脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序

脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
一、试剂准备
（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：
试剂名称浓度商品信息
1.极限必须培养基
(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L
(SH30021.01B, Hyclone)
2.胎牛血清
（Fetal Bovine Serum，FBS）10%
(ES-009-B, Millipore)
3.青霉素/链霉素
（Penicillin/Streptomycin）1%
（TMS-AB2C, CHEMICON）
4.地塞米松
(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46
(D4902-25MG, Sigma)
5.胰岛素
(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808
(91077C—1g, Sigma)
6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24
( I5879-100MG, Sigma)
7.吲哚美辛
(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79
(I7378—5G, Sigma)
（二）成脂分化诱导液浓储液配制
试剂名称质量浓缩倍数配制方法
1.Stock A
胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃
2.Stock B
青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃
3.Stock C
地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300
保存：-20℃
4.Stock D
胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100
保存：4℃
5.Stock E
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃
6.Stock F
吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100
保存：-20℃
（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）
1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;
2.加1管Stock A（1ml）；
3.加1管Stock B（0.1ml）；
4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；
5.加1管Stock E（0.05ml）；
6.加1管Stock F（0.02ml）；
7.加1管Stock D（0.1ml）；
8.测渗透压，调pH7.2-7.4;
9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。

（四）Stromal Medium配制（10ml）【２】：
1.取DMEM8.9ml加入15ml离心管（BD）;
2.加入1管Stock A（1ml）；
3.加入1管Stock B（0.1ml）；
4.调pH7.2-7.4;
5.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。

（五）0.5%油红“O”配制【３】
油红“O”0.5 g溶于100ml 无水乙醇（50%），分装备用，使用前0.22μm过滤
二、方法
（一）细胞诱导培养【4】
1.间充质干细胞传代培养至第三代，待细胞融合至80%左右，从培养箱内取出细胞至垂
直超净台；
2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
3.1ml微量移液器吸弃培养液；
4.加入预温PBS，1ml/孔；
5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
6.吸弃PBS；
7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；
8.加入Trypsin/EDTA消化液，1ml/孔，5min，37℃；
9.加入等量Stromal Medium，终止消化；
10.1ml微量移液器彻底吹洗皿底，收集细胞悬液至15ml离心管内；
11.1400rpm,RT,5min;
12.小心取出离心管，吸弃上清；
13.加入Stromal Medium重悬消化下来的细胞；
14.按1× 104个/ml接种到24孔板内（此时若解冻细胞，按冻存密度5*105个/ml计算，可
铺6孔板10个孔，12孔板25个孔，24孔板50个孔），加入Stromal Medium培养基培养3天，设置对照组（一直使用Stromal Medium培养），空白组（添加DMEM 覆盖皿底即可）；
15.3天后，实验组吸弃原有培养基，换用成脂诱导培养基（AM）；
16.每2-3天换液一次；
17.诱导2周后，初始脂肪形成时用油红“O”染色进行评估。

（二）油红“O”染色：
1.从培养箱内取出细胞至普通实验台；
2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
3.1ml微量移液器吸弃培养液；
4.加入预温PBS，1ml/孔，；
5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
6.吸弃PBS；
7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；
8.加入4%多聚甲醛液（覆盖所有细胞即可）固定1h，室温(或4℃过夜)，蒸馏水洗涤3
次；
9.用0.5%的油红“O”染色1h（覆盖所有细胞即可），室温；
10.放入70%的乙醇中分化至间质清晰，然后再用蒸馏水洗涤3次；
11.苏木素染液复染（覆盖所有细胞即可），1-2min，蒸馏水洗涤3次【5】；
12.染色的细胞可以用肉眼在相差显微镜下进行观察确认（为避免皿内干燥影响观察，可留
少许液体，且观察时间不宜超过15min或用甘油封盖后可长时间保存）。

三、结果
脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。

小鼠脂肪组织来源的脂肪干细胞（经成脂诱导2周后）
脂肪细胞油红O染色（X200）【6】
【1】【5】Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz
HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for Cell-Based therapies, Tissue Eng. 2001,7(2):211–228.
【２】【4】Yu G, Wu X, Kilroy G, Halvorsen YD, Gimble JM, Floyd ZE.
Isolation of murine adipose-derived stem cells. Methods Mol Biol. 2011;702:29-36.
【３】田玉旺，李琳，李丽，胡海. 介绍一种改良的油红O脂肪染色法，中国组织化学与细胞化学杂志，2007,16(6).
【6】Lu F, Gao JH, Ogawa R, Mizuro H, Hykusoku H.Adipose tissues differentiated by
adipose-derived stem cells harvested from transgenic mice. Chin J Traumatol. 2006 Dec;9(6):359-64.。