导与转录激活子３（Ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ２／ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３）信号通路对肺纤维化模型大鼠凋亡及ＥＭＴ的影响。

方法　将４０只ＳＤ大鼠随机分为正常组、模型组、甲泼尼龙组、桃红四物汤低浓度组、桃红四物汤高浓度组，每组８只，气管内滴入博来霉素（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ＢＬＭ）建立ＩＰＦ模型。

ＨＥ及Ｍａｓｓｏｎ染色观察肺组织形态学改变；ＥＬＩＳＡ检测大鼠血清ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １、ＴＮＦ α的含量；免疫组化和Ｗｅ
ｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定肺组织ＪＡＫ２、ｐ ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｐ ＳＴＡＴ３、Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、α ＳＭＡ蛋白的表达；ＲＴ ＰＣＲ检测肺组织ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｂｃｌ ２、Ｂａｘ基因表达。

结果　与正常组相比，模型组大鼠肺泡炎症和纤维化程度，血清中ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １的含量，肺组织ＪＡＫ２、ｐ ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｐ ＳＴＡＴ３、α ＳＭＡ蛋白表达，ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｂａｘ基因表达水平均升高，Ｂｃｌ ２基因及Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达水平均降低。

与模型组相比，桃红四物汤高浓度组大鼠肺组织肺泡炎症和纤维化程度，血清中ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １的含量，肺组织ＪＡＫ２、ｐ ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｐ ＳＴＡＴ３、α ＳＭＡ蛋白表达，ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｂａｘ基因表达水平均降低，Ｂｃｌ ２基因及Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达升高。

结论　桃红四物汤可能通过抑制Ｊ
ＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路，下调Ｂａｘ、α ＳＭＡ和上调Ｂｃｌ ２、Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达诱导肺纤维化模型大鼠凋亡及ＥＭＴ，从而发挥抗肺纤维化作用。

关键词：肺纤维化；博来霉素；桃红四物汤；ＪＡＫ２；ＳＴＡＴ３；凋亡；ＥＭＴ
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
特发性肺纤维化（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＩＰＦ）是一种原因不明的慢性、进行性、纤维化的肺间质性疾病，以气道重塑、炎症、肺泡破坏和纤维化为
特征［１］
，同时，也是ＣＯＶＩＤ １９重症患者的后遗症［
２］
，ＩＰＦ影响全世界约３００万人，发病率逐年上升，且随着年龄的增长而急剧增加，诊断后的中位生
存时间是２～４年［３］。

目前，ＩＰＦ常用治疗措施包括
药物治疗、姑息疗法、肺康复、肺移植等，但仍无法治愈，因此，急需寻找新的有效治疗方法。

许多中药被认为是有效的抗纤维化化合物，能改善肺功能，减轻呼吸困难。

研究发现，桃红四物汤具有抗纤维化作
用［４］，能改善肝纤维化、心肌纤维化，已被用于治疗
肝纤维化、心肌梗死后心肌纤维化、口腔黏膜下纤维性变，但其对肺纤维化的潜在作用尚不明确。

研究报道，ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３通路与肺纤维化有关，而间质性肺疾病中ＪＡＫ／ＳＴＡＴ的激活与ＦＭＴ、ＥＭＴ、衰老、自
噬、凋亡和增殖有关［２］。

因此，本研究通过探索桃
红四物汤通过ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路对肺纤维化模型大鼠凋亡及ＥＭＴ的影响，以探讨其治疗肺纤维化的潜在病理机制。

１　材料
１．１动物　ＳＰＦ级ＳＤ大鼠４０只，雌性，体质量（１３０～１５０）ｇ，购自湖南中医药大学ＳＰＦ级动物实验中心，实验动物生产许可证号ＳＣＸＫ（湘）２０１９ ０００４。

１．２　试剂与药物　Ｚｅｏｃｉｎ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司，Ｚ８０２０），甲泼尼龙片（天津天药药业股份有限公司，ＪＰ２００１０８ａ），桃红四物汤（华润三九医药股份有限公司，湖南中医药大学第一附属医院三九颗粒药房），水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，Ｑ／１２ＨＢ４２１８ ２０１７），４％多聚甲醛（Ｂｉｏｓｈａｒｐ公司，２２７５），通用二步法试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，ＰＶ ９０００），ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ
１（上海·７
７５１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２３Ａｕｇ；３９（８）：１５７７～８３
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酶联生物科技有限公司，ＣＫ Ｅ３１０６３、ＣＫ Ｅ３５２８７、ＣＫ Ｅ３１０７３），ＲＩＰＡ裂解液（上海碧云天，Ｐ００１３Ｂ），ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒（康为世纪，ＣＷ００１４Ｓ），一抗Ｐ ＪＡＫ２（ＣＳＴ公司，３７７６Ｓ）、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｐ ＳＴＡＴ３（ａｂｃｌｏｎａｌ公司，Ａ１９６２９、Ａ１９５６６、ＡＰ０７１５）、Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、α ＳＭＡ（ｂｉｏｓｓ公司，ＢＳ １５１９Ｒ、ＢＳ １０１９６Ｒ）、ＧＡＰＤＨ（Ｉｍｍｕｎｏｗａｙ公司／武汉三鹰，ＹＭ３０２９／１０４９４ １ ＡＰ），二抗ＨＲＰｇｏａｔａｎｔｉ ｒａｂｂｉ／ｍｏｕｓｅＩｇＧ（美国ｐｒｏ ｔｅｉｎｔｅｃｈ公司，ＳＡ００００１ ２、ＳＡ００００１ １）；ＲＮＡ提取液（ａｍｂｉｏｎ公司，１５５９６ ０２６），ＰＣＲ引物ＧＡＰＤＨ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ ２（上海生工生物工程有限公司合成，ＮＭ＿０１７００８ ４、ＮＭ＿０３１５１４ １、ＮＭ＿０１２７４７ ２、ＮＭ＿０１７０５９ ２、ＮＭ＿０１６９９３ １），Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ ＲＴＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ、２×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ｎｏｎｅＲＯＸ）（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ公司，Ｇ３３３０、Ｇ３３２０）。

１．３　仪器　研究级生物显微镜、数码医学图像分析系统（Ｍｏｔｉｃ，ＢＡ４１０、ＭｏｔｉｃＭｅｄ６ ０）生物组织摊片机（金迪，ＹＤ Ａ），轮转石蜡切片机（徕卡，ＲＭ２２３５），生物样品均质仪（中国杭州奥盛，Ｂｉｏ Ｐｒｅｐ ２４），电泳槽、电泳仪、转膜仪（中国北京六一，ＤＹＣＺ ２４ＤＮ、ＤＹＹ ６Ｃ、ＤＹＣＺ ４０Ｄ），化学发光成像系统（广州勤翔台式，Ｃｈｅｍｉｓｃｏｐｅ６１００），高速冷冻型微量离心机（ＤｒａｇｏｎＬａｂ，Ｄ３０２４Ｒ），超微量分光光度计（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００），荧光定量ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ ｒａｄ，ＣＦＸ）。

２　方法
２．１　药物制备　甲泼尼龙片用蒸馏水配成药物浓度０ ４ｇ·Ｌ－１；当归、熟地、川芎、白芍、桃仁各１０ｇ，红花６ｇ用蒸馏水配成药物浓度０ ５ｋｇ·Ｌ－１、１ｋｇ·Ｌ－１。

２．２　分组及造模　将ＳＰＦ级ＳＤ大鼠随机分为５组，即Ａ：正常组，Ｂ：模型组，Ｃ：甲泼尼龙组，Ｄ：桃红四物汤低浓度组，Ｅ：桃红四物汤高浓度组，每组８只。

除正常组外，其余各组大鼠气管内滴入ＢＬＭ诱导肺纤维化造模。

大鼠腹腔注射１０％水合氯醛（３ ５ｍＬ·ｋｇ－１）麻醉后仰卧固定在鼠板上，无菌操作下颈中作０ ５～１ｃｍ纵形切口，用镊子逐层剥离各组织暴露气管，用１ｍＬ注射器刺入气管，以５ｍｇ·ｋｇ－１［５］气管内快速推注博来霉素灭菌水溶液０ ５ｍＬ，立即拔出针头，保持大鼠直立体位旋转０ ５～１ｍｉｎ，使药均匀到达两侧肺部，缝合皮肤，麻醉苏醒后置笼内常规饲养。

２．３　给药治疗　造模后ｄ２给予药物治疗，给药剂量以７０ｋｇ人体体表面积计算。

桃红四物汤低浓度组予以２ ５ｇ·ｋｇ－１、高浓度组予以５ｇ·ｋｇ－１、甲泼尼龙组给予１ ８ｍｇ·ｋｇ－１剂量灌胃，而正常组和模型组给予等容积蒸馏水灌胃，每天１次，连续２８ｄ。

２．４　标本采集　给药结束后１ｄ，配制３％戊巴比妥钠（４５ｍｇ·ｋｇ－１）腹腔注射麻醉后，每组大鼠腹主动脉取血后处死大鼠并迅速分离双肺，取左肺下叶用４％多聚甲醛固定，以备组织病理学及免疫组化检测；取右肺下叶－８０℃冰箱冻存，用于Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＲＴ ＰＣＲ检测。

２．５　肺组织形态学改变　取４％多聚甲醛固定左肺进行石蜡包埋，切片行常规ＨＥ及Ｍａｓｓｏｎ染色，显微镜下观察肺泡炎、肺组织纤维化程度，并参照Ｓｚａｐｉｅｌ［６］的分级标准对大鼠肺泡炎程度、肺纤维化程度进行评判。

２．６　ＥＬＩＳＡ检测大鼠血清ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １的含量　ＥＬＩＳＡ法测定大鼠血清ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １的含量。

按说明书加样加酶后封板温育６０ｍｉｎ，配液洗涤后加显色剂１５ｍｉｎ避光显色，再加终止液立刻放入酶标仪中以波长４５０ｎｍ依次测量各孔Ａ值。

２．７　免疫组化检测肺组织ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路相关蛋白表达　石蜡切片脱蜡和水化，经抗原修复及阻断内源性过氧化氢酶后分别滴加一抗ｐ ＪＡＫ２、ｐ ＳＴＡＴ３、反应增强液、二抗后ＡＥＣ显色，随后复染，脱水、透明、封片，最后显微镜下阅片后，数码医学图像分析系统采集阳性目标平均光密度进行分析。

２．８　ＲＴ ＰＣＲ检测肺组织ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路及Ｂａｘ、Ｂｃｌ ２ｍＲＮＡ表达　用ＴＲＩｚｏｌ法抽提大鼠肺组织总ＲＮＡ，检测ＲＮＡ浓度及纯度，逆转录合成ｃＤＮＡ并以其为模板，进行ｑＰＣＲ反应。

反应条件：９５℃，１０ｍｉｎ，预变性；９５℃，１５ｓ变性，６０℃退火３０ｓ，循环４０次。

以ＧＡＰＤＨ为内参，用２－ΔΔＴ计算ｍＲＮＡ相对表达量。

引物序列见Ｔａｂ１。

２．９　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测肺组织ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路及Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、α ＳＭＡ蛋白表达　取０ １ｇ肺组织加入含１％ＰＭＳＦ、蛋白磷酸酶抑制剂混合物的ＲＩＰＡ裂解液冰上裂解１０ｍｉｎ，４℃条件下１４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ后取上清，ＢＡＣ法测定蛋白浓度。

每组取５０～１００μｇ总蛋白，８％～１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ分离蛋白，运用电转移法将蛋白转移至ＰＶＤＦ膜，含５％脱脂牛奶／牛血清白蛋白的ＴＢＳＴ／ＰＢＳ封闭６０ｍｉｎ洗膜后加入一抗ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｐ ＪＡＫ２、ｐ ＳＴＡＴ３、Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、α ＳＭＡ，４℃孵育过夜，洗膜后孵育二抗１ｈ，洗膜后显影并分析灰度值。

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·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２３Ａｕｇ；３９（８）
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Ｔａｂ１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｒｉｍｅｒｓ
ＧｅｎｅＳｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ（５′→３
′）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）Ｐｒｏｄｕｃｔｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
ＪＡＫ２ＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧ１０３ＳＴＡＴ３ＣＡＧＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴ２１５ＢａｘＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＧＣＡ１５８Ｂｃｌ ２ＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＴＴＡＴ１５１ＧＡＰＤＨ
ＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ
ＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＴ
１３
８
Ｆｉｇ１　Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙｔｉｓｓｕｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（ＨＥ，×４００
）
Ｆｉｇ２　Ｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙｔｉｓｓｕｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（Ｍａｓｓｏｎ，×４００）
２．１０　统计学分析　通过ＳＰＳＳ２６ ０软件进行处
理，以珋ｘ±ｓ表示，多组间比较用单因素方差分析（Ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ），两组间比较用ｔ检验。

３　结果
３．１　肺组织形态学改变　正常组大鼠肺泡结构正常，无明显炎细胞渗出，未见明显蓝色胶原纤维沉积；模型组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡壁增厚，肺泡间隔增宽，可见大量炎性细胞渗出，明显蓝色胶原纤维沉积，纤维灶形成，提示，肺纤维化大鼠模型构建成功；桃红四物汤低浓度组大鼠肺泡结构破坏较多，肺泡间隔中度增厚、较多成纤维细胞增生，炎性细胞渗出稍多，较多蓝色胶原沉积。

甲泼尼龙组与桃红四物汤高浓度组大鼠肺组织结构破坏较少，肺泡间隔稍增宽，少量炎症细胞渗出，胶原纤维较模型组明显减少。

见Ｆ
ｉｇ１，２。

３．２　肺泡炎和肺纤维化程度变化　与正常组相比，模型组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度均较高（Ｐ＜０ ０１）；与模型组相比，甲泼尼龙组、桃红四物汤高浓度组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度均有下降趋势（Ｐ＜０ ０５）。

甲泼尼龙组与桃红四物汤高浓度组相比无统计学意义（
Ｐ＞０ ０５）。

见Ｆｉｇ３。

３．３　ＥＬＩＳＡ检测大鼠血清ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １的水平变化　与正常组相比，模型组、甲泼尼龙组、桃红四物汤低浓度组、
桃红四物汤高浓度组大鼠
Ｆｉｇ３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｌｖｅｏｌｉｔｉｓａｎｄｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．
血清ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １水平明显升高（Ｐ＜０ ０１）；与模型组相比，甲泼尼龙组、桃红四物汤高浓度组ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、ＴＧＦβ １差异有显著性（Ｐ＜０ ０１）；甲泼尼龙组与桃红四物汤高浓度组相比无统计学意义（Ｐ＞０ ０５）。

见Ｆｉｇ４。

３．４　免疫组化检测肺组织ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路蛋白结果　免疫组化结果显示，
与正常组比较，模型组大鼠肺组织中ｐ ＪＡＫ２、ｐ ＳＴＡＴ３蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（Ｐ＜０ ０１）；与模型组比较，桃红四物汤低浓度组ｐ ＪＡＫ２蛋白表达明显降低
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Ｆｉｇ４　ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｅｒｕｍＴＮＦ α，ＭＭＰ ７ａｎｄＴＧＦβ
１ｌｅｖｅｌｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８） Ｐ＜０ ０５ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０ ０５ｖｓＭｏｄｅｌｇｒｏｕｐ
．
Ｆｉｇ５　Ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ ＪＡＫ２ｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（×４００
）
Ｆｉｇ６　Ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ ＳＴＡＴ３ｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（×４００）
（Ｐ＜０ ０５），甲泼尼龙组及桃红四物汤高浓度组ｐ ＪＡＫ２、ｐ ＳＴＡＴ３蛋白表达明显降低（Ｐ＜０ ０１）；甲泼尼龙组与桃红四物汤高浓度组相比无统计学意义（Ｐ＞０ ０５）。

见Ｆｉｇ５－７。

Ｆｉｇ７　Ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ ＪＡＫ２，ｐ ＳＴＡＴ３
ｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．
３．５　肺组织ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路及Ｂａｘ、Ｂｃｌ ２ｍＲＮＡ表达　与正常组比较，模型组大鼠ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ＢａｘｍＲＮＡ明显升高（Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０ ０１，Ｐ＜０ ０１），Ｂｃｌ ２ｍＲＮＡ明显降低（Ｐ＜０ ０１）；与模型组比较，甲泼尼龙组、桃红四物汤高浓度组大鼠
ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ＢａｘｍＲＮＡ明显降低（Ｐ＜０ ０１），Ｂｃｌ ２ｍＲＮＡ明显升高（Ｐ＜０ ０１）。

甲泼尼龙组与桃红四物汤高浓度组相比无统计学意义（Ｐ＞０ ０５）。

见Ｆｉｇ８。

３．６　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测肺组织ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号通路蛋白结果　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果示，与正常组比较，模型组大鼠肺组织中ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｐ ＪＡＫ２、ｐ ＳＴＡＴ３蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（Ｐ＜０ ０１）；与模型组比较，甲泼尼龙组及桃红四物汤高浓度组ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｐ ＪＡＫ２、ｐ ＳＴＡＴ３蛋白表达明显降低（
Ｐ＜０ ０１）；甲泼尼龙组与桃红四物汤高浓度组相比无统计学意义（Ｐ＞０ ０５）。

见Ｆｉｇ９。

３．７　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测肺组织Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、α ＳＭＡ蛋白结果　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果示，与正常组比较，模型组大鼠肺组织中α ＳＭＡ蛋白表达明显升高，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义（Ｐ＜０ ０１）；与模型组比较，甲泼尼龙组及桃红四物汤高浓度组α
ＳＭＡ蛋白表达明显降低，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达明显升高（Ｐ＜０ ０１）；甲泼尼龙组与桃红四物汤高浓度组相比无统计学意义（Ｐ＞０ ０５）。

见Ｆｉｇ１０。

·０
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Ｆｉｇ８　ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３，ＢａｘａｎｄＢｃｌ ２
ｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．
Ｆｉｇ９　ＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３，ｐ ＪＡＫ２，
ｐ ＳＴＡＴ３ｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＭｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．
４　讨论
ＩＰＦ属于中医学“肺痿”、“肺痹”等范畴，其主要症状为胸闷、干咳、喘息，中医认为ＩＰＦ病因病机初期多为痰瘀互结，后期以虚痰瘀痹阻为主。

正如《血证论·咳嗽》言：“痰血作咳，其证咳逆倚息，而不能卧，与水饮冲肺之证相似，盖人身气道不可有塞滞，内有瘀血，则阻碍气道，不得升降，是以壅而为
激酶（Ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅｓ，ＪＡＫｓ）是一组细胞内酪氨酸激酶，调节多种细胞生理过程，包括代谢、生长、分化、ＥＭＴ和凋亡。

近来研究发现［１３］，ＩＰＦ患者肺成纤维细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞中激活的ＪＡＫ２和ＳＴＡＴ３水平升高。

Ｌｉ等［５］研究发现，肺复康通过氧化磷酸化、凋亡、炎症以及自噬、细胞粘附分子、细胞外基质－受体相互作用在调节抗肺纤维化中发挥重要作用，这些作用受ＪＡＫ ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ Ａｋｔ、ＴＧＦ β等信号通路调控。

李建文等［１４］研究发现，桃红四物汤可促进Ｂｃｌ ２的表达，抑制Ｂａｘ的表达，有效地抑制心肌细胞坏死及凋亡，减轻心肌细胞损伤，保护缺血心肌作用。

而成纤维细胞中Ｂｃｌ ２和Ｂａｘ蛋白的水平都是依赖ＳＴＡＴ３，抑制ＳＴＡＴ３信号可以阻断这种对凋亡的抵抗［１５］。

本研究表明，桃红四物汤可随浓度的增加，抑制ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｐ ＪＡＫ２、ｐ ＳＴＡＴ３蛋白表达，下调ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３、ｂａｘ基因的异常表达，上调Ｂｃｌ ２基因的异常表达，从而减轻肺泡炎症和肺纤维化的严重程度，抑制肺组织细胞的凋亡，阻滞肺纤维细胞的生长，发挥其抗纤维化作用。

ＥＭＴ在肺纤维化的发病机制中发挥重要作用。

ＥＭＴ可被细胞外的多种配体如转化生长因子 β（ＴＧＦ β）、表皮生长因子（ＥＧＦ）、成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）、白细胞介素 １（ＩＬ １）、ＴＮＦ α、ＭＭＰ ７、结缔组织生长因子（ＣＴＧＦ）、胰岛素样生长因子 ２（ＩＧＦ２）、ＮＦ κＢ和Ｗｎｔ等激活，调节Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ ｃａｄｈｅｒｉｎ、波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、α ＳＭＡ的表达。

金银花石油醚部位可上调ＴＧＦ β１诱导后Ａ５４９细胞和小鼠肺组织中Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ表达，下调ＣｏｌⅠ、α ＳＭＡ、ＶｉｍｅｎｔｉｎｍＲＮＡ表达［１６］。

ＴＮＦ α可下调Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ与β ｃａｔｅｎｉｎ，上调Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｔｗｉｓｔ及Ｎ ｃａｄｈｅｒｉｎ促进肝癌细胞株Ｈｅｐ３Ｂ及ＳＭＭＣ ７７２１发生ＥＭＴ［１７］。

白藜芦醇通过抑制ＭＭＰ ７表达，上调ＥＭＴ来减轻肾损伤和纤维化［１８］。

本研究证实，桃红四物汤可降低ＭＭＰ ７、ＴＧＦ β１及ＴＮＦ α的水平，下调α ＳＭＡ蛋白的表达，上调Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白的表达，从而减轻肺泡炎反应，抑制肺组织细胞的上皮－间质转化，防治肺纤维化。

综上所述，桃红四物汤可能通过阻断肺中ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３信号传导降低肺内炎性细胞的积累，抑制平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，减少胶原蛋白的合成，抑制肺组织的凋亡和上皮间质转化，最终抑制肺纤维化的发生。

因此，抑制ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３，从而抑制ＩＰＦ可能是治疗这种肺纤维化的策略。

本研究仅初步探讨了桃红四物汤防治ＩＰＦ的作用及可能的机制，具体的调节机制需进一步深入研究探索。

参考文献：
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２．ＨｕｎａｎＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＣｏｌｌｅｇｅ，Ｚｈｕｚｈｏｕ，Ｈｕｎａｎ　４１２０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ　ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＴａｏｈｏｎｇＳｉｗｕＤｅｃｏｃｔｉｏｎｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＥＭＴｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓｍｏｄｅｌｒａｔｓｂｙＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ＦｏｒｔｙＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅｇｒｏｕｐ，ＴａｏｈｏｎｇＳｉｗｕＤｅｃｏｃｔｉｏｎｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｉｔｈｅｉｇｈｔｃａｓｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｂｌｅｏｍｙｃｉｎｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｉｎ ｄｕｃｅＩＰＦｒａｔｍｏｄｅｌｓ．ＨＥａｎｄＭａｓｓｏｎｓｔａｉｎｉｎｇｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．ＥＬＩＳＡｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＴＮＦ α，ＭＭＰ ７ａｎｄＴＧＦβ １ｉｎｓｅｒｕｍｏｆｒａｔｓ．ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅａｐ ｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪＡＫ２，ｐ ＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３，ｐ ＳＴＡＴ３，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ，α ＳＭＡｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓ．ＲＴ ＰＣＲｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３，Ｂｃｌ２ａｎｄＢａｘｇｅｎｅｓｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆａｌｖｅｏｌａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓｄｅｇｒｅｅ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＴＮＦ α，ＭＭＰ ７ａｎｄＴＧＦβ １ｉｎｓｅｒｕｍ，ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＪＡＫ２，ｐ ＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３，ｐ ＳＴＡＴ３，α ＳＭＡｐｒｏｔｅｉｎｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３，Ｂａｘｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃｌ ２ｇｅｎｅａｎｄＥ ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆａｌｖｅｏｌａｒｉｎ ｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＴＮＦ α，ＭＭＰ ７ａｎｄＴＧＦβ １ｉｎｓｅｒｕｍ，ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＪＡＫ２，ｐ ＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３，ｐ ＳＴＡＴ３，α ＳＭＡｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＪＡＫ２，ＳＴＡＴ３ａｎｄＢａｘｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｒｅｄｕｃｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃｌ ２ｇｅｎｅａｎｄＥ ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎｗｅｒｅｅｌｅｖａｔｅｄｉｎＴａｏｈｏｎｇＳｉｗｕＤｅｃｏｃｔｉｏｎｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ＴａｏｈｏｎｇＳｉｗｕＤｅ ｃｏｃｔｉｏｎｍａｙｒｅｇｕｌａｔｅＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ，ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅＢａｘ，α ＳＭＡａｎｄｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅＢｃｌ ２，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｏｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＥＭＴｉｎｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｔｈｕｓｐｌａｙｉｎｇａｎａｎｔｉ ｐｕｌ ｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓｒｏｌｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓ；ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ；ＴａｏｈｏｎｇＳｉｗｕＤｅｃｏｃｔｉｏｎ；ＪＡＫ２；ＳＴＡＴ３；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ＥＭＴ
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