酶水解法提高大豆蛋白水解度的研究

酶水解法提高大豆蛋白水解度的研究
胥彩云;童军茂;周晓宏
【摘要】用蛋白酶水解方法提高大豆分离蛋白水解度.通过对多种蛋白酶的对比分析可知,风味蛋白酶的水解效果好于其它蛋白酶,但正交试验结果表明,即使在优化条件下水解,单一的风味蛋白酶水解所得大豆分离蛋白水解度最高只达到43.12%.若先用胃蛋白酶水解再用风味蛋白酶水解则水解度最高可达68.81%,而风味蛋白酶与其它酶的联合应用效果略差;若先使用风味蛋白酶后使用胃酶则水解度只有47.89%.表明不同酶对大豆蛋白分子具有不同的水解特点.
【期刊名称】《食品与机械》
【年(卷),期】2010(026)001
【总页数】3页(P9-11)
【关键词】酶水解;大豆分离蛋白;胃蛋白酶;风味蛋白酶
【作者】胥彩云;童军茂;周晓宏
【作者单位】石河子大学食品学院,新疆,石河子,832000;石河子大学食品学院,新疆,石河子,832000;北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081
【正文语种】中文
大豆分离蛋白中必需氨基酸含量在植物蛋白中较为合理，营养价值较高，但大豆蛋白质组成却极为复杂，是非均一蛋白质。

按溶解特性分类，大豆蛋白质的90%是球蛋白［1］，且80%的蛋白质分子质量在10万以上，大多数分子内部呈反行B-helix非有序结构，分子高度压缩、折叠。

大豆球蛋白的三、四级结构（特别是二
硫键使其亚基牢固结合，高度结构化［2］），大大降低了人体对大豆蛋白质的消化吸收。

目前，解决的主要方法就是通过酶解的生物技术手段改善其功能特性，提高其营养价值。

蛋白质在酶水解作用下，可产生具有一定的功能性质的肽段，而这些多肽分子量相对较小，且酶解解离过程中通常伴有重要结构的重排，导致一些原来包埋在蛋白质分子内部的疏水区暴露出来［3］。

本试验利用单一蛋白酶和复合蛋白酶对提高大豆蛋白水解度的反应条件进行研究，为大豆蛋白水解液用于食品工业的营养基料、调味基料和功能基料的生产，提高其附加值提供理论依据。

1．1 材料
大豆分离蛋白：吉林不二蛋白制品有限公司，经测定其蛋白质质量分数为91．05%，水分质量分数5．78%，其它质量分数3．17%；
Alcalase碱性蛋白酶（液态）、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶：诺维信公司；
胃蛋白酶、木瓜蛋白酶：宁夏庞博生物科技有限公司。

1．2 仪器
微量凯氏定氮仪：泰县白米玻璃仪器厂；
精密p H计：p HS-3C型，上海雷磁仪器厂；
离心机：LD4-2型，北京医用离心机厂；
电热恒温水浴锅：江苏南通竹行电热恒温四厂；
恒温干燥箱：上海市跃进医疗器械一厂；
恒温磁力搅拌器：85-2型，江苏中大仪器厂。

1．3 方法
1．3．1 大豆蛋白预处理据资料［4］介绍，浓度为5%～8%的大豆蛋白溶液在85～90℃度下加热处理10 min左右，可使大豆蛋白致密的立体结构变得松散，有利于提高大豆蛋白的酶解速率，但随着底物浓度的增加和加热时间的延长，蛋白
分子会通过疏水作用和二硫键作用形成网状聚合体，反而会降低蛋白酶解速率。

结合本试验设计方案，各浓度大豆蛋白溶液在85℃温度下恒温水浴15 min，效果较好。

1．3．2 蛋白酶的反应方法
（1）单酶反应方法：依据各酶制剂生产厂家提供的反应条件，以各酶制剂水解出游离氨基酸的能力为指标，通过酶反应进程确定效果最好的酶。

酶最适水解条件的确定采用正交试验法。

将大豆分离蛋白分散在一定体积的蒸馏水中，在85℃加热15 min使蛋白质变性，冷却至该酶反应所需温度，加入酶反应器中，恒温搅拌一定时间，以NaOH或HCl溶液调节至该酶所需p H值，加入酶制剂后立即计时，并滴加0．5 mol／L
的NaOH维持反应液p H的稳定。

按规定间隔时间取反应液5 m L，沸水浴灭酶
5 min后，在4 000 r／min的条件下离心10 min，取适量上清液，供分析用。

（2）双酶反应方法：在单一酶反应基础上选择水解效果较好的一种酶制剂先行水解，反应液灭酶后再选择另外一种蛋白酶水解。

通过最后反应液的水解度评价该方法的水解效果。

1．3．3 分析方法
蛋白质含量的测定：凯氏定氮法［5］。

水解度（DH）的测定：甲醛法（参照GB 5009．39——85）。

2．1 各种酶水解反应进程
本试验首先研究多种蛋白酶水解大豆分离蛋白的反应进程，以选择最终使用的酶制剂种类。

在各酶最适条件下（表1），分别于反应0．5，1，1．5，2，2．5，3，3．5，4 h测定反应液水解度，以此所绘制的各酶反应进程曲线如图1所示。

由图1可知，单酶水解反应中，风味蛋白酶水解大豆分离蛋白的能力明显高于其
他蛋白酶，并且在反应的起始阶段，风味蛋白酶水解速度最快。

因此，本试验以风
味蛋白酶作为提高大豆分离蛋白水解度的主要酶制剂。

2．2 正交试验设计优化风味蛋白酶水解条件
由于在水解过程中，几个单因素之间会相互依赖和影响，为了优化风味蛋白酶水解条件，进行预试验，考查了底物浓度（［S］）、反应温度、p H值、反应时间和加酶量（E／S）等单因素对大豆分离蛋白水解效果的影响，在预试验基础上，设计5因素4水平L16（45）的正交试验（表2）。

由表3可知，对大豆分离蛋白水解度影响最大的因素是反应温度，其次是酶添加量、反应时间、溶液p H值和底物浓度。

影响水解反应的主次关系为：反应温度大于酶添加量＞反应时间＞p H＞底物浓度。

最优反应组合为A3B2C2D3E3，由于此组合在正交表并未列入，故按此条件进行试验，得到溶解度为43．12%，高于正交表中的试验值。

2．3 双酶水解
为了进一步提高大豆分离蛋白的水解度，根据内切蛋白酶与外切蛋白酶作用位点的差异，采用双酶方法进行水解，即先用风味蛋白酶在上述优化条件下水解后，经灭酶处理，再加入另一种酶进行水解；或者先用其它蛋白酶水解后再用风味蛋白酶水解，结果如表4、5所示。

由表4、5可知，双酶组合较之单酶水解可以显著提高大豆分离蛋白的水解度，其中以先用胃蛋白酶后用风味蛋白酶的水解效果最好，水解度可达68．81%。

相比之下，先用其它酶后用风味蛋白酶水解的效果略差，但仍高于单一碱性蛋白酶的应用效果，这可能是各种酶有自己的水解位点和特点所致。

大豆蛋白组成结构复杂，分子高度压缩、折叠，其水解度较差，影响了它在食品生产中的应用。

试验通过对多种蛋白酶的对比分析可知，风味蛋白酶水解改善大豆蛋白水解性的效果好于其它蛋白酶，但单一的风味酶制剂即使在优化条件下水解大豆分离蛋白也难以达到理想效果，而风味蛋白酶与胃蛋白酶联合使用的效果则提高很
大（蛋白溶解度最高可达68．81%），且同样是风味蛋白酶和胃蛋白酶，加入顺序不同时水解效果也有差异。

本试验对各大豆蛋白水解液的苦味值做详细的研究，但不同的蛋白酶水解大豆蛋白的水解液在苦味值上也有很大的差异，要使大豆蛋白水解液能在食品工业的营养基料、调味基料和功能基料的生产中得到更好的利用，对其苦味的研究也很重要。

【相关文献】
1 孙寰．大豆蛋白质和氨基酸［M］．吉林：吉林科学技术出版社，1989，384～390．
2 阎隆飞．蛋白质的结构与功能［M］．湖南：湖南科技出版社，1988，52～56．
3 陶红丽，朱志伟，江津津．大豆多肽生理活性研究进展［J］．食品与机械，2007，23（6）：133～135．
4 李书国，陈辉，庄玉亭，等．复合酶法制备活性大豆寡肽研究［J］．粮食与油脂，2001（3）5～7．
5 北京师范大学生物系生物化学教研室．基础生物化学实验［M］．北京：高等教育出版社，1982，121～123．。