WT1基因在骨髓增生异常综合征患者外同血中的表达及临床意义

WT1基因在骨髓增生异常综合征患者外同血中的表达及临床
意义
聂泽强;李晓云;马爻芳;方敏;鲍杰
【摘要】目的:探讨WT1基因在骨髓增生异常综合征(MDS)患者中的表达情况及WT1基因与MDS发病及病情进展的关系.方法:采用逆转录-聚合酶链反应检测48例MDS患者,4例MDS-AL患者和10例正常人外周血中WT1基因的表达,并进行分析.结果:①4例MDS-AL患者的WT1阳性率100％,10例正常人的WT1阳性率0％,48例MDS患者WT1阳性率为27.1％.MDS组、MDS-AL组、对照组两两相比有统计学差异(P<0.05).② 将MDS按IPSS分组,WT1mRNA的表达水平在高危与中危及低危组之间差异均有统计学意义(P<0.05),中危与低危组、中危Ⅰ组与中危Ⅱ组之间无统计学差异(P>0.05).WT1基因表达水平与IPSS评分值有相关性(r=0.74,P<0.05).③WT1基因表达水平与原始细胞百分数密切相关
(r=0.66,P<0.05).④动态随访2例MDS患者,随着疾病进展,WT1的表达水平逐渐升高.结论:WT1基因在各类型MDS均高表达.WT1基因的表达与疾病的进展呈正相关,WT1基因表达情况与原始细胞百分比及IPSS评分均有明显相关性.其可作为临床上对M DS病情的高危评估,预测病情变化和动态监测治疗效果及判断预后的重要指标之一.
【期刊名称】《陕西医学杂志》
【年(卷),期】2019(048)008
【总页数】4页(P977-980)
【关键词】骨髓增生异常综合征;急性白血病;国际预后评分系统;WT1基因;逆转录-聚合酶链反应;相关性
【作者】聂泽强;李晓云;马爻芳;方敏;鲍杰
【作者单位】山西省运城市中心医院血液科运城044000;山西省运城市中心医院血液科运城044000;山西省运城市中心医院血液科运城044000;山西省运城市中心医院血液科运城044000;山西省运城市中心医院血液科运城044000
【正文语种】中文
【中图分类】R551.3
骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome, MDS)是一种造血干细胞恶性髓系克隆性疾病，且高风险向急性白血病转换[1]。

MDS向白血病演变是一个多因素作用的多步骤、多阶段的过程。

WT1基因(Wilms tumor type 1, WT1)最早是从Wilms’瘤患者染色体11q13位点分离出来的一种抑癌基因[2]。

WT1基因在正常造血系统、细胞分化及增殖过程中起着重要的作用，特别是近年来发现它在恶性血液病中有异常高表达，有类癌基因样活性，并认为其在造血细胞的生长和分化过程中发挥重要作用[3-4]。

目前已证实WT1基因在急性白血病中均高表达，可以作为白血病的一个泛白血病标志[5-6]，MDS作为急性白血病(Acute leukemia, AL)前期，其与WT1的关系备受关注，WT1基因是否在MDS中同样高表达，与MDS病情进展是否有明显相关性，可否作为MDS向急性白血病转变的一个重要检测指标，目前尚未定论，为此我们进行了相关研究,现报道如下。

对象和方法
1 研究对象选择48例初治MDS患者的外周血标本为MDS组，男27例，女21
例，中位年龄57.5岁，按照WHO诊断标准诊断[7]，其中RA /RAS 12例，RCMD 14例，RAEB1 6例，RAEB2 15例，MDS/MPD 1例。

按照国际预后评
分系统(IPSS)分组：低危组5例，中危Ⅰ组25例，中危Ⅱ组11例，高危组7例。

另选取4例继发于MDS的AML患者外周血标本为MDS-AL组，M1 1例，M2
2例，M5 1例，男女各2例，中位年龄43岁。

正常对照组:非恶性血液病患者和正常人共10例为正常组，男6例，女4例，中位年龄49.8岁。

2 实验方法
2.1 总RNA提取：将新鲜外周血标本用淋巴细胞分离液，分离出有核细胞，然后
加入RNA裂解液(Trizol)，其后先后加入氯仿、异丙醇提取总RNA。

2.2 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。

①内参及目的基因引物序列：β-actin，上游5‘-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游5‘-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，PCR产物540bp；Wt1:上游5‘-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3’，下游5‘-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3’，PCR产物481bp。

②逆转录(RT)反应。

分别取RNA 2 μl，Oligo(dt)primer 1 μl，DEPC H2O 9 μl共计12 μl,放于PCR
仪中，65℃ 5 min后分别加入5×Reaction buffer 4 μl，Ribolock Rnase Inhibitor(20 U/μl)1 μl，10 mmol/L dNTP Mix 2 μl，RevertAid M-MulV Reverse Transcriptase(200 U/ μl)1 μl共计20 μl，再分别42 ℃ 60 min，70 ℃
5 min得到反应产物(cDNA)，可直接进行PCR或者暂存于-80℃冰箱备用。

③PCR反应。

反应体系：20 μl由2×PCR Mix 10 μl，上下引物各1.0 μl，cDNA
2.0 μl，用RNase Free dH2O补充至总体积20 μl进行PCR扩增,每次试验均设
β-actin作为内对照，K562细胞株作为阳性对照。

扩增条件：β-actin:94 ℃、5 min,94 ℃、30 s , 55 ℃、30 s, 72 ℃、40 s, 30 循环; 72 ℃、7 min；WT1：
94 ℃、7 min，94 ℃、1 min, 64 ℃、1 min, 72 ℃、1 min，35循环，72 ℃、
6 min。

2.3 PCR产物分析：取产物于琼脂糖凝胶(2%)中电泳(100 V，30 min)，采用Tanon GIS2010数码图像处理系统观察结果，以同一标本的WT1/β-actin的灰度值比表示WT1的半定量。

3 统计学方法应用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计学分析，采用χ2检验，Fisher检验和Spearman’s相关进行统计。

P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1 正常组、MDS组、MDS-AL组WT1表达情况见表1。

WT1的阳性率及表达水平MDS-AL组均明显高于MDS组及正常组，MDS组也均明显高于正常组，三组之间两两相比差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 WT1mRNA在正常人、MDS、MDS-AL的表达情况组别nWT1阳性[例(%)]WT1表达水平(灰度值)正常组100(0.0)0.20±0.13MDS组
4813(27.1)*0.47±0.19﹡MDS-AL组44(100.0)*△1.37±0.29*△
注：与正常组比较，*P<0.05；与MDS组比较，△P<0.05
2 WT1mRNA表达情况与IPSS的关系见表2。

将48例MDS重新按照IPSS评分系统分组，WT1mRNA的表达水平在高危与中危及低危组之间有统计学差异(P<0.05)，中危与低危组之间没有统计学差异(P>0.05)。

中危Ⅰ组与中危Ⅱ组之间也没有统计学差异(P>0.05)。

WT1基因表达水平与IPSS评分值有相关性(图1)(r=0.74，P<0.05)。

表2 WT1mRNA在MDS的表达情况(灰度值)组别WT1表达水平低危组
0.31±0.19*中危组0.45±0.18*中危Ⅰ组0.40±0.17中危Ⅱ组0.55±0.15高危组0.68±0.12
注：与高危组比较,*P<0.05
图1 WT1mRNA与IPSS的相关性
3 WT1基因与原始细胞的关系 WT1基因的表达水平与MDS患者骨髓外周血原始细胞百分比之间有显著相关性(图2)(r=0.66,P<0.05)。

图2 WT1表达与MDS原始细胞百分比的关系
4 动态随访MDS患者WT1的表达情况动态随访2例RA患者WT1基因表达情况(1例从RA→RAEB2→AML-M2→CR→复发→2个月后死亡，另外1例患者由RCMD→RAEB1→AML-M2A→CR),可以看出WT1基因的表达随着病情的进展而升高，经过化疗完全缓解后，WT1水平再次下降至最初水平(图3)。

图3 2例MDS患者随病情进展WT1动态监测
讨论
WT1基因作为一种类癌基因能促进恶性造血细胞的增殖、抑制恶性造血细胞的分化，目前认为是急性白血病的一个独立预后指标[8-9]。

因其在白血病初治阶段及复发时明显高表达，治疗后表达水平下降，国内外已经将其作为监测白血病微小残留的标识[4,10]，并被部分移植中心作为是否移植及移植后复发的预测指标[11-13]。

而MDS作为一种高风险向急性白血病转变的疾病，该类疾病的WT1基因的表达水平如何，动态监测WT1基因的水平是否有助于对疾病的预判，目前尚未定论。

本研究通过对48例初治MDS患者及10例正常人的外周血标本中WT1基因进行RT-PCR监测，结果表明在MDS中WT1mRNA的阳性表达率(27.1%)明显高于正常对照组(0)，MDS-AL组的WT1mRNA阳性表达率(100%)明显高于正常对照组及MDS组，均有统计学意义(P<0.05)，表明WT1基因在MDS中明显高表达，与MDS密切相关，与已有文献一致[12,14]。

在白血病发病机制研究中发现：WT1基因可协调促进DNA基因高甲基化，促进血液系统的恶性分化[15-16]；同时目前已明确表观遗传学的改变在MDS的发生发展中起着重要的作用，尤其是抑癌基因的异常甲基化是MDS发生、发展的主要原因[17]，故WT1基因的高表达
表明着其可能在MDS中起着一个重要作用。

国际预后评分(IPSS)与MDS向白血病转换几率有明显的相关性[18]。

为了进一步
明确WT1基因是否可作为疾病进展的评估指标，对48例MDS患者重新按照IPSS评估，分为低危，中危Ⅰ组，中危Ⅱ组，高危组4组。

结果发现从低危到高危，WT1基因的阳性表达水平依次升高，且在高危组患者中明显高表达；高低危
组相比有明显的统计学差异，而中危Ⅰ与中危Ⅱ组之间没有明显统计学差异，中危组与正常人的WT1水平亦无明显统计学差异。

经相关性分析，提示WT1基因的
表达水平与IPSS评分有明显的相关性。

报道另外，对WT1水平和原始细胞比例进行了相关性分析，结果仍提示具有明显的相关性，考虑与WT1基因主要在恶性造血细胞中高表达，而在正常造血细胞中低表达或不表达有关，故随着MDS由低危向高危，乃至白血病的进展，其WT1基因表达水平亦随之升高，提示WT1基
因在MDS的恶性演进过程中起着重要作用。

动态随访2例RA患者WT1基因表达情况：1例RA患者(WT1mRNA阴性)，仅
给予对症治疗，2个月转变RAEB2(此时WT1mRNA阳性)，给予去甲基化治疗1
疗程，1个月后转为AML-M2(WT1表达水平较前升高)，4个疗程去甲基化治疗
后达完全缓解，WT1表达水平较RAEB2阶段下降但仍高于初发阶段；1月后复发，WT1表达水平再次升高且较AML-M2阶段高，此患者2月后死亡。

另1例为RCMD患者(WT1mRNA阴性)，支持对症，2个月后转为RAEB1(WT1mRNA阴性)，再次支持对症，2月后转为AML(WT1mRNA阳性)，去甲基化及小剂量CAG方案化疗1疗程后达完全缓解，此时WT1基因再次下降至最初水平。

故我
们认为WT1基因可以作为预测MDS病情进展及疗效评估的一个早期指标，与卢
丹等[19]的研究一致。

本次研究得出以下结论：①WT1基因在各类型MDS均出现高表达，且与疾病的
进展呈正相关，高危组的WT1表达明显高于低中危组。

②WT1基因表达水平与
MDS患者的原始细胞百分比密切相关，与IPSS评分有明显相关性，可作为临床上对MDS病情的评估、判断预后的重要指标之一。

③通过2例病人的动态随访，推测WT1基因可以作为预测MDS患者病情和疗效评估的重要指标。

但由于随访的病例数有限，仍需进一步验证。

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